利用胆固醇氧化酶转化胆固醇制备胆甾—4—烯—3—桐

孳2O毒草 5期 2001三 9 互 无 锡 轻 I 大 学 学 报 Journal of"vVuxi University of Light Industry No 5 2001 文童编号：1009 038X{2001 105—0485 04 利用胆固醇氧化酶转化胆固醇制备胆甾一4一烯一3一酮 吕陈峰， 陈毅力， 王龙刚， 杨胜利， 王 武 (江南大学 工业生物技术教育部重， 买验室．江苏 无锡 214036) 摘 要：用酶法催化氧化胆固醇制备胆甾一4-烯一3-酮相对于化学法合成具有反应简单、成本较低等 优点 作者探讨 了在正辛烷作为有机相的两相反应体 系中，以胆 固醇氧化酶 催化 氧化胆 I*1醇制备 胆甾 4烯，3一酮的方法 在胆 固醇质量浓度为 4O g／I ，反应时间 40 min、反应温度 40℃、磷酸缓冲 液 正辛烷体积比 3：2、通氧4OI ／h及搅拌转速 300 r／min下，胆固醇转化率达到92％，强薄板层祈 及紫外扫描．发现转化产物为单一的胆 甾一4一烯 3酮． 关键词：胆甾一4一烯 3酮；砖相体系；胆固醇；胆固醇氧化酶；生物转化 中图分类号：Q 548．1 文献标识码：A Bioconversion of Cholesterol by Cholesterol Oxidase from Brevibacterium sp． I U Chen—feng． CHEN Yi ii． WANG Long—gang， YANG Sheng li． W ANG W u (Key LaBoratory of Industry Blotechno]ogy．Ministry o1"Education，Southern Yangtze University、Wuxi 214036，China) Abstract：Bioconversion of cholesterol in organ】c／aque。us two phase system by chotestero[oxidase from 13revibacterium sp．WaS investigated in this paper．Choles-4一ell一3 one．an important intermediate of several medicines．can be used a5 medicine itself owing to its blcx~d lipids lowering and anti obesity ef— fect Under the cholesterol concentration of 40 g／I ，aqueous volume：organic volume of 3 2，02 flow rate of 40 IWmin and 300 r／min maximum conversion rate of 92％ a,VaS reached at 40℃ in 40 rains Key words：Cholest一4一en一3一og re；two phase system；cholesterol；cholesterol oxidase；bioconversion 胆固醇氧化酶可以专 性地把胆固醇氧化为 胆苷j_4_烯 3酮 胆甾一4一烯 3一酮是胆固醇代谢过程 中的第 ‘个产物，原来位于 3位的羟基变成了糍 基，虽其它部分与胆固醇相同，但化学性质和生理 作用发生了变化．由于胆甾_4_烯 3一酮是 系列同 醇类激素药物的前体，其本身也可以直接作为药 物 有关文献曾先后报导了制备胆甾．4．烯．3．酮的方 法及其抗肥胖的疗效1]一1．利用小鼠肝病模型还证 明胆甾．4．烯0酮具有治疗肝病的效果l11此外还有 研究明胆甾 4烯一3一酮具有防 l卜皮肤角质化的功 能 关于胆甾_4_烯一3一酮的酶法制备，主要有两种方 法：微乳法和水 有机两相反应法 微乳法主要采用 反相微胶束( verse micelles)作为胆固醇氧化酶催 化反应的介质．一般以 Winsorff[和Ⅳ系统 或者 AOT异辛烷 水系统 J．该系统虽能取得较高的转 化率，但大多用于对且最固醇酶催化反应的机理研 究 而采用简单的水一有机两相反应的方法，更适合 收稿日期：2001—06—26； 修订 日期：2001 09 11 作者简介：吕陈峰(1978 )．男，江苏无锡^，生物化学工程硕士研究生 维普资讯 http://www.cqvip.com 无 锡 轻 I 大 学 学 报 第20卷 于大 制备胆甾一4 烯 3酮，所 作者采用水 有机 两相反应法进行胆甾_4_烯一3一酮的制备 1 材料 与方法 1．1 材料 胆固醇氧化酶 由本实验室保藏菌种 B一 。ibacteri“ sp DGC一007产生；磷 脂酶 c 购 自 SIGMA公司 培养基组成(g／I )：胆固醇 1 5．葡萄糖 20． 酵母膏 7．5，氯化钠 l，醋酸铵 2．磷酸氢二钾 0 2，七水硫酸镁 0．05，七水硫酸亚铁 0 01， 氯化钙 O 1，pH 7 5 1．2 方法 1 2 1 胆 甾一4烯一3一酮的制备 制备胆甾_4_烯一3一酮的反应装置见陶 1 管 图 1 反应装置图 Fig·1 Flow chart of the aqueons／organic lwo phase s · tem 取磷酸缓冲液(pH 7 5，0 075 m。]／L)作水相， 正辛烷作有机相，总反应体积 50 mL，加入胆固醇 2 g，于250 mI 三颈瓶中水浴加热 同时通入氧气，并 用搅拌器搅拌 1 2 2 转化 率测定 取反 应液 0．1 mI ．加入 10 mI 环己烷震荡后静置萃取 10 rain取苹取液稀释 20倍后在240 rim处测定吸光度． 1 2 3 胆甾一4一烯一3一酮的纯化 取2 mI 反应液加 八20 mI 无水乙醚，静置革取过夜．取上层萃取液． 在硅胶薄板上作条状点样，室温下展开 展开自然 干燥后，于254 rim的紫外灯下观察，把黑色无荧光 条带部分硅胶刮下，溶于无水乙醚，离心，上清液常 温下抽真空干燥 1+2 4 产物鉴定 反应产物用上述方法分离．二 次纯化所得产物作紫外光谱扫描鉴定 1．2 5 薄板层析 硅胶板制备 用硅胶 GF 与水按 1：3制成硅 胶板．105℃活化 40 min 展开剂 V(苯)：V(L酸乙酯)=2 l 显色剂 A 0 3％2，4-二硝基苯肼(0 3 g 2，4-二硝基苯肼溶于92 mI 无水乙醇和 8 m1 浓盐 酸中)；B 30％浓硫酸一乙醇溶液 2 结果与讨论 2．1 两相反应有机溶剂的选择 有文献报导在研究胆固醇的生物转化时发现 用长链烷烃作有机溶剂可以得到较高的转化率 但 考虑到底物与产物的分配系数以及烷烃易燃的特 ，在进一步的研究时采用了四氯化碳作为有机溶 剂[71由于作者制备胆烯酮的目的是为 r在医药领 域的应用，而四氯化碳具有一定的毒性，且残留凹 氯化碳会对制备的产物产生污染，所以采用正辛烷 作为反应的有机溶剂 2．2 两相反应条件优化 实验中首先考察了转化率随反应时间的变化 在反应体积 5O mI ，水相与有机相体积比 】：1．温 度37℃，搅拌速度200 r／rain，通氧量4O I ／h，加酶 量 1 5 u的反应条件下转化率随反应时间的变化如 图 2 图 2 转化率随反应时间的变化 Fig．2 Time course 0f the conversion 在图2上可看到当反应时间达到 40 min后，由 于产物的抑制作用，反应基本停止，转化率不再提 高 因此选取反应时间为 40 min 两相比对转化率有重要的影响，当水相有机相 体积比为 1：5时，转化率最高l71．所以接着研究 了 本实验中两相比对反应转化率的影响．在反应体积 50mI ，反应时间40mln，温度 37℃，搅拌速度 200 r／rain，通氧量40 I ／h，加酶量为 15 u的条件下，两 相比对转化率的影啊如图3． 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 5期 吕陈峰等：利用胆 固醇氧化酶转化胆固醇制备胆 甾一4烯一3一酮 487 圈 3 水相／有机相混合比对转化率影响 F ．3 Effect of aqueous／octane ratio on conversion rate 在实验中发现转化率最高的两相比与文献中 报道有所不同[ ，从上面的图中可以看到最优的水 相与有机相之比为 1．5．这可能与反应液中氧的扩 散问题有关．正辛烷浓度较高时反应液比较粘稠， 造成氧扩散困难．在文献[7]中由于采用专用的反 应器．氧扩散问题得到较好的解决，所以其有机相 比例较高．而本实验采用的装置较为简单，氧的扩 散性相对差一些，有机相比例偏高时氧扩散性反而 下降．所以在本实验中，确定最适合的 (磷酸缓冲 蔽 )：V(正辛烷)=3：2． 为了确定比较经济的用酶量，考察了在温度 37 ℃，搅拌速度 200 r／min，通氧量 40 I h，反应时 间40rain，V(水相)：V(有机相)：3：2的条件下加 酶量对转化率的影响： 90 80 70 碍 60 孬50 40 30 酶量／U 圈 4 加酶量与转化率关系 Fig．4 Effecl of enzyme concemration oil t~onversion rate 从图4可 看到，当添加酶量达到 l6u后，随 着添加酶量的增加，产物的抑制使得转化率变化很 小，所以．确定最经济的加酶量为 16 U． 据研究在水溶液 中该胆 固醇氧化酶的最适反 应温度为40℃ J，在水 有机两相系统中酶最适温 度有可能发生变化，因此测定了各反应温度下的转 化率 由图5可以看到，催化反应最适反应温度为 40 ℃，与酶最适温度一致 由胆固醇生成胆甾_4 烯 3 酮是一个氧化反应， 0 也是重要的底物，所 反应介质中溶解氧浓度非 围5 温度对转化率影响 通氧量／(【，，n) 围 6 通氧量对转化率的影响 Fig 6 Elfeel of air flow rate on conversion rate 常重要 实际反应时，通过不断通 入氧气来保证 反 应过程中有足够的氧气供应 由图6可以看到当通 氧量达到 20 I ／h时，转化率已达到 75％ 当通氧量 提高到40 I ／h时，转化率达到了84％，而后转化率 随通氧量的增加变化很小 这主要由于当通氧量达 到 一定程度后，溶氧基本已达饱和状态，继续提 高 通氧量已经意义不大 两相反应之所 能极大地提高转化率主要是 因为它增加了反应体系中底物的有效浓度．并提供 了一个足够的界面反应区域．在反应过程中．适当 的搅拌不仅能大大增加体系中的溶氧．而且能提高 两相的混合度，对反应起着重要的作用 实验申考 察了搅拌速度对转化率的影响，结果如图7． 搅拌速度／(r／mln) 圈 7 搅拌速度对转化率影响 Fig．7 Effect of revolution speed oil conversi~ rate 可以发现，当搅拌速度小于 100 r／rain时转化 率随搅拌速度的增大而明显提高；当搅拌速度大于 100 r／min后．转化率的提高并不十分显著 当搅拌 维普资讯 http://www.cqvip.com 无 锡 轻 I 大 学 学 报 第 20卷 速度达到 300 r／min时，转化率已到92％，但随着提 高搅拌速度还能继续有所提高．由于反应装置的影 ，继续提高搅拌速度会造成搅拌时装置的不稳 定，固此选择搅拌速度为300 r／rain 通过实验最终确定反应条件：磷酸缓冲液 30 mI．1lF辛烷 20 mI ，古¨酶量 为 16 U，胆固醇添加艟 为!g．反应时间 40 mln．反应温度 40℃，、，f磷 酸缓冲液)：V( 辛烷) 3：2．通氧量 40 Ijh．搅 拌速度 3l】I_r／rain 此反应条件下，胆固醇转化率可以达到 92％ 2 3 转化产物的鉴定 2 3 1 薄板层析 法 胆 甾 4烯．3一酮遇显色剡 A 呈橘黄色．胆暖防遇显色剂 A呈淡黄色 显色剂B 高7』能显色剂，喷洒后置于 105℃烘箱约 5 min，条 圉 8 胆烯酮标样紫外扫描 Fig·8 Ultraviolet scanning of authorized chole~tenone 2．4 胆甾_4_烯．3．酮的应用前景 胆甾 4．烯一3酮是一种制药原料，可以用它作为 f体合成多种激素类药物 用生物转化法生产胆甾 4·烯 3酮具有转化率高，产 物单一 明确，反应条件 简单等优点，利用合适的反应器可以尝试较大规模 的制备 参考文献： 带均呈棕褐色 本实验中喷洒显色剂 B后可看到薄 板 卜只有两条谱带，而且明显分离 喷洒显色剂 A 后可鉴别出前面那条为胆 甾一4一烯一3酮 在 254 nm 紫外灯下观察，可看到黑色无荧光部分即为胆甾·4· 烯一3一酮的谱带 2 3 2 紫外扫 描 图谱 虽然反应用的是直接由发酵 上清液盐析所得 粗酶，但由于该菌株在发酵液巾只积累胆固醇氧化 酶，所以 可以用粗酶怍为转 化反应用酶 为 r证叫 转化所得产物就是胆甾一4．烯．3．酮．对产物作丁眭质 鉴定 图8和嘲9是胆甾．4．烯一3一酮标准样品和转化 产物的紧外扫描罔谱 可 看到，纯化产物与标样的紧外吸收图谱几 乎相同 圉 9 制备产物紫外扫描 Fig．9 Ultr*dvitflet scaning of prepared cholestenone 蛋黄在食品工业巾应用广泛，但其高含量的胆 同醇却使许多人望而却步．利用胆同醇氧化酶处理 后不仅降低 r其中的胆同醇含量，而且其生成产物 胆甾 4烯一3一酮具有抗肥胖、降血脂和保肝等功能， 幽此可 用柬生产系列保健食品 1]Suzuki Kmllo 4 Chole~ten 3 on for the Contrd 0f Ohes Lty P] 世界专利：WO 93 12 798 [： Myamoto Itaru Toyoda Kengo ch。leste『l0ne Manufactu wkh Cholescer。L()xida f Rhod。c cus_el 858 3 J KashimaMinoru，Kinoshlta Tosha．InaokaYasunofi．et al Chdmt啪 n㈨fo Treatment ofIAvetIN,eases[P] 日本专利：JP 95 69．898 【4一1wabuchl Hisao．Hirose Taku Ant[，keratinization effect 0f Chdmt㈣ es[P]． 日堆等利：JP 95 109、216 [5 J BACKI UND S，RANTALA M．Lec[thi兀／Propan01 based micrD mu1 i ed a d】a f0⋯ holesterol。xida~e-cacalv d reac， ：ion[】J Colloid Po|ym So1．1995．273 293～297 【61 Gun Hedstrom J Peter Slotte Enzyme-Catalyzed OxidacI。n。f Ch。l髓terol in PhysicaI1v Charact i ed Wa1er in( l Mi㈣ u【． slons[J Biotechnology and Bioengineering，1992，39：218～224 l 7 J Wen Hslung Liu，e／al Bioconverslon of cholesterol∞choles~4 e n_l’_3 0㈨ n aque。us／0rganIc solve n1 t phase T~cto,-s[J]En． zyme and Microbial Technology．1996．18：184～189． (责任编辑：朱 明) 维普资讯 http://www.cqvip.com