力竭性运动对大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞BKltCagt通道生物物理特性影响的初步研究

内蒙古大学 硕士学位论文 力竭性运动对大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞BK<,Ca>通道生物物 理特性影响的初步研究 姓名：张伟 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：哈斯阿古拉;赵虎成 20090610 力竭性运动对大鼠胸主动脉血管平滑肌 细胞BKc。通道生物物理特性影响的初步研究 摘要 在血管平滑肌上已发现4种钾通道：①大电导钙激活性钾通道 (B＆盎)；②电压依赖性钾通道(Kv)；③内向整流钾通道(Kir)；④ATP敏 感性钾通道(KAllP)。在这些类型的钾离子通道中，大电导钙激活钾离 子通道(1arge．conductancecalcium-activatedpotassiumchannels，BKca) 在平滑肌上广泛达，在调节膜电位及血管平滑肌张力方面具有重要 作用。已经证实其非正常的表达及功能紊乱与心血管疾病的发生有着 密切的关系。本研究建立力竭性动物模型，在诱导血压变化后，应用 膜片钳技术分析B配通道生物物理特性的变化规律。 实验选用Sprague．Dawley(SD)雌性幼年大鼠，力竭性训练采用游 泳的方式。具体方法是：力竭性训练组每天游泳2次，每次90min， 两次训练之间间隔至少4hr。一周训练7天，共持续4周。在训练前 进行8天进行预游泳训练，第一天游泳时间为lO分钟，之后每天增 加lO分钟，每天训练两次，直到8天后，游泳时间达到90分钟后进 行正式游泳训练。采用酶消化法为膜片钳实验提供大量SD大鼠原代 胸主动脉平滑肌细胞。应用单通道内膜向外模式记录K+离子通 道电流，并分析其特性变化。 实验结果如下： l、力竭性运动l周后，BKca通道开放频率没有变化；力竭性运 动2周后，BK。通道开放频率发生增加；力竭性运动3周和4周后， B比通道开放频率明显增加。 2、力竭性运动后，B＆。通道的单通道电导没有发生显著变化。 以上结果证明在高血压形成前期，动脉血管平滑肌细胞B陆通 道的生物物理特性发生了变化，主要表现为通道开放的频率增加。研 究证实Bk通道生物物理特性在高血压形成前期发生变化。 关键词：BKca通道，开放频率，单通道电导，力竭性运动，膜片钳 II Effectofexercisetrainingonthebiophysicalproperty ofBKcachannelofsmoothmusclecellinratthoracicaortic ABSTRACT Therearefourtypesofpotassiumchannelsinvascularsmooth musclecells(VSMC)，includingBI％a，Kv，Kir，KATP．Large-conductance calcium—activatedpotassiumchannels(BKca)arewidelyexpressedin VSMC，Whichhavetheimportantfunctionsinregulationofmembrane potentialandvascularsmoothmuscletone．Andmoreevidenceproved thatabnormalexpressionanddysfunctionofBKcachannelsareclosely relatedtothecardiovasculardiseases。Thepurposeofthepresentstudy wastoinvestigatethebiophysicalpropertyofB配channelofVSMC fromexercisedratsbyusingpatchclamptechnique． FemaleinfancySprague-Dawley(SD)ratswereselectedas experimentalanimals．Swimmingwastakenasexhaustivetraining method．GroupsofexhaustivetrainingRatweremadetoswiminwater tankstwicedailyfor90minutes7daysaweekfor4weeks．Beforethe swimmingexercise，theratpracticedswimmingfor8days．Thefirstday ofswimmingpracticeconsistedoftwo10一minutesessionsseparatedbyat tll least4hours．Sessionswerethenincreasedby10minuteseachdayuntil theyreachedthe90-minutetarget．Usingenzymaticisolationmethod，we getanumberofprimarythoracicaorticsmoothmusclecellsofSDrats forpatchclamptechnique．Channelactivitywasstudiedbyusingthe patchclamptechniquesininside—outrecording． Theresultsarefollowing： 1．ThereisnochangeinopenprobabilityofBKcachannelafteroneweek exercisetraining．However,theresultsshowthattheopenprobability increasedafter2weeksandobviouslyincreasedafter3,4weeksexercise training． 2．Exercisetrainingdonotchangethesingle-channelconductanceofthe BKcachannel． TheseresultssuggestthatthebiophysicalpropertyofBKcachannel invascularsmoothmusclehavebeenchangedbyexercisetraingingand suggestingthatthebiophysicalpropertyofBI≮achannelhadgreat changesatpre—hypertension． KEYWORDS：BKcachannels，openprobability,single—channel conductance，exercisetraining，Patch—clamp IV 力竭性运动对大鼠胸主动脉平滑肌细胞BKca通道生物物理特性变化的初步研究 B配 BSA BW DMEM DMSO DTT EGTA hr HW mln PBS STREX SW．T SHR SToCs VDCC VSMC 主要英文缩写 large·-conductancecalcium--activatedpotassiumchannels 大电导钙激活钾离子通道 bovineserumalbumin 牛血清白蛋白 bodyweight 体重 dulbecco·Smodifiedeagle’smedium一种动物细胞培养基 dimethylsulphoxide 二甲基亚砜 dithiothreitol 二硫苏糖醇 ethyleneglycolbis(2·aminoethylether)tetraaceticacid 乙二醇xX(2．氨基乙醚1四乙酸 hour heartweight minute phosphatebuffer stessaxisregulatedexon tranidswitamers spontaneouslyhypertensiverats spontaneoustransientoutwardcurrents voltagedependentedcalciumchannel vascularsmoothmilsdecell 小时 心脏重量 分钟 磷酸缓冲液 力敏感有关序列外显子 游泳训练组 自发性高血压大鼠 瞬时外向钾电流 电压依赖性Ca2+通道 主动脉平滑肌细胞 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除本文已经 注明引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得囱筮直太堂及其 他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 日 期： 指导教师繇堕蚴拉 日 期：碑笸[ 在学期间研究成果使用承诺书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：内蒙古大学有权将学位论文的全 部内容或部分保留并向国家有关机构、部门送交学位论文的复印件和磁盘，允许编入有关数据库进行检索， 也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文。为保护学院和导师的知识产权，作者在学期 间取得的研究成果属于内蒙古大学。作者今后使用涉及在学期问主要研究内容或研究成果，须征得内蒙古 大学就读期间导师的同意：若用于发表论文，舨权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发表。 学位论文作者签名：丝指导教师签名：必匝滋 日 期：a壁3：‘：皇 日 期： 怨 力竭性运动对大鼠胸主动脉平滑肌细胞B比通道生物物理特性变化的初步研究 引言 离子通道(ionchannel)是细胞膜上一类特殊的亲水性蛋白质微孔道，是神 经、肌肉细胞电活动的物质基础。细胞通过离子通道调节相应物质进出的数量和 速度来达到感受和传递细胞内外的信号的目的，从而实现突触传递、细胞兴奋、 血管平滑肌和心肌的舒缩活动等功能【l】。离子通道参与细胞兴奋性的调节，控制 着细胞的基本生命活动，对维持机体的正常生理功能至关重要。随着分子生物学、 膜片钳技术的发展，人们对离子通道的分子结构及特性有了更加深入的认识，并 发现离子通道与许多疾病的发生和发展有关12】。近年来伴随着“膜学说"的发展， 钾离子通道受到越来越多的关注和研究，应用膜片钳技术对血管平滑肌上的钾通 道进行了不少研究。迄今为止在血管平滑肌上已发现四种不同类型的钾离子通道 【3】：①电压依赖性钾通道(KV)；②大电导钙激活性钾通道(Blc：ca)；③内向整流性 钾通道(KIR)；④ATP敏感K+通道(KATP)。在各种钾离子通道中，BKc。在平滑 肌上表达密度最高，生理作用为通过控制细胞膜电位，负反馈调节膜的去极化水 平，降低缩血管物质的缩血管作用，在平滑肌细胞膜电位的维持和肌紧张的调节 中起着重要的作用。 BKca(voltage·dependentlarge—conductanceCa2+-activatedK+channel)，即大 电导、Ca2+激活的K+通道，是一种力敏感性的离子通道，广泛表达于多种兴奋性 和非兴奋性细胞中，并参与许多生理过程。BKc。通道由两个不同的亚基组成：构 成孔道的a亚基和具有调节性的D亚基【4'5】。a亚基可单独聚合为四聚体，形成功能 性离子通道。它包括N末端的7个跨膜片段(SO～S6)、S5与S6片段之间的1个孔 区和胞内C末端的4个疏水片段(S7～S10)。其中跨膜片段SO与p亚基结合，p亚 基具有调节0【亚基的功能。S4片段决定着通道的电压敏感性，是B＆。通道的实际 触发点16,7]。S5和S6以及它们之间的P环共同构成K+选择性滤器(selectivefilter) 【引。S7～S9被认为是10电导的调控域，所以常被称为RCK(regulatorofconductance forK+)功能区f91。S9～S10之间存在一段带有负电的氨基酸序列，被称为钙碗 (calciumbowl)【101，这是一段高度保守性的序列，决定着通道的钙离子依赖性。 B№通道在血管的肌源性调节中起着重要的作用，血管平滑肌细胞中存在着血管 力竭性运动对大鼠胸主动脉平滑肌细胞B地通道生物物理特性变化的初步研究 紧张性变化的负反馈系统【Il-15]：细胞膜的去极化导致细胞内钙浓度升高，血管紧 张性增强；而钙浓度的升高又激活TB磁：a通道，Bl≮。通道的激活产生瞬时外向 钾电流(spontaneoustransientoutwardcurrents，STOCs)而使膜超极化，减少Ca2+ 内流，细胞内钙浓度下降，血管平滑肌舒张，从而对抗了压力和血管收缩因子导 致的血管收缩【16,17]。 心血管病包括高血压、动脉粥样硬化、心肌梗塞等，这些疾病都有共同的发 病基础和基本的病理过程，表现为心血管细胞分化、迁移、肥大、增殖和凋亡等， 具有细胞表型、形态结构与功能的改变，即发生血管重建(remodeling)。其中高 血压是最常见的慢性病，其病因复杂、并发症多。2005年，美国高血压学会(ASH) 提出了高血压新定义，认为高血压是一个有许多病因引起的处于不断进展状态的 心血管综合症，可导致心脏和血管功能与结构的改变。新定义明确指出，不能仅 靠血压读数诊断高血压，只有将血压读数与危险因素、疾病早期标记物和靶器官 损伤有机地结合在一起，才能更准确地表述高血压所引起的心血管系统和其他器 官的病理异常。现代高血压的诊断一方面需要检测基本的血压参数，另一方面更 要评估高血压患者的血管结构与功能。血管平滑肌细胞(vascularsmoothmuscle cell，VSMC)是血管壁的主要细胞成分，它的分化(differentiation)和迁移 (migration)行为是血管重建的主要特征之一，在血管的生理病理活动中扮演极 为重要的角色。随着血管平滑肌细胞分离技术、膜片钳技术及基因克隆方法的发 展，原发性高血压血管平滑肌钾通道的研究取得了很大的进步。有研究称，原发 性高血压血管平滑肌细胞膜上‰电流增强【18‘2¨，其机制可能是：首先，原发性 高血压血管平滑肌Kc。表达增多【18】；其次，高血压血管平滑肌配的开放频率增 加【19加】。以上研究证实阮功能活动改变是造成高血压的原因。高血压的发生机 制十分复杂，但是其基本病理生理机制是血管张力的增加，B配通道及其13亚 基在血管张力的调节中起到重要作用，他们功能及表达量的变化可能是原发性高 血压发生发展的分子机制之一。越来越多研究表明，Bl(Ca通道在血管舒张过程 中起关键作用【22】。 近些年，以离子通道为作用位点的抗高血压药物靶标以及抗高血压基因治疗 靶标的研究有了较大的进展。长期的力竭性运动能够导致血压升高，严重者导致 心肌肥大12”，而长时间进行力竭训练的运动员由于反复多次缺血可以导致心脏变 力竭性运动对大鼠胸主动脉平滑肌细胞BKcI通道生物物理特性变化的初步研究 得僵硬和产生缺血性痉挛(ischemcio．cniarcture)，甚至发展成为严重的不可逆转性 超挛缩状态，即“石-I二,(Stnoeheart)”。这是因为心血管细胞的分化和迁移行为受 生物、化学和物理等多种体内外因素的影响，其中力学因素尤为重要。在心血管 系统中存在着复杂的力学作用，主要包括血液流动作用于血管壁的切应力(shear stress)、压力(normalstress)和周向张力(circumferentialstretch)，研究血管细 胞的分化和迁移行为，探讨力学因素诱导血管细胞分化和迁移的力学生物学机制 是生物力学“应力一生长”研究的重要内容。阐明力学因素如何诱导血管细胞的 分化和迁移，深入了解血管活动和疾病发生的本质，对心血管疾病的防治具有十 分重要的理论和实际意义。目前国内外有关BKc。通道与高血压管的研究多数集中 于研究原发性的高血压BI≮。通道生物物理特性，本文首次利用力竭性动物模型诱 导血压变化来研究血压升高与BK乏。通道生物物理特性的关系，采用McMullenJR 等建立的力竭性运动模型，利用膜片钳技术研究大鼠力竭运动不同时期的胸主动 脉血管平滑肌细胞BKc．通道的生物物理特性，着眼于力学环境对血管系统的作 用，寻找力学因素对心血管作用的药物靶标；同时，对诱导高血压发生的不同时 期BKc。通道的研究，也为高血压发病的前期诊断提供依据，为从生物医学工程的 角度，寻求防治心血管疾病的新途径奠定力学生物学基础。 4 力竭性运动对大鼠胸主动脉平滑肌细胞BKc，通道生物物理特性变化的初步研究 1材料与方法 1．1材料 1．1．1实验动物 幼年SD(Sprague．Dawley)雌性大鼠，购自北京大学医学部实验动物中心， 体重在1009左右。 1．1．2试剂 无钙PSS液、含钙PSS液、PBS、膜片钳记录用电极液、浴液、DMEM低糖 培养基、胰蛋白酶(0．25％)购于Hyclone公司。胶原酶Ⅳ、木瓜蛋白酶、胎牛血 清、二硫苏糖醇(DTT)购于si舯a公司。 主要试剂配制： 1、 PBS 89／LNaCl 0．29／LKCI 3．62∥LNa2HP04·12H20 0．249／LKH2P04 调节pH值至7．4，高压灭菌，置于室温备用。 2、无钙PSS液 7．6059／LNaCl 0．3739／LKCl 0．2459／LMgCl2 3．83∥LHEPES 1．989／LGlucose NaOH调节pH值至7．2，现用现配。 3、含钙PSS液 7．6059／LNaCl 0．3739／LKCl 0．2459／LMgCl2 3．839／LHEPES 5 力竭性运动对火鼠胸主动脉3F滑肌细胞Bl(cI通道生物物理特性变化的初步研究 1．98∥LGlucose 0．1679／LCaCl2 NaOH调节pH值至7．2，现用现配。 4、消化液 0．19木瓜蛋白酶 0．01549DTT 溶于100ml无钙PSS液中，现用现配。 5、电极内液(mmol／L)KCl145HEPES10EGTAl 10．8099／LKCl 0．38∥LEGTA 2．38∥LHEPES 实验前用针头式滤器(孔径0．2urn)过滤。 6、记录浴液(mmol／L)：KCl145HEPES10 cE+浓度分别为lum、3urn、10um。 1．1．3实验仪器 膜片钳放大器Axopatch200B，USA 精密三维微操纵仪(MP．258)，USA 程控玻璃微电极拉制仪(05．E)，武汉东山新技术应用研究所 玻璃微电极抛光仪(2002．C)，武汉东山新技术应用研究所 奥林巴斯倒置相差显微镜，Olympus，Japan 恒温水浴锅(WC／09--05)重庆实验仪器厂 1．2方法 1．2．1力竭性大鼠动物模型的建立 采用MeMullenJR等【24】建立的长期力竭性游泳训练诱导形成高血压大鼠的 方法。sD大鼠购回后在本实验室动物室(室温18--．,26。C，相对湿度45％---65％，自 然光照)内适应性饲养3d后，随机分成2组：①对N组(c)8R，常规饲养，不加干 预。分成4组作为游泳训练1、2、3、4周的对照组，分别记做C．1、C．2、C．3、 c．4；②力竭运动组12只，采用游泳训练，分成4组，分别训练1、2、3、4N。记 做SW．T1、SW．T2、SW．T3、SW．T4。 力竭运动组训练方式为：买回动物经过3天的适应性饲养后，开始在水箱(65 6 力竭性运动对大鼠胸主动脉平滑肌细胞Bl(c。通道生物物理特性变化的初步研究 ×50×65)中游泳，水温控制在30+3℃。在游泳训练前进行8天预游泳训练，第 一天游泳时间为10min，之后每天增7蛔10min，每天训练两次。直N8天后，游泳 时间达N90min。预游泳训练完后，每次游泳时间为90min，一天训练2次，持续4 周。每天两次训练之间间隔要大于4hr，游泳结束后放回动物室。由心脏重量增 加变化来确认训练结果。一周后取其中的3只(SW二T1)，用于游泳一周的实验， 同时做对照实验。 1．2．2平滑肌细胞的分离与培养 1．2．2．1胰酶消化法培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞 1、 在超净台中准备好实验器械，紫外灭菌。试验中用到的玻璃及金属器械都 需要高压灭菌、操作过程中要做到无菌操作避免污染。 2、 大鼠颈椎脱臼处死，全身置于70％的酒精中浸泡，蜡板上固定。 3、 大组织镊，组织剪剪开胸腹部皮肤，剪开胸腔。迅速剪下大鼠背部主动脉， 放入盛有PBS液的培养皿中，转移到超净台。 4、 将主动脉转移到新的培养皿中，两把眼科弯镊挤出血管中残留的血液，轻 轻刮去外膜以及血管周围连带的脂肪组织。 5、 眼科剪纵向剪开血管，在另外一个盛有PBS(加少许血清)的培养皿中将 血管内皮向上平铺，先刮掉内膜(眼科弯镊轻刮3～4下)再轻轻刮下平滑 肌(半透明、呈卷曲状、具有韧性)放入另外一个盛有PBS(加少许血清) 的培养皿中。 ． 6、 剪碎刮下的平滑肌组织，用吸管将组织转移到小瓶中，倾斜移出一部分液 体，再次剪碎组织，越小越好。 7、 再用吸管将组织转移到玻璃培养瓶中，加入lmL0．25％的胰酶。于37℃条 件下消化，每隔30rain用吸管吹打一次。当在显微镜下观察组织块表面出 现大量细胞时应立即加入血清终止消化，一般消化的时间在3．5llr。 8、 终止消化后将玻璃培养瓶置于37℃空气摇床振摇10rain，继续用吹打的方 法使组织块表面的细胞尽可能脱落。 9、 待细胞从组织块脱离后，120目细胞筛过滤，滤液转入离心管内离心 (1000r／min，8rain)，弃上清，用含20％d、牛血清的DMEM培养基吹打 细胞，最后接种于培养皿中，放入C02培养箱培养，48hr后换液。 7 力竭性运动对大鼠胸主动脉平滑肌细胞BKa通道生物物理特性变化的初步研究 1．2．2．2组织块贴壁法培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞 l、 大鼠颈椎脱臼处死，全身置于70％的酒精中浸泡，在蜡板上固定。 2、 大组织镊、组织剪剪开胸腹部皮肤，另一组织镊，组织剪切开胸腹部，眼 科镊和眼科弯剪分离胸腹主动脉并放入盛有PBS(加少许血清)液的培养 皿中。 3、 转入无菌室，眼科弯镊去除血凝块和血管外膜层。 4、 放入另一盛有PBS(加少许血清)液的培养皿中，眼科剪纵向剪开血管腔， 用眼科弯镊轻轻擦拭内膜层，以去除内膜。 5、 眼科弯镊轻轻刮下血管平滑肌(半透明，卷曲，具有韧性)。 6、 将刮下的平滑肌组织块转移到装有少量血清的小玻璃瓶中，用眼科剪剪碎 至lmm。 7、 用吸管把组织块转入培养瓶中，均匀贴壁，组织块的间距为O．5cm。向瓶内 注入适量培养液，直立放置。瓶盖不要拧死，略透气，于37℃C02孵箱内 放置4～5llr，使得组织块干涸，并与瓶底贴附。 8、 将培养瓶慢慢翻转平放，使组织块完全浸入培养液中，继续静置3～5天， 更换新的培养基。每4天换一次培养基。待显微镜下观察到有大量细胞从 组织块周围游离出时传代。 1。2。2．3大鼠胸主动脉平滑肌细胞急性分离 l、 大鼠颈椎脱臼处死，固定在蜡板上，剪开腹腔，取出胸主动脉。 2、 剥离主动脉外周包被的脂肪组织。将主动脉剪成约lmm的动脉环，置于预 冷的含钙PSS溶液中，冰浴30min。 3、 将组织转移到无钙的PSS液中，37℃温浴10min。 4、 移走无钙PSS，加入3mL胶原酶Ⅳ(浓度为Im∥mL，无钙PSS稀释)37 ℃消化10min。 5、 消化完毕后，用小剪刀将动脉环轻轻剪碎。移走胶原酶，加入3mL消化液 (3m∥ml木瓜蛋白酶、lmMDTT，无钙PSS溶解)37℃消化10min。吸管 轻轻吹打，待组织块沉淀后，收集上清液。 6、 重复步骤5，三次。 7、 将收集到的上清液200目细胞筛过滤。1000r／min，离心3min。弃上清，加 力竭性运动对大鼠胸主动脉平滑肌细胞B酝通道生物物理特性变化的初步研究 入lmL无钙PSS吹打，再加入0．5mL含钙PSS液制成细胞悬液，冰上保 存备用。 1．2．3平滑肌细胞传代 1．2．3．1传代时间： 显微镜下观察，当大部分组织块长出细胞晕，并与相邻细胞晕相接触时就可 以传代。 1．2．3．2传代步骤： 将要传代的VSMC置于超净台，移走培养皿中的培养液，用PBS冲洗两遍， 加2～3滴0．25％胰蛋白酶消化液，培养皿平放入37"CC02培养箱内，不停的在显 微镜下观察细胞消化情况，当见到细胞质回缩、细胞间隙增大时迅速移走胰酶， 加入2mLDMEM培养基终止消化。反复吹打分散细胞。然后分装在3个培养皿中， 每个培养皿中再补入lmLDMEM培养基。在倒置显微镜下可见圆形细胞。放入37 ℃C02培养箱中培养。 在初次传代时，VSMC对胰酶敏感，加入胰酶30s，即消化充分，以后消化 时间约2min左右。在用吸管反复抽吸打散细胞时尽量避免产生气泡，以减少对细 胞的伤害。 1．2．4平滑肌细胞的冻存和复苏 1．2．4．1冻存时间： 使用传代次数较少的细胞(一般不超过4次传代)，以防细胞因为传代次数过 多而造成细胞衰老或发生改变，保持实验条件的一致性。 1．2．4。2冻存步骤： 取对数生长期VSMC，移走培养皿中的培养液，用PBS冲洗，0．25％胰酶消 化，终止消化后用含有10％tb牛血清的DMEM培养基吹打，转移到离心管中离心 (1000r／min，5min)，弃上清，用含有50％DMEM培养基、40％BSA、10％DMSO 的冻存液制成细胞悬液，转移入冻存管后置．20"(2冰箱过夜，然后置于液氮罐中 冻存。 1．2．4．3复苏步骤： 9 力竭性运动对犬鼠骢主动脉平滑舰细胞BKc．通道生物物理特性变化的初步研究 从液氮罐中取出要复苏的VSMC，放入37℃水浴，冻存液解冻后加入10mL DMEM培养基，离心(1000r／min，3．5min)，弃上清，最后用含有10％d、牛血 清的DMEM培养基制成细胞悬液，转移入培养皿后放入C02孵箱培养。 1．2。5平滑肌细胞的鉴定 相差显微镜下，酶消化法培养的细胞未汇合之前多数呈梭形，至汇合后，部 分区域细胞束状排列，呈典型的“峰和谷”状态。急性分离的细胞，贴壁后细胞 带有光晕，形状呈现多样，有长条形、梨形、肾形等。 1．2．6大鼠体重、心脏称重 大鼠处死后，称量体重(bodyweight，BW)。取出胸主动脉后，迅速取出心 脏，以PBS灌洗心脏，剪除心脏上的血管、脂肪组织等，称量全。tL,重量(heartweight， HW)。 1．2．7单通道记录 采用单通道内膜向外记录模式(single—channels：inside．outmodel)，在不同钙 离子浓度(分别为llaMCa2+、3rtMCa2+、10I．tMCa2+)浴液下，手动改变的钳 制电压(一60mV～+60mV)，记录BKc。通道开放频率。 l、不同方法分离得到的细胞采用不同的方法处理： a培养细胞：将贴壁培养或酶消化法培养的平滑肌在传代后培养在用多聚赖 氨酸处理过的小玻璃片上，过夜。记录前lhr左右换上新的不含血清的 DMEM低糖培养基，37℃的条件下培养lhr后使用。 b急性分离细胞：将急性分离得到的细胞悬液滴在用多聚赖氨酸处理过的小 玻璃片上，冰上放置lhr后使用。 2、制备玻璃微电极：选用厚壁硬质有芯玻璃微管，在电极拉制仪上用两步法拉 制出尖端直径为l～2岬玻璃微电极，灌入电极内液后电阻为4～6Mfl。 3、玻璃微电极的抛光：在刨光仪上使电极尖端接近加热铂丝进行抛光处理，使 微电极尖端表面变宽而光滑，同时根据电极尖端的口径的大小和实验的需 要，适当掌握抛光的程度。 4、当电极制好后，对其进行液体充灌，用于充灌电极的液体需经针头式滤器(孔 径0．2um)过滤，以除去妨碍高阻封接形成的灰尘。利用虹吸作用由尖端吸入 电极液，然后用注射针从电极尾部补灌，注意电极液不要充灌太多，～般不 10 力竭性运动对大鼠胸主动脉平滑肌细胞Bl(c。通道生物物理特性变化的初步研究 要超过lcrn为宜。然后使微电极尖端向下，用指敲弹管壁，以除去电极内 气泡。 5、将预先准备的细胞放入浴槽中，加入相应的浴液并置于显微镜下选择细胞边 缘清晰、饱满有光泽的进行纪录。 6、 高阻封接的形成：将灌注好的电极安装固定到HOLDSTAGE上，利用微操 操控电极，当电极通过气一液界面前，给微电极尖端施加微量正压，以防止 浴液中的灰尘附着于电极的尖端妨碍高阻抗封接的形成。电极入液后电阻 4～6MQ。先低倍后高倍显微镜下小心调整电极尖端并移动到预先选好的目 的细胞附近，由于电极电位存在漂移，此时再次调节极化电压补偿钮，使基 线至零位。当电极尖端与细胞膜接触时封接电阻指示Rm会有所上升，将电 极稍向下压，Rm指示会进一步上升，当达到10-'-,15MO时向电极内稍加负 压，如果细胞膜特性良好、负压大小合适，高阻密封即刻形成，封接后便形 成了细胞贴附式(cell．attached)，此时轻轻提起电极，将电极提出液面，因为 电极尖端常常获得囊泡而不是单层膜片，短暂暴露在空气中可使囊泡破裂形 成单层膜片。再将电极浸入浴液，如果此时依然为高阻密封状态即形成内面 向外记录式(inside-outrecording)。这时可以拉下屏蔽罩，进行电容补偿后， 通过调节放大器，进行记录。 本实验用Axopatch200B型膜片钳放大器，低通滤波器滤波频率1KHz；在 Clampexl0．0软件控制下，数字脉冲经D／A转换成模拟电压或电流信号，再经膜片 钳放大器放大，通过A—gCl电极导入细胞；产生的电流或电压信号经膜片钳 放大器输出，再经A／D转换，由计算机采集整理数据。 1．2．8数据处理和统计方法 单通道记录数据FhpClampl0．0软件采样系统获得的图形，直接进入Clamfit 10．0软件数据处理系统进行测量、分析、作图。实验数据以均数±标准误(X_SE) 来表示。双项差别采用成组t检验，P>O．05为差异不明显，P<0．05为相差显著， P<0．01为相差非常显著。图形绘制应用Origin7．0软件。 2结果与分析 2．1 高血压大鼠模型的鉴定 力竭性运动对大鼠胸主动脉平滑肌细胞BKcI通道生物物理特性变化的初步研究 各周运动组大鼠体重与对照组大鼠体重差别不显著(P>O．05，n=8／组)。Cl 组大鼠与SW-T1组大鼠心脏重量差别不显著(P>0．05，n=8／组)；C2组大鼠与 SW-T2组大鼠心脏重量为差别不显著(P>0．05，n=8／组)：C3组大鼠与SW-T3组 大鼠心脏重量差别显著(P<0．05，n=8／组)；C4组大鼠与SW-T4大鼠心脏重量差 别显著(P<0．05，n=8／组)，见表1。分析表明，经过力竭性运动，三周后出现心 肌肥大现象，高血压大鼠已经形成。 表l各组体重和心脏重量(n=8，X±SE) Tab．1Bodywdghtandheartweightineaehgroup(n=8，X=I=SE) 注：‘P<0．05 2．2大鼠胸主动脉平滑肌细胞BI(c．单通道电流记录 2．2．1正常大鼠胸主动脉平滑肌细胞BI(c．单通道电流 记录得到的原始数据(图IA)用FastGraph对单通道电流幅度作直方图， 然后对直方图进行高斯(Gaussian)拟合，其峰值就是通道开放的平均电流幅度 值。获得平均电流幅度值后，根据所给予的钳制电位与通道反转电位，就可以求 出单通道的电导。经过计算得出通道的电导(I／V)为225．5±8．4pS(F0．998，n=8)， 即在BKCa通道的电导范围内。以电流为纵坐标，电压为横坐标，做出I．V曲线 (图1B)。． 12 力竭性运动对大鼠胸主动脉平滑肌细胞BKc．itl道生物物理特性变化的初步研究 O一 ∞一 C一 姗 罢二一洲f1In一一k．肿釉帆Jll㈣．n广 0—一 2鲥 C一 -一一一一^一--^n-确_一mk—l～一I·‘-- q时：二——叩———下—下—一伽：二—]r—r吖 A B 《 ‘ △15． 10— 5一 。 I ‘ l ‘ - ‘／ ‘ l ’ - ‘ I ’ 枷。o‘∥1 20 40 60／ 。5一 mV 矗 ． ／ 彻． n ． ／ ．15． 图l大鼠胸主动脉平滑肌细胞的B＆=a电流的鉴定．A：原始记录(,u--Ol：呦，U-close) B：I—V曲线，电导：225．5±8．4pS(r=O．998．n=8) Fig．1IdentificationofBKcacurrentsinVSMC．A：currontrecord(O—open，C-close) B：Current—voltagerelationshipofBKc．channel，conductance：225．54-8．4pS(r=0．998，n=8) 13 力竭性运动对大鼠胸主动脉平滑彤t细胞Bl(Q通道生物物理特性变化的初步研究 2．2．2电压依赖性、钙离子依赖性的分析 利用膜片钳在不同胞内钙离子浓度下(分别为1I．tMCa2+、3州Ca”、10／aM Ca2+)记录不同钳制电压下的离子通道电流，原始记录(图2A、2B)通过 ClampfitlO．0分析对应通道开放频率，以Po为纵坐标，以电压为横坐标，根据对 应的电压和开放频率曲线可以被Boltzmann方程(Po=l／{1+exp[-ZF／RT(V-Vv2)]}) 拟合，得到的Po．V曲线(图3)所示。 0— 0时 C一 柏d ：二4鼾n．—枘11．Ll}1ln^ll飘l 铷“ 2=’I『n釉I．．-L九一．^一一．．．一一1．．． 伽 ：二一-蝴删叫’、mr舢O— I t VI- 圳：二—_1肌艚—1厂呷一 枷‘0二吖1—”1- I' V A 删：二蛐f1lhII帅删H岫山， 删C。-一1日蝴fy4虬№^嗍舳腑 O— I舢站一， 0一 B 图2大鼠胸主动脉平滑肌在不同电压、钙离子浓度Bl((!。通道开放情况．A：不同电压下通 道开放情况(钙离子浓度为lIlM)．B：不同钙离子浓度通道开放情况(钳位电压为40mV) Fig．2Typicalrecordedunderdifferentvoltagesand【Cap】iofBKcacurrentsinVSMC．A：Typical recordofBKcacll嗍tsatdifferentvoltages(1’llefreecalciumconeentration([Ca2+]i)was10石Min thebathsolution)B：TypicalrecordofBKcacurrentsatdifferent[Ca2+】i(Tllemembrane potential(Vm)is+40mV) 14 力竭性运动对大鼠胸主动脉平滑肌细胞BKc．通道生物物理特性变化的初步研究 一60 ．●0 ·20 O 20 40 60 mV 图3Ca2i敏感的Po—v曲线 Fig．3ThePo-Vcurveofcalcium-sensitivity 本工作采用急性分离的大鼠胸主动脉平滑肌细胞，记录到外向型单通道电 流，该电流的开放随着细胞膜电压的去极化而增加，显示通道活动的电压依赖性： 在胞内外对称的145mMK+浴液系统中，通道电流一电压关系呈直线，电导值为 285．5±8．4pS(r=0．998，n=8)，反转电位接近0mV，提示该通道对K+有选择性；且 从Po．V图中可以看出，电压在一20mV到+40mV范围内，随着钙离子浓度的提 高，通道的Po随着电压升高而升高的幅度趋缓，这表明Ca2+浓度对通道的电压 依赖性有影响，即随着Ca2+浓度的升高，通道的电压依赖逐步降低。 综上所述，我们记录到的通道具有大的电导(225．5±8．4pS)，同时也具有 Ca2+和电压依赖性，并且其电压依赖性和Caz+依赖性相互作用，这与BKc．通道 的特性一致，表明记录到了B配通道电流。 2．2．3力竭性运动对大鼠胸主动脉平滑肌细胞Bk通道活性的影响 本工作采用急性分离力竭性运动一周、二周、三周、四周后的大鼠胸主动 脉平滑肌细胞，记录K÷电流，同时记录各对照组大鼠胸主动脉平滑肌细胞Bk 通道K+电流，钙离子浓度为1IlM，钳制电压一60mV～+60mY。图4为力竭性运 动4周后记录到的原始数据与没有运动的4周对照所记录到的原始数据的对比， 15 力竭性运动对大鼠胸主动咏平滑肌细胞BKc,通道生物物理特性变化的初步研究 直观上可以发现在运动4周后B‰通道的开放频率有了明显提高。记录得到的 原始数据通过ClampfitlO．0分析通道开放频率，以Po为纵坐标，以电压为横坐 标，用Boltzmann方程(Po=l／{l+exp[一ZF侬及v-v．z)】))拟合，得到Po-V曲线。 力竭性运动l周后，通道开放频率与对照相比没有明显变化(图5A)；力竭性运 动2周后，通道开放频率与对照相比有所增加(图5B)：力竭性运动3周、4周 后，通道的开放频率发生明显的增加(图5C、D)。 0- ∞一 C一 舢：二““n．^'}1IJ4k^L--ll砌 猢2：由．且．jl|^．1l触．一^州_．一l岬—kk 删’5：——n肌I．厂———lI『—一 蝴；二竹wT下丁旷广—rrr 枷：二T1—T1一 O一 ∞IV C一 姗：：㈣．j脚舢』|n㈣_ll黼 2晰2： I}Il叫一I^蚺舳I。胁瞧隅lIIII 柏’3：]m1『1旷可]i嗍 删：二孵旷]f岬T—1-广一枷：二—1旷W B 图4 力竭性运动对大鼠胸主动脉平滑肌细胞BKCa通道开放概率(Po)的影响(原始记录)． A：4周对照组酞c。通道开放情况。B：4周运动组BI【c．通道开放情况．惰离子浓度为1“M) Fig．4EffectsofexhaustivetrainingonBKcachannelopenprobability(Po)intheVSMC．A： TypicalrecordedofcontrolgroupBKcachannelopenprobability(Po)inVSMCafter4weeks．B： TypicalrecordedoftraininggroupBKcachannelopenprobability(Po)inVSMCafter4 weeks．(Thefreecalciumconcentration([Ca2+]i)was10七Minthebathsolution) 16 力竭性运动对大鼠胸主动脉平滑肌纲胞BKca通道生物物理特性变化的初步研究 0．g 0．8 0．7 0．6 o 0．5 正 0．4 0．3 0。2 0．1 0．0 ．0．1 '．0 0．g 0．8 0．7 0．6 o 0．5 乱 0．4 O．3 0．2 0．1 O．0 ．0．1 —60 ．40 ．20 0 20 40 60 mV ．60 ·40 -20 0 20 40 60 mV 力竭性运动对‘火鼠胸主动脉平滑lVtf撇BK“通道生物物理特性变化的初步研究 ’．0 0．g Or8 0．7 罡0．6 0．5 0．4 O，3 0，2 O．1 0，O ．O．1 1·O O-9 0·8 O·7 o O·6 乱 0·5 0·4 0·3 0·2 O·1 0．0 ．60 ·40 ·20 0 20 40 60 m、， ．60 ．40 ·20 0 20 40 60 mV 图5力竭性运动不同时期对大鼠胸主动脉平滑肌细胞BKCa通道开放概率(Po)的变化．A：运 动一周．B：运动二周。C：运动三周．D：运动四周(钙离子浓度为1u哪 Fig．5Changeofexhaustivetraining0nBKc,channelopenprobability(Po)intheVSMC．A：after oneweekexhaustiveexercise．B：aftertwoweekexhaustiveexercise．C：afterthreeweek exhaustiveexercise．D：afteroneweekexhaustiveexercise．(Thefreecalciumconcentration ([Ca2+】i)was10一Minthebathsolution)． 力竭性运动对大鼠胸主动脉平滑肌细胞BKca通道生物物理特性变化的亳U步研究 3讨论 3．1 适用于膜片钳技术的平滑肌细胞分离及培养 膜片钳技术最基本的操作是将玻璃微电极置于细胞膜表面，紧密接触，先与 膜构成一个低阻连接，再加以一定的负压，使电极与膜接触更紧密，微电极内部 与溶液之间的阻抗高达十千兆欧姆或者更高。这一步的封接是整个技术成败的关 键。封接的成功与否与研究对象的分散程度、表面洁净度、电极制作等有直接的 关系，膜片钳技术要求分散好、活性高、表面洁净的细胞，而常规的分离培养方 法很难达到这一要求，所以目前阻挠这一技术发展的关键还是当前的细胞分离 及培养水平。 在本实验的进行过程中，也同样遇到了难以形成高阻封接的问题，进过长期 的实验条件摸索，最终建立了一套适用于应用膜片钳分析大鼠胸主动脉血管平滑 肌细胞的方法。现将本实验过程中采取的有利于高阻封接形成的方法如下： l、 实验过程中用到的所有培养基、溶液、电极液、浴液都经过0，2um针头式滤 器过滤，以除去妨碍高阻封接形成的灰尘。 2、 培养细胞传代后进行试验，传代时用到的小玻璃片用多聚赖氨酸包被，要 保持玻璃片的清洁，以改善细胞与玻璃片的粘附，在提起微电极的时候不 会将细胞也同时提起。 3、 培养细胞在进行实验前换上不加血清的培养基，一个小时后再进行膜片钳 记录，血清的存在会影响形成高阻封接。 4、 在平滑肌急性分离时，所用的PSS液要现用现配，而且一定要保证pH值为 7．2，分离的过程中酶的浓度、消化时的温度、以及室温都会影响到分离细 胞的质量。吹打的过程不能太剧烈，吹打用的吸管口径要大一点(直径约 1．5mm)以保证分离出细胞膜完整的适合于膜片钳记录的细胞。 5、 急性分离得到的平滑肌细胞悬液滴到用多聚赖氨酸包被的玻璃片上，在冰 上放置(防止蒸发干片)lhr后再进行记录，以保证细胞粘附在玻璃片上。 细胞分离出后，8hr之内完成实验，超出8hr后，细胞状态变坏，难以形成高 阻封接。 6、 微电极选用硬质厚壁有芯的玻璃微管，在拉制之前用甲醇浸泡过夜，再用 超纯水冲洗干净，晾干后备用。电极拉制后再经抛光仪抛光后使用，灌入 19 力竭性运动对大鼠胸主动脉平滑肌细胞B配通道生物物理特性变化的初步研究 电极液后电极电阻为4～6MQ为宜。 此外，要记录质量高的数据还得通过接地、屏蔽等措施降低膜片钳记录系统 中的噪声。 3．2高血压与动脉血管平滑肌细胞BKca通道特性的关系 心肌肥大继发于高血压及肺动脉高压等血压异常的后期，其机制至今尚未阐 明。随着BKa通道功能调控的研究，已经证实Bl≮。通道的非正常表达及功能紊 乱与高血压发病有着密切的关系。研究发现BKc。通道在血管张力的调节中可能存 在以下机制：动脉平滑肌细胞膜去极化而激活电压依赖性Ca2+通道，引起Ca2+内 流、胞浆内整体Ca2+增加而引起SMCs的收缩【25】：同时Ca2+内流也激活肌浆网上 的ryanodine受体，而引起肌浆网局部的Ca2+释放，即钙火花(ca2+sparks)，加 之肌浆网的ryanodine受体与BKc。通道非常接近(<20nm)，从而活化附近的BKc, 通道，B阮通道的激活产生瞬时外向钾电流(spontaneoustransientoutward currents，STOCs)而使膜超极化，减少Ca2+内流而降低动脉张力【26，271。Liu等用 Kc。13亚单位的特异性抗体作为探针发现原发性高血压大鼠(spontaneouslyhype． rtensiverat，SHR)主动脉上Kc。表达多于Wistar大鼠(Wistar．kyotorat，WKY)，在 mRNA水平上，两者的Kc。表达无明显差异，推测l(c。蛋白表达增加主要是由于转 录后mRNA翻译增强引起【191。Liu等人又发现原发性高血压大鼠(SHR)脑VSMC 上酝的电流密度、幅度增加；单通道分析显示单位电导、电压、钙敏感性等通道 特性未发生变化【28】。此外“u等对醛固酮盐型高血压大鼠(aldosterone．salt hypertensiverat，AHR)和正常盐敏感性大鼠(normotensivecontr01．saltrats，CSR) 主动脉血管平滑肌的研究发现：AHR自发性瞬间外向电流(spontaneoustransient outwardcurrent，STOC)显著大于CSR，用5mmol／L咖啡因刺激后，胞内钙在两 组间无差别，由此可以推测AHR平滑肌细胞肌网膜钙转运不正常而引起STOC增 加【201，推测高血压使影响B配通道的多种细胞通道发生改变，从而使BKc。的活 性发生改变。另3'bRuseh和Runnellsl构研究显示厍]ramipril(3．5mg／kg／d)治疗SHR2 周后，SHR的血压下降，同时Kc。通道活性恢复正制291，以上研究证实地功能活 动改变是长期高血压的结果。 相反，也有少数报道称I(c。是原发性高血压的原因。王国勇等报道卒中型自发 性高血压大鼠(stroke—pronespontaneouslyhypertensiverats，SHRsp)肠系膜动脉 力竭性运动对大鼠胸主动脉平滑肌细胞Bv,o通道生物物理特性变化的初步研究 平滑肌Kc．开放频率明显低于WKY大鼠且对钙敏感性降低，他们认为Kc．是原发 性高血压的原因，由于开放频率的降低以及对钙离子敏感性的降底进而导致血压 升高【30】。在SHR血压升高以前，股动脉平滑肌细胞胞内钙浓度增高，且配活动 增强，提示遗传因素可能参与此改变，而且可能因其功能缺陷使l(c。活动增加而致 的血管舒张作用弱于Ca2+内流而致的血管收缩作用，促进和维持高血型引】。Pluger 等【32】研究显示不含BKc。通道B亚单位基因的小鼠产生正常频率和幅度的钙火 花，但STOC减少，由此推测不含BKc。通道8亚单位基因的小鼠存在不正常的钙 火花／STOC偶联，从而引起血压升高。Comfiekd．等【33】用RT．PCR方法研究证实 慢性肺动脉高压小羊的导管动脉Kc。的mRNA表达减少，由此认为Kc。表达减少导 致肺动脉高压。因此，对Kc．是高血压的原因还是长期高血压的结果还需进一步 研究【34】。 本实验研究力竭性运动刺激下，诱导大鼠血压升高形成心肌肥大的过程中， 各个时期大鼠胸主动脉血管平滑肌BI