自噬在骨肉瘤化疗中作用的体内研究

1 华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科(武汉, 430022) �实验研究� 自噬在骨肉瘤化疗中作用的体内研究 张志才1 � 邵增务1 � 熊蠡茗1 � 杨述华1 � 车彪1 � 邓超1 [摘要] � 目的: 探讨自噬的调节对骨肉瘤化疗的影响。方法:建立裸鼠骨肉瘤动物模型,自噬抑制剂 3 甲基腺嘌呤( 3M A) 和顺铂( DDP)干预肿瘤的生长,观察不同药物对骨肉瘤的生长情况的影响, 检测肿瘤大小变化, H E 染色观察病理现。 结果: 对照组、DDP 组、3MA+ DDP 组 3 组之间用药前后体积的比较差异具有统计学意义。DDP 确实能较有效的抑制肿 瘤的生长, 加入 3M A 干预后能增强其敏感性,肿瘤的生长得到了进一步的抑制。HE 染色见 3MA+ DDP组移植瘤组织 中明显的坏死区。结论: 3MA 联合 DDP 化疗能提高对骨肉瘤细胞的杀伤率。 [关键词] � 自噬; 骨肉瘤; 3MA ;裸鼠 [中图分类号] � R738. 1 � � [文献标识码] � A � � [文章编号] � 1005�0205( 2010) 09�0016�03 The Role of Autophagy in Chemotherapy for Osteosarcoma in vivo ZH A NG Zhicai 1 � SH A O Zengwu 1 � X ION G L iming 1 � YA N G S huhua1 CH E Biao 1 � DENG Chao 1 1Department of O rthopedics, Union H ospital, T ong ji Medical Co lleg e, H uazhong Univ ersit y of Scinence and Techno lo gy , Wuhan 430022, China Abstract � Objective:T o investig ate the effects of r egulat ion of aut ophagy on the chemother apeutic sensitivit y in osteosarco� ma in vivo. Methods:T he animal models o f o steo sarcoma in nude mice were established. 3MA and cisplatin ( DDP ) w ere in� jected into the animals. The g r owt h o f o steo sarcoma w as observ ed by its size. The patho log ic manifest ations were detected by H E staining. Results:There were signif icant differences among the contr ol g roup, DDP group and 3MA+ DDP g roup. DDP could effectively inhibit tumo r g row th. And 3M A could enhance the sensitivity of DDP. HE staining show ed that there w as a clear area of necro sis in the t ransplanted t umo r tissue in 3MA + DDP group. Conclusion: The combination of 3MA and DDP can increase cells death t han exposure to DDP a lone in osteosar coma. Key words � Autophagy; O steosarcoma; 3M A; Nude mice � � 骨肉瘤是常见的恶性的原发骨肿瘤, 预后较差。其多发生 于青少年, 占儿童骨肿瘤的 60% [ 1]。骨肉瘤多发生在骨骼生长 发育的旺盛时期, 恶性程度相当高, 所以是严重影响劳动力并 危及生命的肿瘤之一, 早期诊断和早期治疗具有特别重要的意 义。 新辅助化疗的开展大大的提高了骨肉瘤患者的 5 年生存 率, 降低了复发率和转移率[ 2, 3] , 但是仍有部分患者化疗效果 差,容易复发和转移[4]。随着骨肉瘤新辅助化疗的不断发展, 化疗耐药问的出现, 逐渐成为骨肉瘤化疗的一个现实问题, 寻找如何解决多耐药的逆转方法将成为骨肉瘤化疗的新热点。 自噬被认为是真核细胞中广泛存在的降解/再循环系统。 而参与自噬过程的信号转导分子非常多, 并且其网络结构相当 复杂, 目前尚未完全被我们所了解。如 T OR 信号通路和 Class P I3K / PKB( I 型磷脂酰肌醇 3 激酶/蛋白激酶 B)途径都参与 了自噬的负性调节[5]。3 甲基腺嘌呤 ( 3MA )为 III 型 PI3K 的 抑制剂, 能特异性阻断自噬泡与溶酶体的融合, 广泛作为自噬 的抑制剂[ 6, 7]。自噬在正常细胞发育、对环境刺激改变的反应 以及肿瘤发生发展中占重要地位, 同样在细菌和病毒感染、神 经变性疾病和心血管疾病等疾病中起一定作用[ 8]。 1� 材料与方法 1. 1 � 细胞培养 MG63骨肉瘤细胞株购自武汉大学中国典藏培养物保藏中 心。MG63 于含 10% 小牛血清的 RPMI�1640 培养基 ( 包含 100U / ml青霉素和 100�g/ ml链霉素)中, 在 37 ! , 5% CO2 的饱 和湿度条件下培养。每 2 天换液传代 1 次, 使其保持对数生长 状态,去对数生长期细胞进行实验。 1. 2 � 骨肉瘤模型的建立 1. 2. 1 � 动物饲养: ALB/ C�nu 小鼠 15 只,购于湖北省疾控中心 实验动物研究中心, 雄性, 日龄 35d, 体重 18~ 24g , SPF 级。许 可证号: SCXK (鄂) 2008�0005; 质量合格证号: NO . 00001949。 所有裸鼠均饲养于华中科技大学同济医学院动物中心部 SPF 级设施中,动物设施使用许可证号: SYXK (鄂) 2004�0028; 设施 使用证明号: NO. 00002116。 1. 2. 2 � 细胞悬液法造模: 收集对数生长期的 M G63 骨肉瘤细 胞, PBS 溶液洗涤 2 次, 调整细胞悬液浓度为 1∀ 108 / ml, 使用 6 号针头吸取 0. 1ml细胞悬液, 皮下注射于裸鼠腋下, SPF 级环 境饲养 2 周。 1. 3 � 药物干预 15 只裸鼠均种瘤成功,随机分为3 组: 阴性对照组、DDP组 和 3M A+ DDP组, 每组 5 只。阴性对照组以等体积生理盐水 16 Chinese J T rad Med T raum & Orth op, S ep 2010, Vol 18, No 09 Administrator 下划线 Administrator 下划线 Administrator 下划线 Administrator 高亮 Administrator 高亮 Administrator 高亮 Administrator 高亮 Administrator 高亮 Administrator 高亮 Administrator 高亮 Administrator 高亮 Administrator 高亮 代替, DDP组腹腔注射 DDP 剂量为 2mg/ kg, 3M A+ DDP 组腹 腔注射 3MA( 20mmo l/ kg ) + DDP( 2mg/ kg)。 1. 4� 观察指标 药物干预后逐日观察裸鼠的一般情况及局部情况, 测量肿 瘤局部大小, 1 周后裸鼠颈椎脱臼法处死 ,取出肿瘤标本测量大 小, 行石蜡包埋、切片、HE 染色, 光镜观察。肿瘤体积计算方 法: 体积= 0. 5 ∀ 短径 2 ∀ 长径。 1. 5� 统计学方法 采用 SPSS12. 0统计学软件对数据进行处理和分析, 多组 之间的比较采用单因素方差分析, P< 0. 05 为差异有统计学意 义。 2 � 结果 2. 1� 药物对裸鼠一般情况的影响 逐日观察各组裸鼠的一般情况, 模型建立 2 周时, 15 只裸 鼠均种瘤成功, 裸鼠均无消瘦, 生活习性无明显改变。皮下移 植瘤呈分叶结节状, 质地较软, 有一定的活动度, 周围血供丰 富。药物干预后, 无死亡裸鼠,所有裸鼠均未见明显消瘦, 阴性 对照组裸鼠的活动能力稍下降 ,生活习性无明显变化, 其他两 组裸鼠活动能力及生活习性无明显变化。 2. 2� 药物对裸鼠肿瘤体积的影响(见表 1) 表 1 � 不同药物对骨肉瘤动物模型中肿瘤体积的影响 肿瘤体积( mm3 ) 用药前 用药后 前后比较 P值 对照组 87. 45# 1. 69 101. 80 # 3. 86 14. 35 # 4. 15 P< 0. 01 DDP组 88. 47# 2. 84 72. 61 # 1. 36 �15. 87# 3. 38 P< 0. 01 3MA+ DDP 组 89. 71# 3. 68 60. 17 # 1. 91 �29. 54# 5. 11 P< 0. 01 � 各组用药前后体积比较差异有统计学意义( P < 0. 01) 如表 1 所示, 对照组用药后肿瘤体积有所增加, DDP 组和 3MA+ DDP 组用药后肿瘤体积均有所减小, 其中 3MA+ DDP 组体积减少的更为明显 , 3 组之间用药前后比较差异具有统计 学意义( P< 0. 05)。提示 DDP 确实能够有效的抑制骨肉瘤细 胞在裸鼠体内的生长, 而且 3M A 的加入能增强其敏感性,进一 步抑制肿瘤的生长。 2. 3� 各组肿瘤 HE 染色标本 � � 图 1 对照组肿 瘤组织切片 HE 染色( ∀ 200) 图 2 DDP 组肿 瘤组织切片 HE 染色( ∀ 200) 图 3 3MA + DDP 组肿瘤组 织切片 HE 染 色( ∀ 200) 如图 1 所示, 对照组中骨肉瘤细胞呈梭形或不规则形, 细 胞大小不等, 核不规则,大而且深染, 可见病理性核分裂像。如 图 2 所示, DDP组移植瘤组织中可见肿瘤细胞排列较稀疏, 染 色较浅, 并且可见部分坏死区。如图 3 所示, 3MA+ DDP 组移 植瘤组织中可见肿瘤内细胞稀疏,淡染, 且可见明显的坏死区。 提示 DDP 能导致骨肉瘤组织发生坏死, 而 3M A 能增强 DDP 对骨肉瘤的杀伤作用。 3� 讨论 近年来,国内外的许多研究证实自噬在正常细胞发育、对 环境刺激改变的反应以及肿瘤发生发展中占重要地位[9]。然 而自噬是否是抗肿瘤药诱导细胞死亡的机制还存在很大的争 议。因为自噬发生在肿瘤细胞死亡之前, 不能断定是它杀死细 胞的,也有可能是细胞生存的一种机制。自噬是肿瘤细胞能在 血供、营养和生长因子不足的情况下得以生存的重要途径[ 10] , 阻断这条生存途径可能是杀死肿瘤细胞的一个方法。Lum 等[11]的研究表明, 当肿瘤细胞的生存环境遭到破坏时, 自噬的 强度会增加来抑制细胞的死亡; 而此时如抑制自噬 , 这些肿瘤 细胞将发生凋亡。所以, 当肿瘤细胞能量缺乏时, 自噬可以通 过抑制凋亡来保护细胞。还有研究表明, 自噬能保护肿瘤细胞 免受电离辐射的伤害[12] , 是通过清除受损的大分子和线粒体等 细胞器来抵抗凋亡,能让变异细胞生存[ 13]。增加自噬可提高实 体瘤的生长,降低自噬可限制肿瘤生长。 本研究应用常用化疗药物 DDP 和抑制自噬常用药物 3MA 干预骨肉瘤动物模型,观察自噬在骨肉瘤化疗中的作用。本实 验显示, 用药 1 周后 3MA 联合使用组的肿瘤体积减少与单用 DDP 组相比有显著的降低( P< 0. 01) , 这表明 DDP 与 3MA 的 联合能提高对肿瘤细胞的杀伤率。其可能机制是 3MA 的应用 抑制了肿瘤细胞内自噬的发生,减少了自噬对受损细胞器的清 理功能,减弱了此时自噬对肿瘤细胞的保护作用, 从而增加了 肿瘤细胞的死亡率。 病理学 HE 染色观察结果显示接受 DDP 和 3M A 联合治 疗的裸鼠肿瘤组织出现大片坏死, 肿瘤细胞稀疏、淡染。表明 3MA 抑制了自噬的发生, 从而导致肿瘤细胞不能通过自噬的方 式来对抗营养缺乏和缺氧, 实体肿瘤内部血供不良 , 进而出现 大片坏死,生长停滞。尽管其具体机制尚不明确, 但从本实验 的体内研究以及一定的体外细胞学研究来看, 自噬的干预确实 能有效的调节顺铂对骨肉瘤的化疗敏感性。这对骨肉瘤化疗 疗效停滞不前的现状是一个令人鼓舞的前景。根据本实验研 究结果,证明 3MA 和 DDP合用, 可以使 MG63 骨肉瘤移植瘤 生长得到明显的抑制,但能否提高荷瘤动物的生存率和生存时 间还需要进一步的研究。 在肿瘤发生发展过程中, 自噬扮演着不同的角色, 对不同 的细胞、相同细胞不同的外部因素、肿瘤不同的发展阶段自噬 的作用可能不同。随着基因工程等技术的不断发展, 对自噬的 检测及其信号传导研究将会不断加深, 将更深入的了解自噬与 疾病之间的关系。相信对自噬更全面和深入的研究将为肿瘤 发病机制研究和其临床治疗开辟一片新天地。 参考文献 [ 1 ] � SCOT LANDI K, PICCI P, KOVAR H . 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(收稿日期: 2010�04�27) 1 中国人民解放军第 175医院 厦门大学附属东南医院(福建 漳州, 363000) �短篇报道� 左肱骨头软骨粘液样纤维瘤 1例 陈揭剑1 � 林坤山1 � 吴进1 [关键词] � 纤维瘤; 粘液样;软骨; 肱骨头 [中图分类号] � R738. 3 � � [文献标识码] � B � � [文章编号] � 1005�0205( 2010) 09�0018�01 1 � 病例 患者, 男, 24 岁。进行性左肩部酸痛半年, 加重 2 月入院。 体检: 左肩轻度肿胀,局部皮温轻度升高, 左肱骨大结节处压痛 明显, 左上肢纵向叩击痛 ( + )。左肩关节正位片示: 左肱骨头 偏心性轻度膨胀性骨质破坏, 分界清, 可见骨性间隔, 未见明显 钙化及明显骨膜反应。X 线诊断: 左肱骨头病变, 考虑骨巨细 胞瘤可能, 建议进一步检查。进一步行左肩关节 MRI平扫+ 增 强扫描检查示 : 左肱骨头- 大结节处见偏心性膨胀性骨质破 坏, 范围约 3. 3cm ∀ 4. 8cm, 边界清,局部破出骨皮质外, 内可见 多发细线样分隔, 增强扫描病灶边缘及分隔可见明显强化。 MRI 诊断:右肱骨近端膨胀性骨质破坏, 考虑骨巨细胞瘤可能 性大。 术中所见: 左肱骨头见一大小约 3cm ∀ 3cm 灰白色肿块, 质 硬,无明显包膜,表面血运丰富, 与周围组织粘连较紧密。术后 病理诊断: 左肱骨近端软骨粘液纤维瘤。 2 � 讨论 软骨粘液样纤维瘤是一种罕见的良性软骨瘤 ,在所有的原 发性骨肿瘤中不到 1%。发病年龄通常在 10~ 30 岁之间,男女 发病率的比例是 1. 5: 1。一项针对 278 例软骨粘液样纤维瘤的 研究表明一半以上的软骨粘液样纤维瘤发生于长骨, 且以膝关 节周围最为好发, 尤其是胫骨干骺端近端[ 1, 2]。1948 年 Jaffe 等[ 3]首先报道, 因肿瘤内主要由成软骨性结缔组织组成, 基质 中以粘液样组织为主, 并伴有胶原纤维组织,命名为软骨黏液 纤维瘤。临床症状主要表现为局部肿胀变形, 伴有轻度疼痛, 疼痛为间歇性,局部压痛轻微[ 4]。 研究表明,在单纯病灶刮除、病灶切除、病灶刮除+ 同种异 体骨移植、病灶刮除+ 植入聚甲基丙烯酸甲酯等治疗方法中, 单纯的病灶刮除术治疗的复发率最高, 植入同种异体骨或者聚 甲基丙烯酸甲酯后则明显减少复发率[ 5]。对此例患者,我们采 用了肿瘤切除+ 刮除术, 辅以无水酒精灭活, 并以同种自体骨 + 异体骨充填病灶的治疗方法。软骨黏液样纤维瘤虽不常见, 但其在病理上易与软骨肉瘤混淆, 以致进行了不必要的根治手 术。故综合临床资料、影像学检查、病理检查, 利于正确诊断此 病并指导外科手术治疗。 参考文献 [1] � WU C T , INWARDS C Y, O∃ LAUGHLIN S et al. 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