染色质免疫沉淀法

null研究蛋白质与DNA 相互作用的方法研究蛋白质与DNA 相互作用的方法肖睿璟 xrj7619@yahoo.com.cnnullDNAnullRNAnull蛋白质null转录？蛋白质 ？？调控DNA ? 蛋白质与DNA相互关系？nullEMSAnullnull主要内容主要内容第一部分 背景知识 第二部分 凝胶电泳迁移率改变分析 第三部分 DNaseⅠ足迹法 第四部分 染色质免疫沉淀分析实验null第一部分 背景知识null蛋白质和核酸之间的相互作用，在生物遗传信息的传递与表达、生物功能的实现中发挥重要作用。 在基因的转录调控和DNA修饰等活动中，蛋白质与DNA的相互作用扮演了关键角色。背景知识null基因表达: DNA-RNA-蛋白质，是一个十分复杂而有序的过程。背景知识null 基因表达是众多的反式因子和顺式作用元件之间相互作用的结果。背景知识null基因表达的调控是细胞对外部或内部的刺激发生应答的方式，这涉及到基因组 DNA和一系列结合蛋白的相互作用。 不同生理条件下特异性的基因转录调控常常依赖于不同的反式作用因子与顺式作用元件的特异性结合。 null顺式作用元件：影响自身基因表达活性的非编码DNA序列。如启动子、增强子、沉默子等。null反式因子：能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白质。 TFⅡD等。null反式调节顺式调节null转录激活因子和增强子结合，通过作用于转录起始复合物中的某种蛋白质引起RNA聚合酶的构向改变或化学修饰，最终导致其活性增加，从而激活转录。 null 基因转录水平调控离不开反式因子（转录因子）与顺式作用元件的相互作用；基因表达调控的其他水平同样涉及。 蛋白质与DNA的相互作用扮演了关键角色。背景知识背景知识阐明真核基因表达机制的基本途径：研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用。背景知识背景知识研究蛋白质与DNA相互作用的方法： 1、凝胶电泳迁移率改变分析（EMSA） 2、DNaseⅠ足迹法（foot printing） 3、染色质免疫沉淀实验 （ChIP） nullnull染色质、染色体。 原核：裸露DNA；真核：脱氧核糖核酸(DNA)：组蛋白=1：1组成，另有RNA和非组蛋白。背景知识null染色体的基本结构单位：核小体，由DNA和组蛋白(histone)构成。背景知识null组蛋白核心主要是α螺旋null组蛋白密码 是一种新的调节机制，其信息存在于组蛋白的修饰等过程中：包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。背景知识null▲ silenced▲ active组蛋白修饰null组蛋白乙酰化、甲基化修饰能为相关调控蛋白提供其在组蛋白上的附着位点，从而改变染色质结构和活性。 组蛋白磷酸化修饰在细胞有丝分裂和凋亡过程中，能调控蛋白质复合体向染色质集结。组蛋白修饰null乙酰基加到组蛋白尾巴上，改造了核小体螺旋化结构，使DNA开始转录。 null组蛋白修饰组蛋白乙酰化能选择性地使某些染色质区域的结构从紧密型变为松散型，从而开放某些基因的转录，增强其表达水平。 null组蛋白修饰组蛋白甲基化修饰的结果则相对复杂，它可以是转录增强或转录抑制。 null背景知识表1 组蛋白修饰的类型背景知识背景知识研究蛋白质与DNA相互作用的方法： 1、凝胶电泳迁移率改变分析（EMSA） 2、DNaseⅠ足迹法（foot printing） 3、染色质免疫沉淀实验 （CHIP） null第二部分 凝胶电泳迁移率改变分析原 理原 理 凝胶电泳的电场作用下，小分子DNA片段比其结合了蛋白质的DNA片段向阳极移动的速度快。步 骤步 骤 标记短的双链DNA片段，将其与蛋白质混合，对混合物进行凝胶电泳，再放射性自显影，就可找到DNA结合蛋白 。null1、探针： 32P同位素：放射性、半衰期14天。 地高辛标记：灵敏度弱，信号不行。 生物素标记：配合化学发光技术， 广泛应用。 -20℃保存，立即使用，不超过1-2星期。注 意null2、蛋白样品： 材料：细胞—纯度高；组织—杂蛋白。 用专用核蛋白抽提试剂。 核蛋白的浓度：1μg/μl以上。 蛋白样品用量: 一般2-20μg。注 意应 用应 用最初用于研究DNA结合蛋白。 目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。应 用应 用 EMSA特异性好，是研究转录调控蛋白和相应核苷酸序列结合的常用方法，常用来鉴定其他方法筛选出的结果。EMSA结果举例EMSA结果举例DNA + no protein DNA + non-interacting protein DNA + interacting proteinnull第三部分 DNaseⅠ足迹法原 理原 理蛋白质结合在DNA片段上，保护结合部位不被DNase破坏，在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。这样，蛋白质在DNA片段上留下了“足迹”。null步 骤步 骤将待测双链DNA片段中一条单链的一 端选择性地进行末端标记。 加入恰当浓度的DNase Ⅰ进行酶切。 再经变性电泳分离和放射自显影。结 果结 果无蛋白结合的DNA： 相差一个核苷酸为梯度的DNA条带； 有蛋白结合的DNA样本： DNA梯度条带在相应于DNA结合蛋白的结合区域中断，形成一空白区域。null应 用应 用DNaseⅠ足迹法不仅能找到与特异性DNA结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位。DNA footprint assayDNA footprint assayDod not contain RNA pol holoenzymeDNA footprint assayDNA footprint assayIn the absence of RNA pol holoenzyme, a continuous range of sizes occursThus RNA pol holoenzyme binds to an 80-nucleotide regionNo bands in this range RNA pol holoenzyme is bound to this DNA region, and thus protects it from DNase I null第四部分 染色质免疫沉淀实验 ChIP简 史60年代 甲醛作为交联试剂 80年代 Solomon等 创ChIP技术 利用组蛋白抗体来研究HSP70基因 与转录的关系简 史原 理原 理研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。 它利用抗原抗体反应的特异性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。 原 理原 理生理状态下DNA与蛋白质交联。 超声或酶处理将染色质切为小片段，利用抗原抗体特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。 再对DNA进行鉴定检测。null操作步骤操作步骤null 即在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质-DNA复合物。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。第一步：固定null注意： 1、细胞状况好：75%-80%；106个/管。 2、甲醛终浓度为1%。 3、交联时间：5分钟-1个小时、 不过长不过短。第一步：固定第二步：染色质断裂第二步：染色质断裂 用化学（ 酶） 或者机械（ 超声波）的手段将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段。第二步：染色质断裂第二步：染色质断裂注意： 1、超声破碎冰上，时断时续超声程序。 2、探头要尽量深入管中，不触管底或侧壁。 3、总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。 4、超声处理液: 蛋白酶抑制剂、浑浊—透明。 5、预实验摸索条件：10次/秒、3-4次。第二步：染色质断裂第二步：染色质断裂图 用琼脂糖电泳检测超声打断染色质的有效性 M：DNA marker；1：超声打断后的DNA。null 利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合体，然后沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA 片段。第三步：免疫沉淀null注意： 1、Input对照： 断裂后的基因组DNA。 可以验证染色质断裂的效果。 可以算出ChIP的效率。第三步：免疫沉淀null第三步：免疫沉淀图 染色质免疫沉淀DNA对特定基因扩增结果电泳图 1、对β-Actin的产物；2、对PAI-1的产物null注意： 2、抗体选择： 选择的目的蛋白的抗体是ChIP实验成功的关键。第三步：免疫沉淀null注意： 3、阳性与阴性对照： 阳性抗体：组蛋白抗体或RNA Polymerase II 抗体等。 阴性抗体：目的蛋白抗体宿主的IgG或血清。 ChIP结果与阳性和阴性结果比较，正确结论。第三步：免疫沉淀null第三步：免疫沉淀图 染色质免疫沉淀的PCR分析 3、4：加入p53抗体。2、5：加入鼠血清做对照。M123456p53 antibodyhsp90p21InputInput__++bp200016001000750500250100null 用不含DNase的RNase和Proteinase K，65oC保温6小时或过夜逆转交联。第四步：逆交联null 经DNA纯化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化DNA。第五步：DNA纯化null 最常用的DNA的鉴定方法是半定量PCR和Real-time PCR。第六步：DNA鉴定null注意： 1、目的蛋白的靶序列已知或高度怀疑某个基因序列，用定性或定量PCR。 2、目的蛋白的靶序列未知或研究目的蛋白在基因组上的结合情况，用ChIP-on-CHIP技术。第六步：DNA鉴定nullnull1,000,000 promoters/ 100 ul 100% Input溶液1No Ab 10 ul Input + 90 ul Buffer 100,000 promoters 10% Input + Ab IP’ed, washed,elutedReverse crosslinks QIAquick purify Elute in 50 ul Elute Buffer1,000,000 promoters /100 ul 100% Input100,000 promoters/50 ul = 2,000 promoters /ulPositive Ab ChIP sample ? promoters/ulPCR (positive control)1 ul 2,000 promoters1 ul 1:10 200 promoters1 ul 1:50 40 promoters1 ul1 ul = 200 promoters 2% Aim for 2,000-20,000 (0.2%-2%) Efficiency of ChIP溶液2溶液3nullnull图a ChIP实验后PCR检测PEG10基因结果举 例null图b：ChIP解交联溶液做western-blot图 仅在经DHT刺激，且在ChIP实验过程中加入AR抗体的实验组显出条带，意味该组解交联后液体中含有AR。DHT举 例null ChIP为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用，全面阐明真核基因的表达调控机制提供了强有力的研究工具。 主要应用null1、组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记” ---细胞对外在刺激作出的每一个反应几乎都会涉及到染色质活性的改变，这一改变就是通过修饰组蛋白，变换组蛋白密码实现。 ---几乎每一种生物学过程都有特定的组蛋白修饰标记，那么特定的组蛋白修饰标记就能反应相应的特定生物学过程。主要应用null 通过组蛋白修饰系列抗体特异性地识别靶蛋白修饰形式，就能简化对组蛋白修饰的研究。null2、转录调控分析： 染色质DNA的转录活性与组蛋 白修饰相伴。 基因表达：众多的反式因子和 顺式作用元件之间相互作用的结果。 主要应用nullnullnull3、药物开发研究： 多种组蛋白修饰酶已成为相关 疾病治疗的靶目标。 如组蛋白去乙酰酶（HDACs） 抑制剂已应用于临床治疗多种肿瘤。主要应用null4、有丝分裂研究： 与组蛋白修饰相关：特异性组蛋白 修饰可在有丝分裂的不同阶段检测到， 在细胞核分裂中发挥多种功能。主要应用null5、 DNA损失与凋亡分析 ： ---在凋亡的级联反应中，激酶（包括CHK1和CHK2）主要底物之一是组蛋白衍生物H2A.X，H2A.X的磷酸化是凋亡早期最早标志之一。 ---在凋亡后期，Caspase激活蛋白激酶Mst1使组蛋白H2B的14位丝氨酸磷酸化。这一修饰在染色质浓缩步骤中可检测到，是凋亡途径良好的标记物。主要应用扩展应用扩展应用1、ChIP-on-CHIP法： ChIP 与基因芯片相结合所建立的方法，已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选。nullChIP ON Chip扩展应用扩展应用2、ChIP 与体内足迹法结合法： 用于寻找反式因子的体内结合位点。扩展应用扩展应用3、ChIP re ChIP： 用于分析两种蛋白共同结合的DNA序列。在第一次ChIP的基础上不解交联，而继续进行另一个目的蛋白的免疫沉淀，从而得到与两种目的蛋白都结合的DNA序列。扩展应用扩展应用4、RNA-ChIP： 用于研究RNA在基因表达调控中的作用。原理与DNA类似，不同的是，交联逆转只用Proteinase K，进行RNA纯化和不含RNase的DNase处理，分析时用RT-PCR，芯片杂交用cDNA芯片等。扩展应用扩展应用5、ChIP sequence：ChIP特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。 比 较比 较EMSA ： 体外分析 DNaseⅠ足迹法： 体外分析 ChIP： 体内分析思 考思 考1、研究蛋白质与DNA相互作用的方 法有哪些？简述各自原理并进行简 单比较。 2、简述ChIP的实验步骤及应用。null