HIF与脑胶质瘤恶性度及侵袭力的关系

第四军医大学学报(J Fou—rth Mil Med Uni—v)2003；24(22) · 研究原著 · 文章编号：1000-2790(2003)22-2034-03 HⅡi’与脑胶质瘤恶性度及侵袭力的关系 王彦刚，章 翔，付洛安，费 舟，刘卫平，王占祥，张剑宁 (第四军医大学西京医院全军神经外科研究所，陕西 西安 710033) Relationship between expression 0f HⅡ and malignan cy an d invasiveness of hu- man g~om as WANG Yah—G0 ，ZHANG Xiang。FU Luo—An，删 Zhou，LIU Wei—P堍 ，WANGZhan—Xiang，ZHANG Jian—N g PLA Institute of Neurosurgery．Xijing Hospita1．Fourth Military Medical University，Xi’an 710033，China 【Abstract】A ：To study the relationship between the ex— pression of HIF (hypoxia inducible factor)and the malig— nancy and invasiveness of human gliomas． METHoDS： Seventy biopsy specimens of glioma patients were studied by immunohistochemistry and in situ hybridization tech— niques．The transcription and expression of HlF gene were investigated in each grade of gliomas．1IESULTS：The ex- pressions of HiF were different in gliomas frOm l tO lV grades and the expression of HIF was stronger in high grade gliomas than that in the low．The top malignant glio- ma showed noted expression of HIF and the expression of HIF was correlated with Ki_67．C0NCLUSIoN：There iS a significant correlation between the expression leveI of HIF and the tumor malignancy and invasiveness，suggesting lhal HlF may be one of the positive factors to promote glio- ma development and recurrence． 【Keywords】glioma；hypoxia inducible factor；invasive- ness；malignancy 【摘 要】目的：探讨 HIF与人脑胶质瘤恶性度及侵袭力的 关系．方法 ：免疫组化和原位杂交法对人脑胶质瘤病检标本 研究，从转录和蛋白达水平研究 HIF在不同级别胶质瘤细 胞中的表达情况、结果 ：不同级别 的胶质瘤 HIF表达情况不 同，级别高的肿瘤HIF表达高于级别低的肿瘤，以高度恶性胶 质瘤最为显著；HIF表达与 Ki-67有密切相关性．结论：HIF 在胶质瘤中表达与肿瘤恶性度及侵袭性有明显的相关性，提 示 HIF可能是激发实体胶质瘤发展及复发的因素之一． 【关键词】神经胶质瘤；低氧诱导因子；侵袭性；恶性度 【中图号】R739、4 【文献标识码】A 收稿日期：2003．．09-08； 修回日期：2003—10-01 基金项目：国家 自然科学基金资助项目(39970852) 通讯作者：章 翔．Te1．(029)3375567 Email．xiangzhang@fmmu edu、cn 作者简介：王彦刚(1966一)，男(汉族)，黑龙江省齐齐哈尔市人．博士 主治医师、TeI’(029)3375567 Email．cjnsdr@fmmu．edu、cn O 引言 脑胶质瘤占颅内恶性肿瘤发病率的第一位 ， 其侵袭和复发率都明显高于颅内其他肿瘤．近年来， 研究表明胶质瘤侵袭与复发均与某些基因或细胞因 子过度表达有直接的相关性 ，其中血管内皮生长因子 (VEGF)就是最重要的一种 ．3 J，但是有关初始启动 VEGF因素的研究较少．低氧诱导因子 (hypoxia in． ducible factor，HIF)是近年来发现的一种细胞因子 ， 其作为一种核转录因子在总体上调控细胞对氧的反 应状况 ，通过上调 VEGF及糖酵解酶等一系列活性蛋 白改变细胞的生物特性．已有研究表明它是实体肿 瘤(如前列腺癌、结肠癌等)的促发因素之一_4 J．本 试验拟采用原位杂交和免疫组化方法对 HIF与脑胶 质瘤侵袭性和复发性的相关性进行研究． 1 材料和方法 1．1 材料 收集西京医院神经外科 1999／2001手术 切除的脑胶质瘤标本70(男 30，女40)例，患者年龄 11—56岁，所有标本均经 40 g·L 甲醛溶液固定、 脱水、常规石蜡包埋，制成4 m厚的连续切片．收集 ：符合 WHO(1993年)胶质瘤分级．其中良性及 偏良性肿瘤标本 20例(胶质瘤 I级和 Ⅱ级各 10例 ， 包括毛细胞型星形细胞瘤4例、纤维型星形细胞瘤 6 例、原浆型星形细胞瘤4例和少突胶质细胞瘤6例)， 恶性肿瘤标本 30例(胶质瘤 Ⅲ级，包括间变性星形 细胞瘤 18例及间变性少突胶质细胞瘤 12例)，高度 恶性肿瘤标本 20例 (胶质瘤Ⅳ级，包括胶质母细胞 瘤11例及髓母细胞瘤9例)．正常对照脑组织来源 于我科颅脑外伤内减压术的正常脑组织标本．试剂： HIF一1Or．单抗、SABC试剂盒购自晶美公司，Ki-67单抗 购自迈新公司，地高辛寡核苷酸3 末端标记与检测 试剂盒购自德国宝灵曼公司． 1．2 方法 1．2．1 原位杂交 石蜡切片常规脱蜡至水，0．01 mol·L PBS液(pH 7．4)漂洗 5 min，共 3次后 ，按 地高辛 一dUTP 3 末端标记与检测试剂盒说明书，采 用经地高辛 一dUTP3 末端标记的 HIF寡核苷酸探针 维普资讯 http://www.cqvip.com 第四军医大学学~—(J Fourth M—il Med Univ)2003；24(22) 做 HIF mRNA原位杂交，HIF探针由上海生工公司合 成，序列为 CGGTAA1-rCm ICATCACAATA．正常对 照(正常脑组织)，阴性对照(不含探针杂交液)． 1．2．2 免疫组化 染色 石蜡切片常规脱水后，3 mL·L 的 H，O 作用 10 min，蒸馏水洗 3次，PBS再 洗 3次，小牛血清覆盖，PBS摇洗，1：100稀释的鼠抗 人 HIF一1 和 Ki-67抗体于4℃过夜，滴加 1：100的生 物素化羊抗 鼠二抗 ，37％孵育 60 min，加入 SABC复 合物 37℃静止20 min，DAB显色 ，苏木素轻度复染． 0．01 mol·L PBS液代替鼠抗人 HIF一1 和 Ki-67抗 体作阴性对照．正常脑组织作正常对照．阳性结果 以胞质和胞核中出现过黄棕色为准． 统计学处理 ：随机选取 20个视野，对其中的阳 性的胶质瘤细胞计算阳性率 ，采用 SPSS软件包进行 Kruskal—wallis秩和检验以及等级相关分析． 2 结果 2．1 HⅡi’原位杂交 正常脑组织的 HIF原位杂交 呈阴性或偶发的弱阳性，HIF的 mRNA主要位于实体 胶质瘤细胞之内和胶质瘤血管内皮细胞内，阳性标记 为细胞质呈兰紫色(Fig 1)．不同级别的胶质瘤 HIF mRNA表达强度不同，以级别高的肿瘤杂交结果更加 明显(Tab 1)． 图1 Ⅱ级胶质瘤细胞中HIF mRNA的阳性表达(原位杂交) Fig 1 Positive expression of HIF mRNA in grade~glioma xdO0 2．2 HIF的免疫组化 正常脑组织 HIF免疫组化 结果呈阴性或偶发阳性．胶质瘤中 HIF位于胞核和 胞质中，以胞质更为明显(Fig 2)．平均阳性细胞标记 率分别为 I级(8．1±2．2)％，Ⅱ级(10．9-4-2．5)％． Ⅲ级(29．9．4-5．4)％，1V级(43．6±8．5)％．以上结 果(Tab 1)显示不同级别的胶质瘤 HIF表达不同，以 高度恶性胶质瘤表达较为显著，除了肿瘤细胞中可见 HIF蛋白的表达外，在实体胶质瘤中血管内皮细胞中 亦可见 HIF的表达，这与 HIF的原位杂交结果是相 符合的．而 HIF表达亦有随肿瘤恶性度增加而增加 的趋势． 表1 HIF原位杂交及免疫组化在各级脑胶质瘤中的表达 Tab 1 Expression of HIF mRNA ．HIF and Ki-67 protein in dif- ferent grade gliomas ( -4-s，％) P<0．05 grade I： P(0．0l gradeII： P(0．01 grade 111 HIF：Hypoxia inducible factor． ◆ ● ● ● ● 参 图 2 Ⅱ级胶质瘤细胞中 HIF的阳性表达(免疫组化) Fig 2 Positive expression of HIF in gradeⅡ glioma ×400 2．3 Ki417免疫组化 正常脑组织中无 Ki-67的阳 性表达 ，胶质瘤细胞因病理性有丝分裂而着色(Fig 3)，并随肿瘤级别增高而表达强度提高． 统计学结果：肿瘤各级别之间 HIFmRNA、HIF 和 Ki-67表达差异显著(P<0．05)．HIF及 Ki-67的 阳性细胞表达率呈 明显的正相关 ，相关系数 (r"s= 0．98．P<0．05 ． 3 讨论 HIF一1最先 由 Semenza等 人在缺氧诱导的细 胞核抽提物中发现，能与人红细胞生成素(EPO)基因 3 端的增强子序列结合，促进其转录．HIF一1主要以 异源二聚体的形式存在，由120×10 的ot亚基和 91／93／94×10 的 B亚基组成．HIF一1ot既是调节亚 基又是活性亚基 ，氧对 HIF一1活性的调节主要通过该 亚基．HIF一1广泛参与哺乳动物细胞中缺氧诱导产生 的特异应答，在缺氧诱导的基因表达调节中起着关键 作用 71．HIF一1能介导机体的整体和局部缺氧反应， 这些反应可以局限在某些特殊的细胞类型，也可以广 囊 瓷 ● 譬 维普资讯 http://www.cqvip.com 泛表现于各种类型的细胞中，如促 VEGF的表达以及 一 系列糖酵解酶的激活． 图 3 IV级胶质瘤细胞中 Ki-67的阳性表达(免疫组化) Fig 3 Positive expression of Ki-67 in grade IV glioma ×400 许多肿瘤具有缺氧的微环境，这是肿瘤侵袭性 强，治疗预后效果差 ，易产生放疗、化疗耐受性的原因 之一 J．在肿瘤形成过程中一个关键的步骤是对缺 氧的适应．肿瘤细胞适应缺氧环境的策略一个是提 高糖酵解速率，另一个是形成多血管体系．而HIF．1 能够增强其下游靶基因，如 VEGF和糖酵解酶的基因 表达，从而影响血管的发生和细胞的能量代谢 ⋯¨． 胶质瘤是人脑发生最多、治疗最为棘手的一种颅 内肿瘤．尽管手术、放疗、化疗这些现有手段均用于 治疗当中，仍有多数患者的肿瘤在数年内复发，而 50％的高度恶性肿瘤患者生存期甚至不足一年 J¨． 研究表明，胶质瘤的生物学特性符合一般肿瘤发展的 规律，即不断生长的胶质瘤细胞由于养份的需求量过 高，使众多瘤细胞处于缺氧状态，导致 HIF 1基因被 启动表达，最终导致胶质瘤进一步发展，增强了侵袭 性及复发能力⋯’ J． 本实验经对 70例胶质瘤标本的研究 ，提示 HIF 在实体胶质瘤的发生、发展中极有可能是一种促发因 素．研究的结果还发现，随着肿瘤恶性度增高以及肿 瘤细胞恶性增殖系数(Ki-67)的提高HIF表达有明显 增强的趋势，提示了肿瘤的恶性度、侵袭性及复发能 力与 HIF有直接的相关性．由于大量的研究 已证实 HIF是 VEGF和糖酵解酶等基因的转录因子[】 ，因 此可以推测颅内实体胶质瘤演化发展可能存在着这 样一种机制：基因突变或原位癌基因激活，导致细胞 快速生长，局部缺氧，进而 HIF表达上调启动 VEGF 及糖酵解酶等基因表达，使瘤细胞提高适应环境能 力，从而导致肿瘤继续快速发展并抵抗治疗 ，最终使 侵袭性提高，复发能力增强． 第四军医大学学报(J Fourth Mil Med Univ) ； ! 2 明确 HIF与脑胶质瘤恶性度、侵袭性及复发的 关系有着重要的意义．它不仅可以使我们认识脑胶 质瘤的发生、发展的规律，还可以利用这一规律寻找 新的治疗方法．已有学者利用 HIF启动细胞转录的 机制，驱动自杀基因高效表达，从而有效地杀伤了肺 癌细胞 ¨，抑制了肿瘤的发展，证明这是一条可行的 抗肿瘤途径．相信不远的将来这种方法将被用于抗 人脑胶质瘤的研究中． 【参考文献】 [1]Pamey IF，Hao C，Petruk KC．Glioma immunology and immuno— therapy[J]．Neurosurgery，2000；46(4)：778—792． [2]Mentlein R，Held—Feindt J．Angiogenesis factors in gliomas：A new key to tumour therapy[J]?Naturwissenschafien，2003；90(9)： 385—394． [3]Xiang F，Tanaka J，Fukuda T，Expression of vaseular endotllelial growth factor(VEGF)and its two receptors in diffusely infiltrating astrocytomas and relationship to proliferative activity of tumor cells [J]．Brain Tumor Pathof，200l；18(2)：67—71． [4]Ryan HE。Poloni M，McNuhy W，Elson D，Gassmann M，Arbeit JM．Johnson RS．Hypoxia—inducible factor—l alpha is a positive factor in solid tumor growth [J]． Cancer Res，2000；60(15)： 4010—4015． [5]G0da N，Dozier SJ，Johnson RS．HIF—l in cell cycle regulation，印一 optosis，and tumor progression[J]．Antioxid Redox Signal，2003； 5(4)：467—473． [6]Semenza GL，Wang GL，A nucleB．r factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhan — cer at a site required for transcriptional activation f J]．MoZ CelZ Biol，1992；12(12)：5447—5454． [7]Bracken CP。Whitelaw ML，Peet DJ．The hypoxia—inducible factors： Keytranscriptional regulators ofhypoxicresponses[J]．c MolUfe Sci。2003；60(7)：1376—1393． [8]Unruh A，Ressel A，Mohamed HG，Johnson RS，Nadrowitz R， Richter E，Katschinski DM，Wenger RH．Th e hypoxia-inducible fac— t l alpha is a negative factor for tnntor therapy[J]．Oncogene， 2003；22(21)：3213—322o． [9]Bachtiary B，Schindl M，Potter R，Dreier B，Knocke TH，Hainfell— ner JA，Horvat R，Birner P．Overexpression of hypoxia．inducible factor l alpha indicates diminished respo nse to radiotIlerapy and unfa— vorable prognosis in patients receiving radical radiotherapy for cervi— cal cancer[J]．Clin CancerRes。2003；9(6)：2234—2240． [10]Semenza GL．Hypoxia-inducible factor l：Master regulator of O2 ho— meostasis[J]．Curt OVin Genet Dev，1998；8(5)：588—594． [11]Koukourakis MI，Giatromanolaki A，Sivridis E，Bougioukas G，Di． dilis V，Gatter KC．Harris AL．Tumour and an giogenesis resear℃h group．Lactate dehydrogenase-5(LDH-5)overexpression in non— small—cell lung can cer tissues is linked to tumour hypoxia，angiogenic factor production and poor prognosis[J]．所 J Cancer，2003； 89(5)：877—885． [12]ZagzagD，NomuraM，FriedlanderDR，Blanco CY，GagnerJP，No— mura N，Newcomb EW．Geldanamycin inhibits migration of glioma ceils in vitro：A potential role for hypoxia*inducible factor(HIF．1 a． 1pha)in glioma cell invasion[J]．，c Physiol，2003；196(2)： 394—4O2． [13]Shih SC，Claffey KP．Hypoxia—mediated regulation of gene expres— sion in mananalian cells[J]． J Exp Pathol，1998；79(6)： 347—357． [14]Koshikawa N，Takenaga K，Tagawa M．Sakiyanm S．Therapeutic ef- ficacy of the suicide gene driven by the promoter of vascular endothe． 1ial growth factor gene against hypoxic tumor cells[J]．Cancer Res。 20o0；60(11)：2936—2941． 编辑 黄良田 维普资讯 http://www.cqvip.com