药理学实验方法

药理学实验方法 药理学实验方法 第－讲 实验动物的选择 在药理学实验中，要根据实验目的，选择不同动物，常用动物有： １、青蛙和蟾蜍 心脏（离体、在体）实验, 制备坐骨Ｎ－腓肠标本等。 ２、小白鼠： 药物初筛：镇痛、耐缺氧、抗肿瘤药物、LD５０测定、避孕药实验等。 ３、大白鼠： 抗炎作用，大白鼠踝关节肿胀实验， 血压测量，胆管插管等。 长期性毒性试验。 ４、豚鼠： 对组胺敏感，并易于致敏，常用抗过敏药（平喘药、抗组胺药）实验。离体心房、心脏、肠管实验等。 豚鼠对结核菌也敏感，也用于抗结核病药物实验。 5、​ 兔： 家兔易得，驯服，便于静脉注射和灌胃，常用于观察药物对心脏的作用和对CNS的作用。 又由于其体温变化较敏感，也常用于体温实验及热原检查。 家兔也常用于避孕药实验。 6、​ 猫： 猫的血压比较稳定，具有咳咳嗽反射和呕吐动作。因而常用于心血管药物实验和镇咳药、镇吐药实验。 7、​ 狗： 狗的血压比较稳定，常用于降压药、升压药和抗休克药实验。 狗比较容易驯服，最适用于慢性实验。手术造瘘（胃、肠）以便观察药物对胃肠蠕动和分泌的影响。 此外，长期毒性实验也常用狗来进行。 * 附:给药途径及剂量限制 1. 小白鼠 （1）​ 灌畏法:0.1～0.25ml／10g体重。 （2）​ 皮下注射：0.1～0.3ml／10g体重。 （3）​ 肌肉注射：0.2ml／每侧。 （4）​ 腔注射：0.1～0.25ml／10g体重。 （5）​ 静脉注射：0.05～0.1ml／10g体重。 1.​ 大白鼠 （1） 灌畏法:2.0ml／10og体重。<3.0ml/只。 （2） 腔注射：0.1～0.25ml／10g体重。 第二讲 实验动物的麻醉和处死 1、​ 各种实验动物的麻醉药物和麻醉方法 1、乙醚 乙醚为挥发性麻醉药。常用于小动物（小鼠）的麻醉。使用方法有：开放发和封闭法。 2、​ 戊巴比妥钠 戊巴比妥钠的作用稳定、麻醉持续时间中等(一次给药可维持作用2～4 hr)，一般实验均可使用。 常用其3% 溶液。 各种动物所用剂量如下： 狗：30mg/kg， iv 猫、兔：30～40mg/kg，iv或ip 大鼠、小鼠：40～50mg/kg，ip 3、​ 乌拉坦 乌拉坦的作用较弱，对呼吸的抑制作用小是其优点。是动物实验常用的麻醉药。 各种动物所用剂量如下： 家兔、大鼠：1.0～1.5 g/kg，iv或ip 4、​ 氯醛糖 氯醛糖对血压和神经反射影响较小，适用于心血管实验。 但其溶解度小，常用浓度为1% 。 动物所用剂量如下： 狗、猫：80～100mg./kg，iv或ip。常与戊巴比妥钠或乌拉坦合用，合用时应减少剂量。 2、​ 动物的处死 （1） ​ 乙醚吸入法 小鼠、大鼠：吸入乙醚后20～30秒钟进入麻醉壮态，3～5分钟死亡。 鸽、猫等较大动物也可用次法处死。 但需注意以下两点： 1·​ 当用次法处死豚鼠时，脑和肺部可出现小出血点，在进行病理解剖时要特别注意。 2·​ 焚烧动物尸体时要注意防止火灾发生。 (2) ​ 二氧化碳吸入法 可将动物装入减压干燥器或塑料袋内，通以CO2，可在本30秒～3分钟内杀死动物。 豚鼠、猫、鸽等均可用此法处死。 （3） ​ 注射麻醉法 常用药物为巴比妥钠，各种动物所需剂量如下： 鸽：100mg/kg，ip。 猫：60～120mg/kg，iv或ip。 狗：100mg/kg，iv。 兔：75～100mg/kg，iv。 （4） ​ 颈椎脱臼法 此法常用于小白鼠的处死。 （5） ​ 空气栓塞法 将空气注入静脉或心腔内造成栓塞。各种动物所需剂量如下： 兔、猫：10～20ml/只。 狗：70～150ml/只。 （6） ​ 心脏取血法 豚鼠、猴可用此法。 （7） ​ 大量放血法 兔、猫、猴、狗等可用此法。 （8） ​ 电击法 220 V交流电，接上粗针头，一头插入颈部皮下，一头插入腰部皮下，通以电流。 第三讲 药理学实验设计 第一节 药理学实验设计的基本 实验设计的三大原则──重复，随机，对照。 （1）​ 重复 影响因素设法控制： 1、​ 动物：品种、体重、年令、性别、饲养条件。…… 2、​ 药物：批号、纯度、剂量、注射容量、速度。…… 3、​ 仪器：灵敏度、精确度、电压稳定性。…… 4、​ 其它：室温、气压、季节、上、下午。…… 条件控制越严格，重复性越高，但样品的代性越差，这是一个不可避免的矛盾。一般先严后松，逐渐扩大实验范围。 （2）​ 随机 随机分组的目的，使各组间不受主观因素的影响，方法：编号抽签或随机数字表法。 目前主张“均衡下的随机”，即先将主要因素（体重， 性别等）均衡归类分档，再将难控制的因素（活泼程度 饥饱程度 疲劳程度 性周期……）随机安排。 （3）​ 对照 1、 ​ 阴性对照（空白对照）──N.S. 2、阳性对照（品组），目的是查明： （1）​ 实验条件是不是发生了改变。 （2）​ 判断和对比试药的作用。 注意： （1） 同时，同地，同条件下进行对照。 （2）统计学指出：实验组与对照组例数相等时最节省动物。因此，对照组使用较少动物是不妥当的。 第二节 预试与筛选 （1） ​ 预试 目的：了解各种因素对实验的影响，找出最适当的用药计量，最适实验条件（温度，刺激强度，营养液配方……）。为正式实验提供必要的准备。 应注意的问题： 1.​ 实验的稳定性：用变异系数衡量。 S 变异系数 CV= ── X 变异系数越小，可重复性越强。 列如： 某降压药降压结果为:30 5 mm Hg (猫) 25 9 mm Hg (兔) 变异系数 CV(猫)= 5/30 =16.7% CV(兔) = 9/25 = 36% 因此,做降压药实验用猫较兔为好。 2 .实验灵敏性：用因变系数衡量。 E2－E1 因变系数CI = ──────── ， log D2 －log D1 可反映出实验的灵敏度。 D1’ D2为两个不同剂量。 E1 E2为两个不同反应强度。 例如，某利尿药水负荷实验结果如下表： 负荷水种类 利尿药剂量 尿量 生理盐水 2.0 mg/kg 12.4 ml (A) 4.0mg/kg 19.6 ml 自来水 2.0mg/kg 15.6 ml (B) 4.0mg/kg 20.9 ml 19.6 – 12.4 CIA = = 23.9 log 4 – log 2 20.9 – 15.6 CIB = = 17.6 log 4 – log 2 从以上实验结果应可以看出，本实验应该使用生理盐水作负荷剂。 （二） 筛选 是在预试或以往经验的基础上，用少量动物对多种药物进行实验。筛选常在已知反应率的基础上进行，一般以P〈0.1作为筛选合格的标准。 1、​ 保护实验： 筛选解毒药时，将解毒药+毒物量（LD50），如连用4只动物均不死亡，表明该药有一定解毒作用（P < 0.1）,如一只死亡，再加三只，如三只均无死亡，也认为筛选合格。总之，死亡率为0/4、1/7、2/9、3/12、4/14时都可认为合格（P < 0.1）。 2. ​ 阳性率判别实验： 筛选实验结果 阳性率判别（%） 筛选实验结果 阳性率判别（%） 0/2 1/4 2/6 〈70 2/2 3/4 4/6 〉30 0/3 1/5 2/7 〈60 3/3 4/5 5/7 〉40 0/4 1/7 2/9 〈50 4/4 6/7 7/9 〉50 0/5 1/9 2/12 〈40 5/5 8/9 10/12 〉60 0/6 1/11 2/15 〈32 6/6 10/11 13/15 〉68 0/7 1/12 2/16 〈30 7/7 1/12 14/16 〉70 例如： 欲筛选疗效在先60%以上药物，如 连续3只均无效，该药即可筛弃，如连续5只均有效，筛选合格。错误筛选率〈10%。 第3节 实验设计中样本数问题 (一) 一般情况下选取的样本数： （1）​ 小动物（小鼠、大鼠、鱼、蛙）：每组10～30例，计量资料每组不少于10例，计数资料每组不少于30例。 （2）​ 中等动物（兔、豚鼠）：每组8～12例。计量资料每组不少于6例，计数资料每组不少于20例。 （3）​ 大动物（犬、猫、猴、羊）：每组5～15例。 （2）​ 按统计学原则测算样本数量（达到P < 0.05） (1)​  两组均数对比（计量资料） s 95% 把握时，N = 26 (--------------- )2 + 1.4 x1 - x2 S 90% 把握时，N = 21 (--------------- )2 + 1.5 x1 - x2 S 80% 把握时, N = 15.6 ( ------------------ )2 + 1.6 x1 - x2 N 为每组估计例数, 总例数为2 N。 X1 - X2为原均数之差(预试所得结果)。 S为原来两组总标准差。 （n1 - 1）s12 + （n2 - 1）s22 ────────────── S = n1 + n2 - 1 s1 + s2 或近似为：S ------------- 2 例如某次预试，每组用10只动物，所得结果为 : 甲组 s = 23.88.8, 乙组 s = 18.8 6.4。 按80%把握,要p<0.05效果,问各组应该用多少例? 解: X1 - X2 = 23.8 - 18.8 = 5 8.8 + 6.4 S = -------------------------- = 7.6 2 7.6 N = 15.6 ( -------------------- )2 + 1.6 = 37.6 5 即,每组38例,共76例。 （2）​ 计数资料（百分率为指标）对比 1 （p1 + p2 1）2 N = R × ( p1 p2)2 R值可查表： 质反应两组对比R值 把握度 80% 90% 95% p = 0.05 3.92 5.25 6.52 P = 0.01 5.86 7.45 8.95 如要求把握度为80%，达到P〈0.05 水平 , R = 3.92 例如: 已知A药平喘率为90%, B药平喘率为60% , 欲求80% 把握， 取P<0.05水平,求每组样本数。 P 1 = 0.9 P2 = 0.6 1 ( 0.9 + 0.6 1)2 N (80, 0.05) = 3.92×------------------------- = 32.7 33例 (0.9 0.6 )2 每组33例,两组共66例。 第4节 优选法设计 优选法是一种快速的选择最优条件的方法。 例如，欲选择某实验的最优水浴温度（以三次反应误差率最小为优选指标），方法如下： 1·先规定最高，最低范围（a，b），并计算x1，x2两点。 x1 = a + 0.618 × (b - a) x2 = a + b - x1 设 a = 24℃, b = 45 ℃ x1 = 24 + 0.618 × ( 45 - 24 ) = 37 ℃ x2 = 24 +45 - 37 = 32 ℃ 现用 37 ℃ 和 32 ℃ 分别进行试验，如果试验结果37 ℃比32 ℃ 好，下一步： 2·分步选择xi点： 效果最好者为中点M 大于中点的较高点为H 小于中点的较低点为L 下次应试的xi点：xi = H - M + L 上例 37 ℃比32 ℃ 好，则M = 37，H = 45，L = 32 x3 = 45 - 37 + 32 = 40 ℃ 此时应 40 ℃ 和 37 ℃ 再试,如试验结果 40 ℃ 不如 37 ℃ ，仍以 37 ℃ 为M点。 x 4 : M = 37, H = 40, L = 32 x 4 = 40 - 37 + 32 = 35 ℃ 此时应 35 ℃ 和 37 ℃ 再试,如试验结果35 ℃ 不如 37 ℃，仍以37℃ 为M点。 x5 = 40 - 37 +35 = 38 ℃ 此时应 38 ℃ 和 37 ℃ 再试,如试验结果38℃优于37℃,则以38℃ 为M点。 x6 = 40 - 38 + 37 = 39℃ 如果再试39 ℃不如 38 ℃，此例最优温度应为此38 ℃左右，可取38 ±0.5 ℃ 开始正式实验。 第五节 质反应序贯实验设计 序贯图法（开放型）： 凭经验或予试结果先规定有效与无效指标水平。要想实验某药是否具有抗吐作用，其具体步骤如下： 规定抗吐率（P0）〈 30% 为无效，抗吐率（P1） 〉 60% 为有效。并保证： 作出阳性结论时假阳性率α为0.05; 作出阴性结论时假阴性率β为0.05。 定出两个直线方程： U : Y = a + bx L : Y = －a + bx 查表1，a = 2.35, b = 0.45 U:Y = 2.35 +0.45 x L:Y= －2.35 + 0.45 x A Y 7 闭锁型 不 6 * B 中点 吐 5 Y = 2.35 +0.45 x 猫 4 c 数 3 2 Y= －2.35 + 0.45 x 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 3N X ( 实 验 猫 数) 第6节 实验中的剂量设计 （1） ​ 剂量的选择 1. ​ 进行药效对比时,一般选择中效剂量。 2. ​ 进行解毒实验或拮抗实验时，剂量应偏高些。 3. ​ 进行协同作用实验时，剂量应偏低些。 4. ​ 探索最适剂量时，应由小 大： （1） ​ 离体器官实验一般按3倍或10倍递增。 例如： stock solution organ bath final conc. 5 μl of 10－6 M 5 ml 10－9 M + 10 μl of 10－6 M 5 ml 3×10－9 M + 3.5 μl of 10－5 M 5 ml 10－8 M + 10 μl of 10－5 M 5 ml 3×10－8 M + 3.5 μl of 10－4M 5 ml 10－7 M + 10 μl of 10－4 M 5 ml 3×10－7 M + 3.5 μl of 10－3 M 5 ml 10－6 M + 10 μl of 10－3 M 5 ml 3×10－6 M ……………… 5 ml ………… (2) ​ 整体动物实验剂量按2倍或√10 = 3.16倍递增。 ** 只少4个剂量。 3×10-8 mol Ach/L 0.1 ml 1×10-11 mol Ach/L + 3×10-8 mol Ach/L 0.2 ml 3×10-11 mol Ach/L + 3×10-7 mol Ach/L 0.07 ml 1×10-10 mol Ach/L + 3×10-7 mol Ach/L 0.2 ml 3×10-10 mol Ach/L +3×10-6 mol Ach/L 0.07 ml 1×10-9 mol Ach/L +3×10-6 mol Ach/L 0.2 ml 3×10-9 mol Ach/L (2) ​ 动物间剂量换算 动物间剂量换可按下面公式进行： RB WA dB= dA × × ( )1/3 RA WB dA. d B为A.B两种动物每公斤体重剂量 ( mg/kg )。 WA.W B为动物体重(kg)值。 RA. RB为动物体重系数(R与体表面积(M2)/体重(kg)的2/3次方成正比。可由下表查到： 动物种类 小鼠 大鼠 豚鼠 兔 猫 猴 犬 人 体重系数 59 90 99 93 82 111 104 100 （R） 例1 已知20 g 小鼠需用3.2 mg , 求12 kg及20 kg的犬各需用多少mg ? dA. = 3.2 mg /0.02 kg = 160 mg/kg , 查表 RA.= 59, RB = 104. WA.= 0.02 kg , W B = 12 kg (20 kg),代入公式: 104 0.02 dB12 = 160 × × ( )1/3 = 33.4 mg/kg 59 12 104 0.02 dB20 = 160 × × ( ) 1/3 = 28.2 mg/kg 59 20 例2 已知12 kg成年家犬需用剂量为33.mg/kg, 求4 kg幼犬和20 kg大犬所需的剂量? dA. = 33 mg/kg , RA. = RB = 104 ,WA.= 12 kg, .W B = 4(20) kg dB4 = 33 ×104/104 × (12/4 )1/3 = 47.6 mg/kg dB20 =33 ×104/104 × (12/20)1/3 = 27.8 mg/kg *​ 人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表 小鼠 20 g 大鼠200 g 豚鼠400g 家兔1.5 kg 猫 2.0 kg 猴 4.0 kg 狗 12 kg 人 70 kg 小鼠 (20 g) 1.0 7.0 12.25 27.8 29.7 64.1 124.2 387.9 大鼠 (200g) 0.14 1.0 1.74 3.9 4.2 9.2 17.8 56.0 豚鼠 (400g) 0.08 0.57 1.0 2.25 2.4 5.2 4.2 31.5 家兔 (1.5 kg) 0.04 0.25 0.44 1.0 1.08 2.4 4.5 14.2 猫 (2.0 kg) 0.03 0.23 0.41 0.92 1.0 2.2 4.1 13.0 猴 (4.0 kg) 0.016 0.11 0.19 0.42 0.45 1.0 1.9 6.1 狗 (12 kg) 0.008 0.06 0.10 0.22 0.23 0.52 1.0 3.1 人 (70 kg) 0.0026 0.018 0.031 0.07 0.078 0.16 0.32 1.0 第四讲 毒性试验 一·急性毒性（50% Lethal Dose，LD50）试验 （一）定义：引起一半实验动物死亡的药物剂量。 （二）意义：LD50反映药物毒性大小的指标。该指标即准确又具有代表性。 （三）测定LD50的原理 质反应的量效曲线的几种形式。 真数剂量 Log LD50 对数剂量 从对数剂量与死亡频数的正态分布中可知, LgLD50恰在横轴中点, 按此剂量给药, 动物恰好死亡一半, 因在正态分布中, 横轴中点恰是均数所在处, 所以LgLD50恰是全部实验动物最小致死剂量对数的平均值（即真数剂量的几何平均值）。 从对数剂量与死亡率关系的正S型曲线中可知, LgLD50恰为S型曲线中点所对应的横轴上的对数值, 因此S型曲线中点所对应的纵轴(死亡率)恰为50% 。 据此，如果求出正态曲线横轴中点的对数值或正S型曲线中点 所对应的横轴上的对数值, 即为LgLD50。 · 测定LD50就是测定平均最小致死量。 例如： 鼠号 1 2 3 4 最小致死量 5 6 7 8 （mg） = （5+6+7+8）÷4 = 6.5 mg 如果给予6.5mg, 1、2号鼠死亡; 3、4号鼠存活。6.5mg既是平均最小致死量又是半数致死量。 看起来测定半数致死量似乎很简单，其实则不然。因为，对于大多数药物来说，要想准确测出最小致死量是不可能的，这是因为除了洋地黄等极少数药物外， 绝大多数药物都不能使动物立即死亡。但我们可以将动物分成若干组，每组给予不同剂量，观察一段时间后记录各组死亡数，用适当的公式可以计算出半数致死量。为了把要测定的LD50值包括在内，一般各组间剂量之差按等比级数给予。 要计算几个等比数量的均数，不能用求算数均数的方法进行，必须求其几何均数，即对数剂量的算数均数。请看下列一组数据： x1 x2 x3 x4 1 10 100 1000 1+10+100+1000 算数均数 = = 277.75 4 这显然不能作为半数致死量。 4 几何均数 = 1 ×10×100×1000 = 31.62 Lg1 + Lg10 + Lg100 + Lg1000 4 = 1.5 反对数 101.5 = 31.62 如将此量给予上述动物, 刚好有两只死亡, 两只存活，为LD50。 （四）测定方法 LD50的测定方法很多，最常用的是寇氏法。 1·计算方法： 计算公式：Lg LD50 = XK －d （∑Pi －0.5） XK ……P = 100%组的对数剂量。 d………对数组间距。 Pi …….各组死亡率。 2．条件： （１）组间剂量等比。 （２）各组动物数相等。 （３）最小剂量组死亡率（Pn） = 0%；最大剂量组死亡率（Pm） = 100% 。如果Pn > 20%，或Pm < 80%则不能使用此法。 （五）测定LD50应注意的问题 1·分组的随机性：各组动物在性别、体重、等要保证均匀一致性。 2·动物及数量：常用小鼠，体重20±2g，雌雄均可。正式实验每组10～20只。 3·剂量应按几何级数排列：临近两组剂量比一般为1：0.7～0.85。测定新药时先将剂距加大（1：0.3～0.5）,初步找出死亡率为0%和100%的剂量。 4·给药途经：以IV. IP. PO.为主。其中必须包括临床推荐给药途径。 5·容量限制：不管哪种途径给药，小白鼠的给药容量不能超过0.2ml/10g。灌胃以不超过0.3 ml/10g为限。 6·观察时间：动物一般在两日内死亡，但应观察7天。同时记录其他反应。 （六）等比溶液的配制 1。相邻两组剂量比为1：r ，如r = 0.85 2．设每组所用药液总量为d, 如每组10只小鼠, 每鼠注射药液0.5 ml , 共需5ml，为留有余地，并使d能被1- r正除，可取d = 6 ml。 3．设上限组（1号液）浓度为C，整个实验所需浓度为C的药液总量为D，则： 4．取出d量(6ml)为1号液, 余量加水d至D, 再取d量为2号液。 5．余量加水d至D, 再取d量为3号液。 6．余量加水d至D, 再取d量为4号液。 7．余量加水d至D, 再取d量为5号液。 8．……………………..，…………………….. 计算LD50公式的来源（Karber氏法） 此证明详见公式演变部分。可据对数剂量与死亡率的关系曲线通过面积法求出此公式。 Xi F XK B X d 上图横坐标为对数剂量[x], 纵坐标为死亡率（P），G为正S形曲线中点，它对应的纵坐标H点P = 50%(0.5)，横坐标的F点X = LgLD50；A点P = 0， D点P = 1，B点Xk为P = 100%时的对数剂量，由图可知：： 矩形AFED = AF . AD = LgLD50 × 1 = LgLD50 曲边△XiFG = GCE （三边对应相等） ∴矩形AFED = 曲边形AXiCD = LgLD50 则LgLD50 = 矩形AXKCD － 曲边形XiXKC 1 曲边形X1XKC = d ∑ （pi ＋ pi +1）------相当于多个梯形面积的总和。 2 又矩形AXKCD = AXK . AD = XK × 1 = XK 1 ∴LgLD50 = XK － d ∑ （ pi + pi + 1 ） 2 上述推导过程可用直观图形表示: LgLD50 = ＝ ＝ － 公式的演变 1 LgLD50 = XK －d ∑(Pi ＋Pi ＋1) 2 1 = XK － d ［（P1＋P2） ＋（P2 ＋P3） ＋…（PK - 2+ Pk – 1）+（Pk - 1+ Pk）］ 2 1 = XK － d ［P1＋P2 ＋P2 ＋P3 ＋…PK －2+ Pk － 1+Pk － 1+ Pk］ 2 1 = XK － d ［2∑Pi －（P1 ＋Pk）］ 2 = XK －d （∑pi － 0.5） P1 = 0%；Pk = 100%（1.0） *​  LD50简化测定方法 计算公式: *​ D……高剂量组剂量 (mg, g/kg). *​ d…….低剂量组剂量 (mg, g/kg). *​ A…….高剂量组死亡率的机率单位. *​ a…….低剂量组死亡率的机率单位. 例如, 用灌胃法测定某药的LD50, 结果如下： 高剂量（D=120mg/kg）组， 死17只， 活3只，死亡率 = 85%，查表, 机率单位A = 6.03; 低剂量（d=100mg/kg）组， 死8只， 活12只，死亡率 = 40%，查表, 机率单位a = 4.75; 附：中草药毒性实验 由于中草药毒性低，有部分中草药的LD50不能测出，常测其最大耐受量。 本法取体重18～22g的健康小鼠，雌雄各半，随机分几组，每组动物灌服不同浓度的受试药物一次，每只0.5ml，观察7天内动物的中毒反应或有无死亡。以死亡为主要观察指标。如有死亡，则以刚不出现死亡组为准，此时的用药量即为小鼠的最大耐受量。然后按公式计算出耐受量倍数。以耐受人用量口服100倍以上为安全。 计算公式如下： 举例：升麻葛根汤，人的用量是45g/日，每只小鼠的耐受量为2.85 g, 小鼠的平均体重为20g, 观察7天，无一只死亡。 如因受试药物的浓度或体积限制, 预计一次给药无法测出LD50时, 可做一次或一日内最大耐受量试验。既选用拟临床试验的给药途径，以动物能耐受的最大浓度、最大体积的药量一次或一日内2～3次给与动物。如用小鼠，不得少于20只，雌雄各半。要连续观察7天，并详细记录动物反应情况。 常用小白鼠进行实验，体重18～20g，雌雄均可。也可用大白鼠、家兔、猫、狗等。每次5～10只，尾静脉或腹腔注射一定量药物，观察有无不良反应（惊厥、步态不稳、瘫痪、竖毛、呼吸抑制等）或死亡。连续观察24～48 h。 例如，给20g小鼠iv 柴胡注射液0.5 ml不引起死亡，临床用量为2ml，人的体重为50kg，按体重计算小白鼠用量为人用量的625倍。 一般认为，小白鼠最大耐受量相当于人用量的100倍以上就比较安全，可以供临床应用。大部分中草药制剂都是相当安全的。 当归注射液为125倍；金银花注射液为375倍；柴胡注射液为625倍； * 中草药的提纯物毒性增强，都需测LD50.