临床免疫学诊断

null临床免疫学诊断临床免疫学诊断一、血清学试验一、血清学试验null 血清学试验：体外的抗原抗体反应。（一）概述null（1）特异性 （2）可逆性 （3）比例合适，出现可见反应 （4）分为两个阶段： ①特异性结合，快（几 秒到几分），无可见反应； ②出现可见反应，慢（几分到几小时）1．血清学试验的特点：null2．主要影响因素 （1）电解质（2）酸碱度（3）温度过低，影响出现可见反应；过高出现盐析。一般以pH6～9为宜。过高或过低的pH值均可导致假阳性或假阴性结果。最适温度为37℃nullnull（二）凝集反应 颗粒性抗原与相应抗体结合，出现肉眼可见的凝集物。1．凝集反应概念null①玻片法： 定性，已知抗体测未知抗原②试管法： 半定量，用已知抗原测未知抗体的量2. 直接凝集反应nullnull试管凝集反应结果判读 上清液 凝集物 符号 完全澄清 明显、易见 ++++ 澄清 明显、易见 +++ 稍混浊 明显 ++ 混浊 不明显 + 混浊 无 —null效价： 在血清学反应中，抗原抗体结合出现明显反应的最大抗体（或抗原）制剂的稀释度。又称滴度。null3. 间接凝集反应null（三）沉淀试验 可溶性抗原与相应抗体结合，出现肉眼可见的沉淀物。null 定量，临床上常用于IgG、IgM、IgA、C3的测定。1. 单向琼脂扩散试验null 单向琼脂扩散实验nullnull 用于分析和鉴定抗原及抗原、抗体浓度的测定。2. 双向琼脂扩散试验nullnullnullnull 双向琼脂扩散实验nullnull（1）沉淀线吻合： 待检抗原与抗原完全相同； （2）沉淀线相切： 待检抗原中含有与标准抗相同的抗原， 还含有另外的抗原与抗血清对应。 （3）沉淀线相交： 待检抗原与标准抗原不同。三角孔型双扩各种沉淀线的意义null原理在单向扩散试验中，以电泳加速抗原的扩散，并使抗原向一个方向扩散，从而使抗散的抗原与琼脂凝胶中的抗体结合，形成火箭状的沉淀峰。3. 火箭电泳null操作步骤制板、打孔、加样电泳3～5mA/cm，6小时结果观察nullnull 简便、省时、结果重复性好的定量方法。其敏感度可测0.3mg/L。 方法评价null（三）免疫标记技术1．免疫荧光技术将荧光色素标记的特异性抗体上，直接与相应抗原起反应，根据荧光有无来检测抗原。 （1）直接法原 理null缺点： ① 敏感度偏低； ② 检查一种抗原就要制备一种 特异性荧光抗体。优点：① 方法简便； ② 特异性高；方法评价null将荧光素标记抗抗体，待基质标本中的抗原与相应抗体（第一抗体）结合后，再用荧光标记抗抗体（第二抗体）结第一抗体，呈现荧光现象。 （2）间接法原 理null①比直接法敏感性高； ②制备一种荧光抗体可用来检查多种抗原； ③既可用于检测抗原，又可用于检测抗体。优点：方法评价null①易出现非特异性荧光染色； ②方法较麻烦； ③操作时间较长。缺点：常用于各种自身抗体的检测。应用：null2．免疫酶技术（1） 双抗体夹心法将已知抗体包被微量反应板，和待检抗原反应，再加酶标抗体和底物，根据显色反应对抗原进行定性或定量检测。原 理nullnull加酶标抗体加底物抗体包被酶标板加抗原标本抗原与抗体结合酶标抗体与抗原结合底物分解显色操作步骤null 定性：根据显色与否确定； 定量：用酶标仪测定及OD值，根据测得的OD值与标准曲线换算为抗原量。结果判定null（2）间接法：测抗体标本中的待检抗体与固相抗原结合后，利用酶标记抗抗体（抗Ig）进行检测。原 理nullnull加底物底物分解显色酶标抗抗体与结合在抗原上的抗体分子结合加酶标抗抗体抗原与抗体结合加检测血清（抗体）抗原包被酶标板操作步骤nullnullnull3．同位素标记技术 将待测抗原（Ag）和定量的标记抗原（*Ag）与限量的抗体（Ab）进行特异性结合反应，则Ag和*Ag与Ab发生竞争性结合。待测抗原（Ag）与*Ag- Ab结合的复合物（B）成反比例关系，与游离的*Ag（F）成正比例关系。基本原理nullnull分别测定：抗原抗体复合物的放射性强度（B）游离抗原的放射性强度（F）计算结合率[B/（B＋F）]结合率与标本中的抗原量呈函数关系nullnull①敏感度高：能测到ng/L甚至pg/L水平； ②特异性强； ③准确性好，重复性好； ④用血量少。（1）优点：方法评价null放射性污染和较昂贵的仪器。 （2）缺点：二、免疫细胞及其功能检测二、免疫细胞及其功能检测null1．外周血单个核细胞的分离根据单个核细胞与其他细胞的比重不同，将外周血包括淋巴细胞和单核细胞分离。 原 理null操作步骤在加有分层液的试管中加上抗凝血离心2000r/min，20min吸出单个核细胞，洗涤Ficoll分层液离心后外周血细胞示意图null2.T细胞数量检测外周血单个核细胞＋荧光素标记的 兔抗鼠IgG＋具有相应CD分子的T细胞着色计数并计算百分率null正常值：CD3＋ 60～80% CD4＋ 55～60% CD8＋ 20～30% CD4＋/ CD8＋ 2：1null2.B细胞数量检测外周血单个核细胞＋FITC标记的兔抗人IgB细胞着色正常值： 12～30%null3.淋巴细胞转化试验T细胞PHA 培养3天增殖反应3H-TdR测定细胞内同位素含量用于检测机体细胞免疫功能null4.结核菌素试验结核菌素注射受试者前臂内侧皮内红肿硬结＞0.5cm阳性观察局部超敏反应24～48小时后无红肿硬结或＜0.5cm阴性null结核菌素试验结果分析阳性：①对结核杆菌有特异性细胞免疫力； ②机体细胞免疫功能良好。阴性：①对结核杆菌无特异性细胞免疫力； ②排除①后，机体细胞免疫功能低下。