肺炎嗜衣原体主要外膜蛋白的克隆表达与抗原性研究

收稿日期: 2007�09�10; 修回日期: 2007�10�22 通讯作者:端青,电话: 010�66948560 E - m ai:l duanq@ n ic. bm .i an. cn 作者简介: 李岩伟 ( 1982- ) , 男, 硕士研究生, 主要从事细菌检验 研究。 肺炎嗜衣原体主要外膜蛋白的克隆表达与抗原性研究 李岩伟,宋立华,左庭婷,何 君,朱 虹, 端 青 (军事医学科学院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全国家重点实验室,北京 � 100071) 摘 � 要: 肺炎嗜衣原体主要外膜蛋白是其特征抗原之一。实验中通过 PCR方法从肺炎嗜衣原体基因组中扩增主要 外膜蛋白基因,插入 pET32a( + )表达载体, 转化 BL21( DE3)感受态细胞, 得到表达 56kD融合蛋白的工程菌株。该 菌株的表达量可达 53% , 提纯后的主要外膜蛋白纯度可达 90%以上, 在W estern B lo tting试验和胶体金免疫层析试 验中显示了良好的抗原性。 关键词: 肺炎嗜衣原体;主要外膜蛋白;抗原性 中图分类号: R374 文献标识码: A 文章编号: 1005�5673( 2008) 01� 0032� 04 C lon ing and expression of gene encoding chlamydoph ila pneumon iaem ajor ou ter m em brane protein and the an ti� gen ic ity analysis of the prote in� LI Yan�w ei, SONG L i�hua, ZUO T ing�ting , et al. ( S tate key laboratory of pathogen and b iosecurity, Institute of M icrobiology and Epedem iology, A cad em y of M ilitary M ed ical S cience, B eij ing 100071, China) Abstrac t: M ajor outer m em brane prote in ( MOMP) is one o f chlamydoph ila pneumoniae( Cpn) charac teristic antigens . MOMP gene w as am plified from com plete genom e by PCR and was inserted to expressed p lasm id pET32a( + ). And then, the recom b inant plasm id w as transferred into BL21( DE3) to construct a eng ineered bacter ia of expressing a 56 kD fusion prote in. The express ion level ofMOM P is as h igh as 53% o f tota l pro te in in the eng ineered bacte ria. A fte r purification, the MOMP is pur ified ove r 90% and show ed a be tter antigen ic ity inW estern B lotting and collo ida l go ld immunochroma tog ra� phy. K ey words: Chlamydophila pneumoniae; M ajo r outer m embrane pro te in; Prote in; Antig en ic ity � � 肺炎嗜衣原体 ( Chlamydophila pneumoniae, Cpn)是严格的细胞内寄生菌,是咽炎、窦炎、支气管 炎和世界范围内 10% ~ 15%社区获得性肺炎的病 原菌。近年来研究表明 Cpn与动脉硬化症等心血 管疾病有关 �1 。 Cpn主要外膜蛋白 ( M ajor outer membrane protein, MOMP)是其主要的表面抗原,大 小约为 40kD, 能刺激机体产生细胞免疫和体液免 疫。实验中通过基因工程的方法构建 Cpn�MOMP 工程菌株, 并检测重组表达的 Cpn�MOMP ( rCpn� MOMP)的抗原性,为 Cpn感染的诊断奠定了基础。 材料与方法 1 材料 1. 1� 菌株 Cpn菌株 VR1360,购自美国 ATCC。 1. 2� 载体和感受态细胞 克隆载体 pMD18T, 购自 TaKaR a; 原核表达载 体 pET�32a( + )由军事医学科学院五所一室保存; 感受态细胞 BL21( DE3), 购自 T IANGEN。 1. 3� PCR引物的设计与合成 Cpn�MOMP基因引物根据 G enB ank AF131889 和文献报道�2 的序列设计, 扩增除前导肽序列以外 的全长基因,由上海生工合成。 1. 4� 主要试剂和工具酶 基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、增强型 HRP�DAB底物显色试剂盒, 购自 T IANGEN; 凝胶 DNA纯化试剂盒、Taq DNA 聚合酶、T4 DNA连接 酶、限制性内切酶 N co!和 Sal!,购自 TaK aRa。 1. 5 抗体 兔抗鹦鹉热嗜衣原体 ( Chlamydophila psittaci, Cps)重组 MOMP( rCps�MOMP) �3 抗体, HRP标记的 羊抗兔 IgG,由军事医学科学院五所病原微生物生 物安全国家重点实验室制备。 2 方法 2. 1� rCpn�MOMP基因的 PCR扩增 按照基因组提取试剂盒的操作步骤,从 Cpn中 提取基因组 DNA作为基因扩增的模板, 设计并合成 PCR扩增上游引物 5∀�CATGCCATGGCTTTGCCTG� 32 微生物学免疫学进展 2008年第 36卷第 1期 � � P rog in M icrobio l Imm uno l Nov. 2008, Vo.l 36 No. 1 TAGGGAAC�3∀( N co!酶切位点 )和下游引物 5∀� GCTGTCTACTTAGAATCTGAACTGACC�3∀( Sal!酶 切位点 )。在 50� lPCR的反应体系中含有 Taq DNA 聚合酶 0. 5� ,l 10 # buffer 5� ,l 2. 5mmo l/L的 dNTP 4� ,l上游引物、下游引物各 2� ,l基因组模板 5� ,l 25mmol /L M gC l2 2� ,l纯水 29. 5�l。PCR反应条件: 94∃ 预变性 5m in; 94∃ 变性 30s、50∃ 退火 30s、72∃ 延伸 80s, 30个循环; 72∃ 延伸 10m in。 2. 2� rCpn�MOMP工程菌株的构建 PCR扩增产物经过凝胶回收后, 与 pMD18T构 建克隆质粒,转化后蓝白斑筛选阳性克隆株。阳性 克隆株扩大培养后提取克隆质粒 pMD18T�Cpn� MOMP,用 N co!和 Sa l!进行双酶切, 凝胶纯化的 Cpn�MOMP基因片段与经同样双酶切的 pET32a ( + )片段用 T4 DNA连接酶连接, 并转化 BL21 ( DE3)感受态细胞。于 LB培养基平板 (含氨苄青 霉素 100�g /m l)挑取阳性菌落扩大培养,以培养物 作为模板进行 PCR扩增 (反应体系和条件同前 ),对 扩增阳性培养物提取质粒 pET32a( + ) �Cpn�MOMP 进行 Nco!和 Sal!双酶切鉴定,将 PCR筛选和双酶 切鉴定均为阳性的质粒送上海生工测序。 2. 3� rCpn�MOMP的诱导表达及纯化 取鉴定阳性的菌株扩大培养,以 50m l过夜培养 的菌液接种于 1000m lLB培养基, 37∃ 摇床 200r/ m in培养, 菌液 A600约为 0. 8时加入终浓度为 1mmol /L IPTG诱导剂, 28∃ 诱导培养 4. 5h。菌液 8000r/m in离心 15m in收集菌体, 经 60m l缓冲液 ( 0. 02mo l/L T ris�HC ,l pH 8. 0)充分悬浮后,超声波 破碎菌体。超声后的菌液通过梯度离心获得纯化的 包涵体。用 8mo l/L尿素溶解包涵体, 离心收集上 清,即为变性的 rCpn�MOMP。变性的 rCpn�MOMP 经尿素梯度浓度透析后复性。 2. 4� rCpn�MOMP的抗原性检测 将 rCpn�MOMP经 12% 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS�PAGE )后电转移到硝酸纤维素膜上进行 W estern b lotting试验, 一抗为兔抗 rCps�MOMP抗 体,工作浓度为 1%1 000; 二抗为 HRP标记的羊抗兔 IgG, 工作浓度为 1%2 000。最后在 DAB中显色。 2. 5� rCpn�MOMP的胶体金免疫层析试验 将纯化的 rCpn�MOMP包被在硝酸纤维素膜上 用于捕捉,用免疫胶体金探针检测,待检抗体为兔抗 rCps�MOMP抗体。 结 � 果 1 PCR扩增 Cpn�MOMP基因 图 1为 Cpn�MOMP扩增基因 1%琼脂糖凝胶电 泳结果。从图 1 可以看出, 扩增基因大小为 1 122bp, 与预期结果一致。 图 1� rCpn�MOMP基因 PCR扩增 F ig. 1� PCR amp lification of rCpn�MOMP gene M: DL2000; 1: The negative contro;l 2: Cpn�MOMP gene 2� pET32a( + ) �Cpn�MOMP序列分析 将 rCpn�MOMP工程菌株的质粒送上海生工测 序, 其测序结果如图 2。 � � 此序列全长 1 738bp,其中 64~ 1 644bp为开放 读码框, 编码含有 527个氨基酸、大小为 56. 67kD的 融合蛋白。此序列经 NCB IBLAST与 Cpn�MOMP序 列比对,其一致率 99% ,其中第 873位碱基突变, 突 变的碱基所在的密码子由 TTT变为 TTC, 仍编码 phe,开放读码框正确,保证了 rCpn�MOMP一级序列 的准确性。 3� rCpn�MOMP的表达和纯化 图 3为 rCpn�MOMP诱导表达和纯化的 SDS� PAGE结果,由于融合有硫氧还蛋白, rCpn�MOMP融 合蛋白分子量约为 56kD。经过灰度扫描分析,重组 蛋白的表达量能达到全菌蛋白的 53%, 重组蛋白经 纯化后纯度能达到 90% 以上。测试表明, 每升 LB 培养基可获得纯蛋白 190mg。 4� rCpn�MOMP抗原性分析 图 4为纯化后 rCpn�MOMP的 W estern blotting 试验。图 4显示 rCpn�MOMP与兔抗 rCps�MOMP抗 体在 56kD出现沉淀线,说明 rCpn�MOMP具有良好 的抗原性。 5 胶体金免疫层析试验结果 用 rCpn�MOMP作为抗原包被硝酸纤维素膜,兔 抗 rCps�MOMP抗体 5m in后可出现肉眼可见的两条 沉淀线 (检测带和质控带 ) ,生理盐水仅出现质控带。 33微生物学免疫学进展 2008年第 36卷第 1期 � � P rog inM icrob io l Immuno lNov. 2008, Vo .l 36 No. 1 34 微生物学免疫学进展 2008年第 36卷第 1期 � � P rog in M icrobio l Imm uno l Nov. 2008, Vo.l 36 No. 1 讨 � 论 Cpn培养条件苛刻,并且费时较长,临床 Cpn感 染诊断常用血清学方法,但大量获得 Cpn抗原很困 难并且不经济,因此希望通过基因工程的方法获得 Cpn特异性抗原。研究表明 Cpn�MOMP是 Cpn的 主要抗原,已在枯草芽胞杆菌和大肠杆菌中成功表 达,并在动物感染模型和冠心病患者血清学试验中 得到较好的应用 �4, 5 。实验中成功构建了 Cpn� MOMP工程菌株, rCpn�MOMP表达量可达菌体蛋白 的 53%,经过提纯, 纯度可达 90%以上。在W estern blotting试验和胶体金免疫层析试验中 rCpn�MOMP 可以与兔抗 rCps�MOMP抗体反应,显示了良好的抗 原性。 Cpn�MOMP基因与沙眼衣原体 MOMP和 Cps� MOMP基因分别有 64% 和 71%同源性, 有研究表 明, Cpn�MOMP 与 Cpn种特异性单抗在 W estern blotting中有微弱反应,但与衣原体属特异性 MOMP 单抗有强烈反应,推测 Cpn种特异性抗原表位和属 特异性表位均位于 Cpn�MOMP上,并且后者抗原性 强于前者 �6 。用制备的兔抗 rCps�MOMP抗体对纯 化的 rCpn�MOMP抗原进行了检测, 结果证明 rCpn� MOMP存在属特异性抗原表位, 显示出较强的抗原 性。 参考文献: �1 � Byrn e GI, KalayogluMV. Ch lam yd ia pneum oniae and ather oscler osis: link s to th e d isease process� J . Am H eart J 1999, 138: 488� 490. �2 � M elgosa MP, Kuo CC, Cam pbell LA. Sequen ce analys is of the m ajor outer m emb rane protein gene of chlamyd ia pneum on ia e� J . In fection and Imm un ity 1991, 59 ( 6 ): 2195�2199. �3 � 刘向伟,端 青,张浩杰, 等. 鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白基因 序列的扩增、克隆和原核表达 � J . 微生物学免疫学进展 2002, 30( 2) : 32�34. �4 � K ido Y, Sh iraiM, Ou ch iK. Analys is of the serological response to Ch lam yd ia pneum on iae in patients w ith ischem ic heart d isease by recomb inan tMOMP�ELISA� J . J In fect Chem oth er 2001, 7: 180– 185. �5 � A iraks inen U, Pentt il T, W ah lstr m E, et a.l Product ion of C hlam yd ia pneum on iae P rote ins in Bacillus subt ilis and Th eir U se in Ch aracterizing Imm une Responses in th e Experim ental In fection M odel� J . C lin ical and D iagnost ic Laboratory Imm unology 2003, 10( 3 ): 367�365. �6 � W olf K, Fish er E, M ead D, et a.l C h lam yd ia pneum on iae m ajor ou ter m em bran e protein is a surface�exposed an tigen th at elicits an� t ibod ies p rim arily d irected aga inst conformat ion�dep end ent determ i� nan ts� J . In fect ion and Imm un ity 2001, 69( 5) : 3082�3091. 35微生物学免疫学进展 2008年第 36卷第 1期 � � P rog inM icrob io l Immuno lNov. 2008, Vo .l 36 No. 1