DNA细胞周期检测

nullDNA Analysis By Flow CytometryDNA Analysis By Flow Cytometry 核医学生物技术重点实验室 基本原理概述基本原理概述正常人静止体细胞有46条染色体，相当于7.10-12 pg DNA/细胞核，我们称之为二倍体细胞，而正常增殖细胞则存在不同的DNA含量。在细胞周期(G0，G1，S，G2 ，M)的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化：在G1期，细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体；null进入S期后，DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1和G2期之间；当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期，G2期细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期，因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期；一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个子细胞，这两个子细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期(G0期)，而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。因此，整个复制周期可以描述为G0/G1，S，G2/M期。 null通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M/%，了解细胞的增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。正常细胞具有较恒定的DNA含量，而细胞癌变过程中结构和/或染色体的异常是很常见的。这种变化在流式分析中以DNA倍体指数的形式现出来，这一指数对于肿瘤的早期诊断，交界瘤、间叶组织肿瘤的良恶性判断提供了重要的辅助指标。 流式DNA周期示意图流式DNA周期示意图G0/G1静止期及合成前期S合成期G2/M合成后期及分裂期样本制备样本制备来源于血液、骨髓、体液、灌洗液、外科手术活检、细针穿刺物等的细胞都可用来做DNA分析。新鲜的、冰冻或固定保存的、或常规固定/包埋用于组织检查的样本均可。通常最好的结果来自新鲜或冰冻的标本。用组织切片的好处是可以通过观察常规染色来选择感兴趣的区域，缺点是不能再用抗体染色来鉴别肿瘤细胞和正常基质细胞。实体标本的单细胞制备实体标本的单细胞制备机械法：用剪刀、刀片剪切组织或金属网研磨获取完整的细胞。但该法获取的细胞数量少。 化学药品处理法：利用EDTA或Sodium citrate结合Ca2+或Mg2+等阳离子，破坏细胞间的连接或用Triton X-100、NP-40破坏细胞膜。该法只能取得细胞核，且易出现核凝集。 酶法：利用酶将细胞间的连接物水解，使细胞从组织中分离出。一般常用的为胃蛋白酶及胰蛋白酶。该法也只能取得细胞核。细胞浓度及质量要求细胞浓度及质量要求单细胞和核的最终浓度应约106/ ml。浓度太低，上机时样本的流速不得不提高，这样就会影响检测的CV。浓度太高，则可能导致染料的相对不足，最终使染色不饱和，同样影响CV和检测结果。 制备完成后的标本应用光学显微镜检查其质量：细胞是否聚集或过多的碎片；大多数核有肿瘤样的外观(比如说，不是粒细胞)等。保证足够的肿瘤细胞含量；检测S%时建议的最小可接受比例是20%。固定固定常用70%的冰酒精固定单细胞悬液。应保证样本完全浸没在固定剂中置40C冰箱固定4小时上。 对于甲醛固定的组织切片，应注意甲醛会影响PI与核酸的结合。若同时使用抗体鉴别肿瘤细胞，应选择对抗原无损的固定剂。对许多细胞 表面抗原来说，固定只能在抗体标记之后进行。 染色染色染料的选择取决于流式激光的配置。488nm的激光下应用PI(碘化丙啶)，由于PI也与双链RNA结合，所以分析前样本应用Rnase处理。重要的是染料要足够，以保证饱和结合。PI的推荐浓度是至少20ug/106 个细胞。其最佳浓度为50ug/106 个细胞。在室温<200C下避光孵育30分钟，3小时内上机分析。影响荧光染色的因素影响荧光染色的因素温度：温度高于200C时，即出现温度淬灭。 PH：PI在7.2~7.6，保持荧光染料分子与溶剂间的电离平衡。 荧光染料浓度：染料太少，结合不完全。染料过多，又会出现浓度淬灭现象。 固定剂：醛类固定剂会干扰插入性染料与核酸分子的结合，造成荧光发射强度减弱。 杂质：溴化物、碘化物、硝基苯、铁、银等，对荧光有淬灭作用。 DNA的参考标准DNA的参考标准样本的倍体是根据二倍体细胞峰的标准来计算的。临床标本中常常有一些正常的二倍体核存在，可用来作为标准。但问题是如何判断哪个峰是正常二倍体细胞。事先加入标准参照细胞(如鳖或鸡红细胞)会有助于判断。特殊细胞类型的特异性抗体标记也有助于检出肿瘤群体。标准参照细胞应尽可能早加入标本，与样本一起制备。 DNA检测DNA检测(1)DNA检测采用线性放大。应检查放大器的线性度(如用标准荧光微球、多倍体的肝细胞、有聚集体的固定的淋巴细胞、鸡和鲑鱼红细胞等)。 (2)应每日通过检测标准微球或固定、染色的淋巴细胞的CV来检查仪器调校情况，此CV应<=2%。 (3)DNA直方图的道数值应至少为512。应以正常二倍体细胞的G1峰位置来调节PMT电压值：G1峰道数应不低于最大道数的五分之一，即1024道时的200，512道时的100。null(4)阈值应设在DNA荧光参数上FL3 Peak 30-40。 (5)所有的信号都应被收集，包括从二倍体G1峰道数值1/10处以上的碎片。 (6)收集的细胞总数应在DNA直方图中足够提供10000个核(除外碎片)。DNA直方图越复杂，需要收集的细胞数量越多。若需S期数值，则S期区域至少应有100个细胞。 (7)为获得最佳CV，流速应保持在低速(通常100-300个粒子/秒)。 多参数分析 多参数分析 尽可能地显示FSC vs SSC 的双参数图。碎片常常能被区分开来，用设门去除。制备较好的标本中，炎性细胞常可以和肿瘤细胞区分。 荧光素标记的抗体常被用来区分正常和肿瘤细胞。如上皮性肿瘤中可用抗cytoketatin的染色来鉴定上皮细胞；在非淋巴细胞肿瘤中，正常的炎性细胞可用白细胞共同抗原CD45来区别；淋巴性肿瘤中则可根据肿瘤的分类选择合适的细胞表面抗原。 利用Ki67、PCNA来鉴别G0与G1期、G2与M期。常用术语 常用术语 Coefficient of Variation(CV)：变异系数。不同细胞群体DNA含量的细微差别可能有生物学上的重要意义 DNA index(DI)：DNA指数。DI指的是肿瘤样本G0/G1峰的平均荧光道数与正常人二倍体G0/G1峰的平均荧光道数之间的比值。 Ploidy：倍体。原指染色体数目。流式中用来描述总的DNA含量。二倍体细胞有正常细胞的DNA含量但不除外染色体异常。 判断标准判断标准组织标本： DI=0.9~1.1 二倍体 其余为异倍体。（DI：0.85~0.9或1.1~1.15为近二倍体；DI>1.15为超二倍体；DI<0.85为亚二倍体。） 但对于四倍体和G2/M期的判断，一般用G2/M占G0/G1的20%以上即算四倍体。 浆膜腔脱落细胞良恶性判断标准浆膜腔脱落细胞良恶性判断标准1.出现DNA的非整倍体峰为恶性肿瘤细胞。 2.无明显的非整倍体峰，但有一突出的四倍体峰和大于15%的S期细胞，并伴有G0/G1期CV值大于9%为恶性肿瘤细胞。 3.无明显的非整倍体峰，但 G0/G1期CV值增大，并伴有大于10%~15%的S期和一个突出的四倍体峰，诊断为可疑癌。 结果报告结果报告 报告中至少应包含以下信息： (1)DNA倍体，包括所有群体的DI； (2)主要G1峰的CV； (3)S期比例； (4)必要的简单评价：如细胞数的不足、碎片较多、CV太高等。