GB 17813-1999-T 复合预混料中烟酸、叶酸的测定 高效液相色谱法

GB/'r 17813-1999 前 言 复合预混料中烟酸、叶酸的测定目前尚无国家标准和国际标准，本标准是在查阅国外文献的基础 上，经过试验比较选择了用高效液相色谱法测定复合预混料中烟酸、叶酸。该方法与美国公职分析化学 家协会(AOAC)方法比较，简便、快速，准确度、精密度效果相当。 本标准在技术内容上参照国外方法，确定了标准范围、试剂、测定条件，即反相离子色谱条件和反相 缓冲液系统条件。在编写格式上依据GB/T 1. 1-1993《标准化工作导则 第1单元:标准的起草与述 规则 第1部分:标准编写的基本规定》和GB/T 1. 4-1988((标准化工作导则 化学分析方法标准编写 规定》。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。 本标准由国家饲料质量监督检验中心(北京)负责起草。 本标准主要起草人:陈必芳、李兰、梁冬生。 中华人民共和国国家标准 复合预混料中烟酸、叶酸的测定 高效液相色谱法 GB/T 17813-1999 Determination of nicotinic acid and folic acid in compound premix- High-pressure liquid chromatography 1 范围 本标准规定了复合预混料中烟酸、叶酸的测定— 高效液相色谱法。 本标准适用于复合预混料和维生素预混料中烟酸、叶酸的测定。测量范围为每千克样品中含烟酸的 量在1 000 mg以上，含叶酸的量在500 mg以上。 2 引用标准 下列标准中所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文 本标准出版时，所示版本 均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 GB/T 6682-1992 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法原理 试样中的烟酸、叶酸用水一甲醇一乙酸混合溶液提取，将滤液注人高效液相色谱反相柱上进行分离， 用紫外检测器在280 nm波长处定量测定。 4 试剂和材料 除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯.水为蒸馏水，色谱用水为去离子水，符合GB/T 6682的 规定 4.1 甲醇:优级纯。 4.2 三乙胺 4. 3 冰乙酸。 4.4 烷磺酸钠(PICB6): c CCH, (CHr)5S0,Na) = 0. 005 mol/I{或 p CCH, (CH.. ),SO,Na I =941 mg/I)。 4.5 标准溶液配制 4.5.1 烟酸标准贮备液:称取经过干燥的烟酸标准纯品25. 0 mg, `N.于250 ml,棕色容量瓶中，用移动 相溶解，稀释至刻度，于冰箱保存，可放置一周。 4. 5. 2 叶酸标准贮备液:称取经过干燥的叶酸标准纯品25.0 mg, .于250 ml容量瓶中，用碳酸钠溶 液(4. 8)溶解，调至pH 7.。定容至刻度，于冰箱保存。 4. 5. 3 烟酸、叶酸标准工作液 准确吸取4. 5.1和4. 5. 2各10 ML，用移动相稀释至50 ml或100 ML. 该混合标准溶液置于带盖小瓶贮存，供液相色谱仪分析用，当日使用。 国家质量技术监督局1999一08一10批准 2000一02一01实施 Gs/T 17813-1999 4. 6 提取液:取500 mL去离子水，加10 mL冰乙酸((4.3),1.3 ml三乙胺(4.2)，用去离子水定容至 1I，此时pH为3.2，过0. 45 pm滤膜，取上述溶液850 mL与150 mL甲醇(4.1)混合 4. 7 磷酸缓冲液:称取4. 84 g的磷酸氢二钾(K,HP0,),9.82 g磷酸二氢钾(KH,P04) ,溶于去离子水 中，加20 ml乙腊，用去离子水定容至1 L,混匀用2000氢氧化钾调节pH至6.50 4.8 碳酸钠溶液:c(Na,CO.,)=0.1 mol/L. 5 仪器、设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5. 5 实验室常用仪器设备。 超声波水浴。 超纯水装置(Millipore或全磨口玻璃蒸馏器)。 离心机:3 000 r/min. 高效液相色谱仪:带自动进样器、紫外可调波长检验器。 6 试样制备 选取有代表性的样品至少500 g，四分法缩减至100 g,磨碎，全部通过。.28 mm孔筛，混匀，装入密 闭容器中，避光低温保存备用。 7 分析步骇 7.1 试验溶液的制备 称取试样维生素预混料0. 5-1 g或复合预混料1-5 g,精确至。.000 1 g,置于100 mL棕色容量 瓶中，加10 mL碳酸钠溶液((4.8)，浸湿试样加70 mL提取液(4.6)混匀，于超声波水浴上振荡提取 15 min，用提取液定容至刻度，混合均匀，过滤或离心。再经0. 45 pm过滤膜过滤至带盖小瓶中，调整该 试验溶液的浓度(5 pg/mL，供高效液相色谱分析用。 7.2 测定 7.2.1 色谱条件 7.21.1 反相离子对色谱条件 柱长:25 cm、内径4. 0 mm不锈钢柱。 固定相:ODS(C,e)粒度5 km, 移动相:取500 mL去离子水，加10 ml冰乙酸,1. 3 mI三乙胺，一小瓶20 mI_己烷磺酸钠((4.4), 用去离子水定容至1L，调节pH为3.2，过0. 45 pm滤膜，取上述溶液850 mL与150 mL甲醇混合，脱 气 流速 1. 0 mL/min, 温度:30C。 进样量:20讨。 检测器:紫外检测器，使用波长275 nm 7.2.1.2 反相色谱 柱长:25 cm，内径4 mm，不锈钢柱。 固定相:Lichrospher CH-8/11.,粒度5 pm 移动相:2%乙睛磷酸缓冲液((4.7) 流速:1. 4 mL/min. 温度:室温。 进样体积:20 pL. 检测器:紫外检测器，使用波长280 nm. Gs/T 17813--1999 7.2.2 定量测定 按高效液相色谱仅说明书调整仪器操作参数和灵敏度(AUFS)，色谱峰分离度符合要求 用两次以 上相应标准工作液对系统进行校正。向色谱柱注入相应的烟酸、叶酸标准工作液(4.5.3认.)和试验溶液 .1 V)得到色谱峰面积响应值(只,PJ，用外标法定量测定 结果的计算与表述 8.1 式中 计算公式 结果按式(1)计算 VXP;XV, X . X V. ⋯ “·，.·.···············⋯ ⋯ (1) ? ?? 叫-一每千克试样中含烟酸或叶酸的量，mg; m— 试样质量.g; V一一提取液的总体积，ml; P— 标准溶液中烟酸或叶酸浓度，pg/mL ; V，一一烟酸或叶酸标准溶液进样体积，pL; v、一从试验溶液中分取的进样体积，pL; 尸.-一 与标准溶液进样体积(V,)相应的峰面积响应值; 尸‘一一与从试验溶液中分取的进样体积(V)相应的峰面积响应值。 8.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数3位。 9 允许差 同一分析者对同一试样同时两次平行测定所得结果相对偏差蕊士lo%e