GB 14965-1994 食物中氨基酸的测定方法

GB/T 14965—1994 中华人民共和国国家标准 食物中氨基酸的测定方法 Method for determination of amino acids in foods GB/T 14965—1994 1 主与适用范围 本标准规定了用氨基酸自动仪测定食物中氨基酸的方法。 本标准适用于食物中天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨 酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨 酸、赖氨酸和精氨酸等十六种氨基酸的测定。其最低检出限为 10pmol。 本标准不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的氨基酸 测定。 2 原理 食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分 离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。 3 试剂 全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。 3．1 浓盐酸：优级纯。 3．2 6mol/L 盐酸：浓盐酸（3.1）与 1：1 混合而成。 3．3 苯酚：须重蒸馏。 3．4 混合氨基酸标准液（仪器制造公司出售）：0.002 50mol/L。 3．5 缓冲液 3．5．1 pH2.2 的柠檬酸钠缓冲液：称取 19.6g 柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2H2O） 和 16.5mL 浓盐酸加水稀释到 1 000mL，用浓盐酸或 50%的氢氧化钠溶液调节 pH 至 2.2。 3．5．2 pH3.3 的柠檬酸钠缓冲液：称取 19.6g 柠檬酸钠和 12mL 浓盐酸加水稀 释到 1 000mL，用浓盐酸或 50%的氢氧化钠溶液调节 pH 至 3.3。 3．5．3 pH4.0 的柠檬酸纳缓冲液：称取 19.6g 柠檬酸钠和 9mL 浓盐酸加水稀 释到 1 000mL，用浓盐酸或 50%的氢氧化钠溶液调节至 4.0。 3．5．4 pH6.4 的柠檬酸纳缓冲液：称取 19.6g 柠檬酸钠和 46.8g 氯化钠（优 级纯）279mL，加水稀释到 1 000mL，用浓盐酸或 50%的氢氧化钠溶液调节 pH 至 6.4。 3．6 茚三酮溶液 3．6．1 pH5.2 的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂（LiOH·H2O）168g，加入冰乙酸 （优级纯）279mL，加水稀释至 1 000mL，用浓盐酸或 50%的氢氧化钠溶液调节 pH 至 5.2。 3．6．2 茚三酮溶液：取 150mL 二甲基亚砜（C2H6OS）的乙酸锂溶液（3.6.1） 50mL 加入 4g 水合茚三酮（C9H4O3·H2O）和 0.12g 还原茚三酮（C18H10O6·2H2O） 搅拌至完全溶解。 3．7 高纯氮气：纯度 99.99%。 3．8 冷冻剂：市售食盐与冰按 1：3 混合。 中华人民共和国卫生部 1994—03—18 批准 1994—09—01 实施 中华人民共和国卫生部 1994—03—18 批准 1994—09—01 实施 GB/T 14965—1994 4 仪器和设备 4．1 真空泵。 4．2 恒温干燥箱。 4．3 水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积 20～30mL。用去离子水冲 洗干净并烘干。 4．4 真空干燥器（温度可调节）。 4．5 氨基酸自动分析仪。 5 样品处理 样品采集后用匀浆机打成匀浆（或者将样品尽量粉碎）于低温冰箱中冷冻 保存，分析用时将其解冻后使用。 6 分析步骤 6．1 称样 准确称取一定量样品，精确到 0.000 1g。均匀性好的样品如奶粉等，使样 品蛋白质含量在 10～20mg 范围内；均匀性差的样品如鲜肉等，为减少误差可适 当增大称样量，测定前再稀释。将称好的样品放于水解管中。 6．2 水解 在水解管内加 6mol/L 盐酸（3.2）10～15mL（视样品蛋白质含量而定），含 水量高的样品（如牛奶）可加入等体积的浓盐酸，加入新蒸馏的苯酚（3.3）3～ 4 滴，再将水解管放入冷冻剂中，冷冻 3～5min，再接到真空泵的抽气管上，抽 真空（接近 0 psi），然后充入高纯氮气；再抽真空充氮气，重复三次后，在充 氮气状态下封口或拧紧螺丝盖将已封口的水解管放在 110±1℃的恒温干燥箱 内，水解 22h 后，取出冷却。 打开水解管，将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗水解管，将水解液全 部转移到 50mL 容量瓶内用去离子水定容。吸取滤液 1mL 于 5mL 容量瓶内，用真 空干燥器在 40～50℃干燥，残留物用 1～2mL 水溶解，再干燥，反复进行两次， 最后蒸干，用 1mLpH2.2 的缓冲液（3.5.1）溶解，供仪器测定用。 7 测定 准确吸取 0.200 mL 混合氨基酸标准（3.4），用 pH2.2 的缓冲液（3.5.1） 稀释到 5mL，此标准稀释液浓度为 5.00nmol/50μL，作为上机测定用的氨基酸 标准，用氨基酸自动分析仪以外标法测定样品测定液的氨基酸含量。 8 计算 100 10 50 1 9 ×× ×××× = m MVFc X 式中：X——样品氨基酸含量，g/100g； c——样品测定液中氨基酸含量，nmol/50μL； F——样品稀释倍数； V——水解后样品定容体积，mL； M——氨基酸分子量； m——样品质量，g； 50 1 ——折算成每毫升样品测定液的氨基酸含量，nmol/mL； 109——将样品含量由 ng 折算成 g 的系数。 注：①样品氨基酸含量在 1.00g/100g 以下，保留两位有效数字；含量在 1.00g/100g 中华人民共和国卫生部 1994—03—18 批准 1994—09—01 实施 GB/T 14965—1994 以上，保留三位有效数字。 ②十六种氨基酸分子量 天冬氨酸：133.1； 苏氨酸：119.1； 丝氨酸：105.1； 谷氨酸：147.1； 脯氨酸：115.1； 甘氨酸：75.1； 丙氨酸：89.1； 缬氨酸：117.2； 蛋氨酸：119.2； 异亮氨酸：131.2； 亮氨酸：131.2； 酪氨酸：181.2； 苯丙氨酸：165.2； 组氨酸：155.2； 赖氨酸：146.2； 精氨酸：174.2。 9 允许差 同实验室平行测定或连续两次测定结果相对偏差绝对值≤12%。 10 其他 10．1 测定条件（以 Beckman-6300 型氨基酸自动分析仪为例） 缓冲液流量：20mL/h； 茚三酮流量：10mL/h； 柱温：50、65 和 70℃； 色谱柱：20cm； 分析时间：42min。 10．2 标准出峰顺序和保留时间 出峰顺序 保留时间，min 出峰顺序 保留时间，min 1 天冬氨酸 5.55 9 蛋氨酸 19.63 2 苏氨酸 6.60 10 异亮氨酸 21.24 3 丝氨酸 7.09 11 亮氨酸 22.06 4 谷氨酸 8.72 12 酪氨酸 24.52 5 脯氨酸 9.63 13 苯丙氨酸 25.76 6 甘氨酸 12.24 14 组氨酸 30.41 7 丙氨酸 13.10 15 赖氨酸 32.57 8 缬氨酸 16.65 16 精氨酸 40.75 10．3 标准图谱 中华人民共和国卫生部 1994—03—18 批准 1994—09—01 实施 GB/T 14965—1994 附 录 A 其他型号氨基酸自动分析仪特点 （参考件） A1 测定条件 HITACHI HITACHI 835-50 L8500 缓冲液流量，mL/min 0.225 0.4 茚三酮流量，mL/min 0.3 0.3 柱温，C 53 57 色谱柱，mm 4×150 4.6×60 分析时间，min 50 30 最低检出限，pmol 30 10 A2 标准出峰顺序和保留时间 HITACHI HITACHI 835-50 l-8500 出峰顺序 保留时间，min 1 天冬氨酸 9.88 5.90 2 苏氨酸 10.86 6.56 3 丝氨酸 11.88 7.22 4 谷氨酸 13.52 8.15 5 脯氨酸 14.34 8.86 6 甘氨酸 18.38 11.25 中华人民共和国卫生部 1994—03—18 批准 1994—09—01 实施 GB/T 14965—1994 7 丙氨酸 19.77 12.08 8 缬氨酸 22.90 13.38 9 蛋氨酸 24.64 14.58 10 异亮氨酸 26.97 16.78 11 亮氨酸 28.41 17.86 12 酪氨酸 30.14 18.83 13 苯丙氨酸 31.90 19.64 14 赖氨酸 35.54 21.98 15 组氨酸 40.17 24.16 16 精氨酸 48.53 28.20 A3 标准图谱 中华人民共和国卫生部 1994—03—18 批准 1994—09—01 实施 GB/T 14965—1994 图 A1 中华人民共和国卫生部 1994—03—18 批准 1994—09—01 实施 GB/T 14965—1994 附加说明： 本标准由卫生部卫生监督司提出。 本标准由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所负责起草。 本标准主要起草人贾健斌、赵熙和。 本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。 中华人民共和国卫生部 1994—03—18 批准 1994—09—01 实施