抑癌基因

肿瘤转移抑制基因 肿瘤转移抑制基因 一、概述 随着人类基因组（HGP）的实施和进展，现有的研究明，基因是遗传结构和遗传功能的最小单位（indivisible units）。在目前已明确的人类为3万多个基因中，这些基因不仅携带生物体的遗传信息，而且是与人类生老病死密切相关的重要物质。但这一概念的得出，至今却经历了约一个世纪的演化过程。 1909年， Johansen在描述具有传递和表达一定生物学特征的遗传因子（hereditary factor）时，首次创造了“基因”（gene）这一词汇。但这一抽象的基因概念既无任何特殊的遗传理论，亦无特异的物质基础，更无法提纯获得，当时只能视为传递遗传学（transmission genetics）的研究。 1911年， Morgan首次提出了基因是在染色体上与机体功能有关的一种物质，并第一次创立了遗传的染色体理论（chromosomal theory of inheritance）。 在长达33年后的1944年， Avery等从加热处死的致病性肺炎链球菌中提纯获得DNA，并以无可辩驳的事实证明，此种DNA能使非致病菌株转化为致病型菌株，而且这种转化不是蛋白质或RNA分子，从而确定了DNA是一种控制基因表型的遗传物质。 尽管如此，当时的这一观点并未被大多数学者所接受。原因是虽然DNA是一种生物大分子的物质，但其结构仅由4种核苷酸，即腺嘌呤（adenine，A）、鸟嘌呤（guanine，G）、胸腺嘧啶（thymine，T）和胞嘧啶（cytosine，C）组成，这种简单得出奇的结构不可能有重要的生物学功能。 1952年， Hershey等通过有关的实验有力地证明，DNA则是遗传信息的携带者。 次年，Watson和Crick提出了DNA双螺旋的分子结构模型。 1958年， Crick进一步提出了遗传信息的主要流动方向，即现已被称为分子生物学的中心法则。 1961~1966年，Nirenberg和 Crick等科学家破译DNA遗传密码。 1970年，Baltimore 和Temin发现逆转录酶。 1968~1970年，Arber、Smith和 Nathans 发现 DNA限制性内切酶。 1972年，DNA的体外重组成功。 除上述这些具有代表性的研究外，许多其他的科学家也相继为基因，如染色体外的遗传单位——质粒等的许多研究作出了不少的贡献。随着这些研究的深入，特别是近年来人类基因组计划研究的全面启动和迅速进展，对有关基因的研究已涉及到生命科学的不同领域和学科。 在有关肿瘤基因（oncogenes）分子的研究方面，现已发现在细胞癌变过程中，发生改变的基因与多种基因的多阶段和多步骤相关。根据有关基因在肿瘤中对其发生和发展等的主要生物学行为及其功能，大致可将其分为4大类，其主要包括肿瘤基因、肿瘤抑制基因（tumor suppressor genes，TSG）、肿瘤转移基因（metastatic genes）和肿瘤转移抑制基因（metastasis suppressor genes，MSG）。但以前亦有的把后两类基因合为1类而分为3类的，或者只分为肿瘤基因和肿瘤抑制基因两类。 在这4类基因中，前后两对基因各形成一对既相互对立，又互相制约的两对性质各异，而且具有正负调控作用的两大基因系统，从而维持着细胞的平衡。 在正常情况下，肿瘤基因处于失活状态，而肿瘤抑制基因处于活化状态。当一些不良的理化等多种因素刺激或作用机体时，则可使原来处于失活状态的肿瘤基因激活，和/或使肿瘤抑制基因灭活。如果当这种激活和灭活的作用同时存在，以及在细胞中遗传学改变的积累作用，则可使正常细胞发生癌变而导致肿瘤的发生。 由此可见，肿瘤的发生直接与基因的改变有关，因此有的人也把肿瘤称为分子病或基因病。目前，在有关肿瘤转移相关基因和肿瘤转移抑制基因之间，是否亦存在像肿瘤基因与肿瘤抑制基因那样一种激活与灭活的关系尚待进一步探讨。 事实上，在十分复杂的生物体内，机体为了维持其各类细胞增殖和死亡之间的精细平衡（fine balance），并非只是这几种简单的关系则能实现的，很可能存在一种基因与基因之间，蛋白质与蛋白质之间等多重关系的网络调节，彼此相互联系，相互制约，相互作用，而且其作用又相互交叉，从而达到其平衡。而且在肿瘤的转移与抗转移之间的作用和关系，可能比肿瘤基因的激活与TSG的灭活关系更为复杂。 肿瘤基因的这些改变主要包括点突变（point mutation）、缺失（deletion）、扩增（amplification）、易位（translocation）和重排（rearrangement）等5种主要形式。这些变化不仅可导致其基因调控的改变，同时可使其表达产物异常，从而使细胞的正常表型转化为癌性表型而出现肿瘤特异或相关抗原的表达。这些肿瘤抗原实际上是一种具有不同生物学功能的肿瘤蛋白质（oncoprotein），而且现已成为肿瘤的一种生物标志物。 目前，已利用这些标志物的有关特性对肿瘤进行诊断和治疗。特别是随着分子生物学研究的进展，现已对有关肿瘤基因及其相关分子的核苷酸序列、改变类型和分子克隆等进行研究。通过这些实验和临床方面的探讨，现已为恶性肿瘤的诊断和治疗提供一条新而基因分子水平的途径。此就这些基因的种类及其作用等简介如下。 二、肿瘤基因的功能分类 1．瘤基因（oncogene） 也称癌基因，其最初的定义是能引起癌症的一种基因。后来进一步分为获得功能的显性（dominant）瘤基因和丢失功能的隐性（recessive）瘤基因两种，这两种基因的突变均对其蛋白功能产生影响。目前的定义是，凡能活化任何信号蛋白质而引起正常细胞产生恶性表型的基因都可称为瘤基因。 研究表明，在已鉴定的瘤基因中，约有一半与人类肿瘤的发生有关。这些瘤基因衍生于能引起染色体点突变、扩增或重排变化的细胞瘤基因（cellular oncogenes，c-onc），其突变可导致肿瘤蛋白质的产生，并使有关生物功能的定性和定量变化。这些变化可发生在细胞表面、细胞质和细胞核内，除具有支持肿瘤的发生外，尚可扰乱细胞信号的传递、细胞增殖、细胞周期的调控和细胞凋亡。 目前，已发现的瘤基因有100余种，根据其来源可分为病毒瘤基因（viral oncogenes，v-onc）和细胞瘤基因两类。病毒瘤基因是指一些RNA肿瘤病毒（亦称为急性转化逆转录病毒）在感染宿主后，能直接诱发肿瘤的一类瘤基因。细胞瘤基因亦为原瘤基因（proto-oncogenes，c-onc），由于这类瘤基因在每一种病毒瘤基感染宿主后都有一个相似或相同的细胞副本（cellular counterpart），这种副本在正常细胞中以非活化形式存在，故称为原瘤基因。这类基因由于其特性又是一类具有调节细胞增殖和分化功能的细胞基因，因此也称为细胞瘤基因。 根据这些瘤基因的生物学作用大致可分为8大类： ① 生长因子家族（FGF、PDGF和int-1/2等）； ② 受体蛋白-酪氨酸激酶类（erbB2/neu、c-met 和trk等）； ③ 非受体蛋白-酪氨酸激酶类（abl、src和 yes等）； ④ 缺乏蛋白激酶活性的受体类（mas等） ⑤ 膜G结合蛋白类（ras家族、bcl-2和gip等）； ⑥ 胞质蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶类（cot、raf/mil和mos等）； ⑦ 细胞质调节因子类（crk、dbl 和eIF-4E等）； ⑧ 核转录调节因子类（myc、fos和jun等）； 这些基因除在肿瘤的发生中具有重要的作用外，有的基因同时还具有肿瘤转移的作用。 在c-once编码的肿瘤蛋白中，其主要的功能包括9个方面： ① c-sis和 wnt1等基因编码的分泌性蛋白（生长因子）； ② c-kit和 curb基因编码的跨膜受体； ③ crk和 van等基因编码的适应性蛋白； ④ c-Has 基因编码的GTP结合蛋白； ⑤ c-able、 c-sac及 c-raff等基因编码的细胞内激酶； ⑥ c-junk、 c-foes和 c-my等基因编码的转录因子； ⑦ ell基因编码的转录延长因子； ⑧ ewes基因编码的 RNA 结合蛋白； ⑨ cycD1和 cdc25A基因编码的细胞周期调节剂。 2. 肿瘤抑制基因 (TSG) 肿瘤抑制基因简称抑瘤基因，亦称为抗瘤基因（anti-oncogenes）或隐性瘤基因（recessive oncogenes or onco-suppressor genes），其他同义词还有肿瘤易感基因（tumor susceptibility genes）。顾名思义，TSG是能抑制肿瘤形成的一种生长调节剂。这一现象的首次提出是在1914年。当时，Boveri 在描述“抑制性染色体”（inhibiting chromosomes）则认为这种调节剂的存在。时直1969年，Harris等通过恶性细胞和非恶性细胞的融合后，发现其恶性作用被抑制，从而为这一现象提供了直接的证据。2年后，Knudson进一步提出二次击中突变（two-hit mutation）的理论以支持TSG的隐性作用。这才结束了其最初的定义。1986年，通过成视网膜细胞瘤（Rb）基因的克隆成功，以及把这种Rb克隆基因导入细胞后，发现这种细胞的恶性表型被抑制。 至今为止，虽已有50多种TSG被鉴定，但仍无关于TSG在肿瘤抑制、发展和转移的复杂机制中的标准概念（standard criteria）。最近的文献报道，根据TSG的作用可将其分为看门（gatekeepers）、看家（caretakers）和景色（landscaper）基因3类。这种看门基因可限制肿瘤的发展速度，当其功能丧失后则可导致原发肿瘤的发生。看家基因是当DNA突变时进行其修复的一种基因。景色基因是根据在家族青年性息肉病中，有一种名为Smad 4即DPC 4基因与TSG有关而提出的，但其有关机制尚不清楚。尽管如此，但这些基因的功能并非单一的作用，而是相互交叉，相互重叠。因此，目前的这些概念尚需对TSG的深入研究和进一步分类后，才能得出比较明确的概念。 (1) 看门基因（gatekeepers genes） 这些基因的主要功能特点是限制肿瘤细胞的增殖，当其中功能失去后则导致原发肿瘤的发展。其中主要包括TP53、PTEN/MMAC1、FHIT、BRCA1、BRCA2、DCC、APC、MCC、WT1、NF1、NF2、HNPCC、VHL、SMAD4/ DPC4、E-CADHERIN、CDKN2/ p16/MTS1、p15、p18、p19、p27、p21、p57、p73、PATCHED、TSC1、TSC2、MEN1、STK11、ATM、RB-1、KI-RAS、CD44和CD95等30余种。 (2) DNA修复基因（DNA repair genes） 此类基因亦称为看家基因（caretakers gene）。在细胞周期的运行过程中，有一整套精密的机制严格控制这一过程的运转。其主要包括发现DNA损伤和错误的传感器（sensor），细胞周期中受损细胞的扣留（arrest），相应的DNA修复（repair），根据其修复的情况，决定（decision）细胞是继续分裂（divide），还是死亡（death）。 在DNA的修复中，主要以切除修复和错配修复两种形式进行。 ① 切除修复（excision repair） 这是指把发现的单个而异常的核苷酸通过体内的酶切并替换之。其中又包括3种形式：一种是硷基切除修复（base excision repair），主要是通过酶把有关错误的糖基切除并替换之；另外两种都是核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER），这是通过把整个核苷酸或一段寡核苷酸的切除而进行修复。在这两种NER中， 又包括2种不同的修复形式。一是全基因组的切除修复（global NER），这是通过蛋白质/DNA在整个基因组任何部位的直接作用所进行的修复。另一种为转录切除修复（transcription-coupled NER），是指基因在转录过程中进行的切除修复。 具有DNA切除修复作用的主要基因有ERCC1（excision repair cross complementing 1）、ERCC2（XPDC）、ERCC3（XPBC）、XPAC、FACC、 DNA连接酶Ⅰ基因、DNA聚合酶β基因和O6-MGMT基因等20种左右。 ② 错配修复（mismatch repair，MMR） 这是把局部一段重复错配的寡核苷酸链切除而进行重新合成的修复。错配修复机制不仅存在于原核细胞，亦存在于真核细胞，其主要功能是通过其内源性核酸酶和核酸多聚酶的作用，去除重复错配的DNA链，以纠正不配对的DNA局部延伸。参与人错配修复的基因家族包括hMLH1、hMSH2、Hmsh1、hPMS1、hPMS2、hMSH6和MSI 等7种。 3.肿瘤转移相关基因（metastasis-related gene） 在细胞基因组中，具有促进肿瘤细胞浸润和/或转移潜能的基因称为肿瘤转移相关基因。这类基因亦称为肿瘤转移促进基因（metastasis-enhancing gene）。研究表明，肿瘤细胞的浸润和转移是一个十分复杂而多阶段的过程。在每一步中，不仅有多种基因的参与，而且还有一些相关因子、酶类和蛋白质等的共同作用。 这些作用主要通过对原发肿瘤细胞的恶性增殖，肿瘤细胞分泌有关的细胞因子和蛋白酶类，肿瘤细胞的粘附、迁移和运动，以及在靶器官中的恶性增殖形成转移灶等几个主要阶段而实现。其中比较有代表性的基因有mst1、Tiam-1（T lymphoma invasion and metastasis 1）和CD44基因等；可能与肿瘤转移有关的肿瘤基因和肿瘤抑制基因有ras、myc、sis、V-src、V-fos、V-mos、C-erbB-2和突变型p53等；酶类包括基质金属蛋白酶类、内糖苷酶和丝氨酸酶类基因等。在这些基因中，有的不仅与肿瘤的转移有关，而且还与其发生和发展有关。这种相互交叉的作用构成肿瘤极其复杂的性质。 其中的CD44对肿瘤细胞不仅具有促生长和侵袭的分子作用，即助长肿瘤的作用（tumor-promoting action）。而且还具有抑制肿瘤辅因子的作用（tumor-suppressing cofactor），这种作用可把癌细胞的生长扣留，故又称为接触抑制作用（contact inhibition）。CD44为何出现这两种截然不同的作用，其主要取决于下列4种因素：①与细胞上CD44表达的异构重整样式有关；②与细胞上ERM蛋白质的结构有关；③与细胞外基质（ECM）的性质有关；④尚不知道的其他因素。 4. 肿瘤转移抑制基因（metastasis suppressor gene，MSG） 肿瘤转移抑制基因（metastasis–inhibiting gene，MIG）亦称抗肿瘤转移基因。这是近年来随着分子克隆技术的发展而认识和提出的一类与肿瘤有关的基因。由于此类基因在非转移肿瘤中呈高表达，而在转移肿瘤中低表达，故认为其与抑制肿瘤的转移作用有关而得名。可见在细胞基因组中除存在肿瘤基因与肿瘤抑制基因外，同时存在肿瘤转移和抗转移两大正负调节的基因系统。但这两大系统具体的调控关系尚不清楚。目前认为，具有肿瘤转移抑制作用的基因主要有MHC、nm23 、KAI-1、E-Cadherin、 DCC、TIMP-1、TIMP-2、WDNM-1和WDNM-2等。 转移是癌症最致命的一种属性，因此对癌症转移和抗转移的研究已是目前肿瘤研究的重要内容及热点之一。 三、肿瘤转移抑制基因的作用 1. 组织相溶性复合体基因（major histocompatibility complex gene， MHC） MHC在人类又称为HLA（human leukocyte antigen），机体的MHC是MHC基因表达的产物，HLA基因位于6号染色体的短臂上，是一条由380万碱基对组成的极其复杂的DNA链，含有100多个基因。人类HLA基因分为三个功能区：Ⅰ区有A、B、C位点，主要编码HLA-Ⅰ类抗原，其受体在T细胞上；HLA-Ⅱ区编码HLA-Ⅱ类抗原，其受体位于巨噬细胞和B细胞上，参与抗原抗体反应；HLA-Ⅲ区由G位点组成，初步认为其功能与制造C3、C4等补体及B因子有关。 MHC的免疫调节作用主要是对T和B细胞的限制性识别，即所有抗原只有经过MHC处理并和MHC结合才能为T和B细胞识别，反之则无法识别不经MHC携带的单纯抗原。 无论是自发肿瘤还是外源性物质引起的肿瘤均有别于正常细胞，肿瘤细胞的异质性是肿瘤呈特异抗原的基础。这种抗原性物质必须在细胞内由MHC识别、处理并与MHC结合才能在细胞表达。大量的试验表明，由于肿瘤细胞的MHC表达减弱，从而使其抗原性无或仅呈弱的呈现。这不仅使肿瘤细胞可逃避免疫的监视，而且也是其发生转移的主要原因。 1991年，Schwartz发现APC细胞递呈一种称为B7／CD80的蛋白质，其T细胞上的相应受体是CD28。这既是对T细胞共刺激信号学说的完善，而且经实验结果证实，在大部分肿瘤病例中，引入CD80可以加强免疫应答，阻止肿瘤的转移。这是由于在肿瘤转移时，MHC的功能被抑制，细胞共刺激信号作用减弱，并导致肿瘤细胞的免疫逃逸，这对肿瘤转移的发生具有重要的作用。 2. nm 23基因 (nm23 gene) nm 23基因（non-metastasis 23）定位于人类染色体17q22，编码区为533bp，其产物为152个氨基酸组成的17kD核内及胞质蛋白，与二磷酸核苷激酶(nucleotide diphosphate kinase, NDPK)的氨基酸序列具有高度同源性。人类的nm 23基因有二个亚型，即nm 23 H1（NME1）和nm 23 H2（NME2）。nm 23 H1编码蛋白的氨基酸与nm 23 H2基因编码的产物有88%的同源性。目前认为，nm 23可能是一种具有NDPK功能的基因。 因此nm 23也被称为NDPK，或nm 23/NDPK。同时，nm23蛋白具有嘌呤结合功能，因此也称之为嘌呤结合因子（purine-binding factor，PBF）。 人类红细胞NDPK由两条多肽链组成，其中A链与nm 23 H1 编码的氨基酸序列一致，B链与nm 23 H2编码的氨基酸序列一致。因此，nm 23蛋白很可能通过与NDPK相似的途径调节细胞信号的传递，并在细胞分化等过程中发挥作用。NDPK可能通过两种途径参与细胞调节，一是影响细胞微管聚合以调节细胞运动；二是通过影响G蛋白的信号传递发挥负调节作用。但这些作用并不依赖于NDPK的活性。实验表明，与转移潜能有关的是nm 23/NDPK的表达水平而不是NDPK的活性。人的nm 23基因是肿瘤转移抑制基因，其与肿瘤转移的关系与nm 23基因表达水平有关外，另外一个异常的变化是等位基因的缺失或突变。 3. E-钙粘附蛋白基因（E-Cadherin gene） E-Cadherin即钙粘附蛋白质，也称上皮钙粘附素或CAM120/180。人类E-Cadherin基因定位于染色体16p11~16qter上，cDNA全长4.8kb。于1993年被克隆成功，人类E-Cadherin基因组DNA全长达100kb，含16个外显子。基因编码的蛋白质E-Cadherin是一类重要的钙粘附蛋白，分子量为124kD。该蛋白是一类介导同种细胞互相粘附的钙依赖性跨膜蛋白，参与形成和维护正常细胞间的联结，是介导细胞间重要的一类分子。通过联结蛋白质与细胞骨架形成一复合物，它的活性也可影响紧密联结、缝隙联结和桥粒联结。当E-Cadherin基因突变或甲基化时，其粘附功能失调，使癌细胞脱离。这与肿瘤的转移密切相关，是一种重要的肿瘤转移抑制基因。 4．DCC基因 （deleted in colorectal cancer, DCC gene） DCC基因的原意为结肠癌缺失基因，定位于人类染色体18q21.3，分布在大约370kb的DNA片段中，有29个外显子，转录产物约10~12Kb，编码750个氨基酸的蛋白质，属于跨膜受体类，膜外有1100个氨基酸，膜内有324个氨基酸，分子量为190kD，可能为一种信号传递受体。研究表明，DCC基因编码的蛋白产物与神经细胞黏附因子N-CAM存在非常有意义的同源性，提示DCC基因具有细胞-细胞外基质相互作用的功能，而且其缺失可影响细胞间的粘附机制导致肿瘤的侵袭和转移，这不仅对肿瘤抑制基因功能的研究具有指导意义，而且对肿瘤转移抑制基因的研究也有价值。 DCC基因产物有未知功能的穿膜结构域，其氨基酸排列同已知的细胞黏附分子和其他有关的细胞表面糖蛋白分子十分类似，故认为它与细胞-细胞之间、细胞-基质之间的作用有关。已知细胞间的粘附和通信的破坏与细胞恶性转化密切相关。后经研究发现，DCC基因不仅与结直肠癌和肿瘤抑制基因有关，而且还与胃癌、食道癌、胰腺癌、前列腺癌和肝癌等，以及与肿瘤转移抑制基因有关。 5. KAI1基因（KAI1 gene） （详见下叙） 四、KAI1基因的研究进展 1. KAI1/CD82基因的结构和特性 1995年， Dong等人首次从人前列腺癌杂交瘤细胞系AT6.1-11-1中，克隆得到一种与肿瘤转移抑制有关的基因，并命名为Kang Ai 1，即中文拼音的抗癌1号之意，简称KAI1基因。该基因定位于人类染色体11p11.2上，全长约80kb，含有10个外显子和9 个内含子。其cDNA长度为2.4kb，具有单一开放阅读框架，编码含有267个氨基酸的蛋白质，分子量约29.61kD。它含4 个跨膜结构域和一个细胞外亲水性结构域，在胞外的结构域有3个潜在的糖基化位点。 根据KAI1蛋白的结构特点，其属跨膜4超家族（transmembrance 4 superfamily， TM4SF）成员之一，在结构上属于细胞膜糖蛋白。对KAI1基因的进一步研究发现，该基因5’的启动子区域有一CpG岛，约735bp，无TATA盒和CCAAT盒，但有多个结合基序可与各种转录因子结合，包括9个Sp1位点和5个AP2位点。因此，推测该基因在人类组织中的表达可能有多种调控机制，但其具体的方式尚不清楚。 在TM4SF成员中，至少有14个人类的分子。其中KAI1有6个不同的名称，即CD82/ KAI1/R2/C33/IA4/4F9。其他13个分子是CD9/MRP-1、CD37、CD53/OX-44、CD63/ME491、CD81/TAPA-1/S5.7、A15/MXS1/TALLA-1、peripherin/RDS、ROM-1、CO-029、L6/M3S1、SAS、ilTMP和SFA-1。 2. KAI1基因的实验研究 KAI1基因作为一种肿瘤转移抑制基因，这种特有的功能已在肿瘤学界受到广泛的关注。故针对该基因的有关实验研究，已成为在肿瘤转移抑制研究中的一个热点基因之一。其主要的目的是拟求得对恶性肿瘤的诊断及治疗有所突破。因此，现已从对该基因的克隆、探针制备、细胞转染，以及在体内外的有关作用等进行了比较系统的实验研究。 （1）目的基因的获得 目的基因的获得可用基因文库（包括基因组文库或cDNA文库）的分离筛选、酶切消化或PCR扩增等技术进行。目前，在KAI1基因的获取中，主要是以cDNA文库分离筛选法进行。因为在cDNA文库中的插入片段由mRNA反转录而来，这既可直接指导其转录和，也能直接用于该基因的表达和功能方面的研究。 （2）载体的选择 载体是指在连接酶的作用下和外源DNA片段或基因进行重组，并能运送这种被连接的DNA分子进入宿主细胞自行复制，并能用于筛选、分离纯化和扩增目的基因的一类DNA分子。目前，用于基因克隆的载体种类繁多，其主要包括质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和非病毒载体等几大类型。由于这些载体的分子大小、结构及用途等各有差异。故在其克隆载体的选择时，主要应依其实验的目的而定。 在KAI1 cDNA的克隆时常以质粒载体为主，如pCR-Ⅱ、pcDNA3.1+、、pcDNA3-neo、 pcDNA3.1-neo和pcMV-neo等。因为此类载体分子相对较小，也比较稳定，且有较高的拷贝数和高效的复制子，能在细菌蛋白质合成受阻染色质DNA合成停止时，利用细菌的酶系统进行质粒自身复制。在实验中也可用抗生素阻止细菌蛋白质的合成，使质粒的拷贝数增加。而且，由于这类载体具有多种遗传选择性标记，以及可作为真核细胞的表达载体，这些除了便于筛选外，还能转染肿瘤细胞。 （3）基因的重组 DNA分子在体外的重组实质上就是基因分子之间的连接过程，也是在DNA连接酶的催化作用下进行的生物化学反应。用目的KAI1基因与适当的载体，通过连接酶的作用，就可在体外进行重组。其常用的连接有粘性末端连接法、平头末端连接法、人工接头法和同源多聚尾序法等，其中又以粘性末端连接法为最常用。虽然此法的连接效率较平头末端为高，但在操作时有背景高、双向插入，以及多拷贝插入的缺点。 （4）靶细胞的选择 在针对KAI1基因的研究时，其肿瘤细胞的选择首先应是具有高转移特性，而且其基因或蛋白质都应呈低或无表达的细胞系为好。只有这样才既有利于KAI1基因抑制转移作用的研究，亦有利于其检测。我们在对胰腺癌的研究中，选用的则是胰腺癌高转移细胞系MiaPaCa I和PANCⅡ等进行。 （5）基因的转染 把含有目的基因的载体导入即转染靶细胞的方法有多种，其主要包括物理法（直接或显微注射法、穿刺或电穿孔法、基因枪粒子轰击法等）、生物化学法（磷酸钙转染法和染色体介导转移法等）、融合法（脂质体介导转染法）、受体介导转移法，以及病毒介导转移法（反转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒或重组病毒介导转移法等）或非病毒介导转移法等。我们在KAI1基因的实验研究中，则采用了非病毒的脂质体介导转染法。该法比较简便易行，具有较高的转染率和较小的细胞毒性，重复性也较其它方法好，成本适中，而且可用于瞬时和稳定两种形式的表达。 （6）转染细胞的选择性培养 用重组质粒转染的瘤细胞常以G418进行其筛选。这是由于在这种重组质粒的载体上已重组有关具有遗传表型的筛选基因。其中常用的是抗新霉素类似物的G418（neoR）基因，当培养体系中加入一定量的G418后，只有含与KAI1基因重组体而转染成功的细胞，因其含有这种抗性基因才能存活，否则反之。 在G418培养浓度的选择时，因不同细胞对其敏感性的差异较大，一般的使用浓度在100~1600μg/ml之间。因此在使用前，最好先用靶细胞对其进行最佳培养浓度的预实验或参考有关的实验进行。 当未转染成功的细胞经过一段时间的培养后则逐渐死亡，而转染成功的细胞则可逐渐的增殖为新的克隆。 （7）目的基因的鉴定 虽然转染的细胞已经G418的筛选培养，而且这已是一种初步的鉴定。但这种插入的外源DNA在细胞内经重组后，是否编码我们所需要目的基因的序列和表达蛋白质。这就需要对其进行进一步的分析和鉴定。其中大致分为遗传、物理、分子杂交、蛋白质表达和细胞生物学行为5个不同水平的检测。 ①遗传表型的检测主要包括抗性基因（neo等）或基因（lacZ，编码β-半乳糖苷酶等）的测定。 ②物理法检测主要包括凝胶电泳和R-环的检测。 ③分子杂交主要是用目的基因（KAI1）或标记基因（neoR和AmpR）的DNA或 RNA经标记后作为探针进行分子杂交，其主要包括Southern blot、Northern blot、原位杂交及菌落或噬菌斑的杂交筛选法等。 这种对外源基因转录的mRNA 进行杂交鉴定，也是转导细胞一种重要的鉴别手段。 ④蛋白质水平的检测主要包括对其表达产物的免疫化学分析，其中有放射性抗体测定法、免疫沉淀法Western blot和免疫细胞化学法等。 ⑤细胞的生物学行为测定主要包括体内和体外两个方面，其中体外包括细胞形态增殖、细胞集落及细胞运动和侵袭等实验；体内主要包括致瘤、抑瘤及肿瘤转移实验等。 （8）实验动物的选择 在肿瘤的实验研究中，究竟以何种动物模型进行其研究需根据实验的具体目的而定。在移植瘤模型的建立中，一般采用的是免疫缺陷型小鼠。其常用的有裸小鼠及SCID小鼠，年龄以4~6周龄、体重为20±2g的雌性小鼠为好。动物的性别也可根据具体的实验的目的而选择。在这两种小鼠的选择时，一般以裸小鼠为主。因为这种小鼠的饲养条件比SCID小鼠的要求低，而且价格也相对便宜。 （9） 动物模型的建立 动物模型的建立是在体内实验中非常重要的步骤。首先必须是裸小鼠的生长状态良好，其次是接种细胞的质量要好。所谓质，就是培养的细胞应处于对数生长期，生长状态佳；其量是指注入细胞的数量最好达到2×107/0.2ml。细胞接种的部位应以皮下组织松弛、供血良好等肿瘤细胞易于生长的部位，如两腋窝或腹股沟上部。在细胞接种时，一般采用一点或多点同时注射，但每点注入的细胞数量都不得少于1×107/0.2ml。 一般成瘤的时间大约为4~6周，转移观察的时间大约为1~2个月。 3. KAI1基因在有关肿瘤中的研究 （1）前列腺癌 此癌是Dong等首次进行KAI1基因研究的一种肿瘤，并发现其在正常前列腺中呈高表达，而在人前列腺癌转移细胞系中无表达或低表达。当把该基因导入具有转移作用的前列腺癌细胞系AT6.1再接种小鼠后，可抑制其转移。研究还发现，KAI1 mRNA在恶性程度低的癌组织中的水平升高，而恶性程度高的水平降低。这些表明，该基因的功能还与其进展相关。但KAI1蛋白在此癌组织中的下调表达与该基因的突变及等位基因缺失无关。 （2）肺癌 对351例非小细胞肺癌和49例肺腺癌组织的RT-PCR分析，以及免疫组化等的检测结果表明， KAI1 mRNA的表达与病人的年龄和肿瘤大小无关，但与肿瘤的转移和病理分期显著相关，而且高表达的预后良好。研究还发现，KAI1 mRNA的这种表达下调与其杂合性缺失（LOH）和复制错误（RERs）无关。 （3）结肠癌 经正、反义KAI1 cDNA转染结肠癌细胞系DLD-1和 BM314的结果表明，该基因表达的减少可使其侵袭和转移的能力增加。Northern blot 和Western blot的分析说明，KAI1 mRNA及其表达蛋白质在结肠癌早期升高，晚期下调，转移时缺少或无表达。 （4）肝癌 用Northern blot和原位杂交法对10例正常肝组织及39例原发性肝细胞癌的检测结果显示， KAI1基因在正常肝脏中的水平比原发性肝癌高2.6倍（P<0.01），而无转移的原发性肝细胞癌明显高于有转移的淋巴结、肝内及腹膜转移的原发性肝细胞癌(P<0.05)。 （5）膀胱癌 研究发现，KAI1 mRNA可降低膀胱癌细胞系钙离子依赖和非依赖性细胞之间的黏附作用，和降低与纤维连接蛋白质的黏附，从而使其侵袭能力增加。对66例石蜡包埋的膀胱癌组织的研究表明，KAI1 mRNA的下调与侵袭性膀胱癌密切相关，但与p53的突变和Rb的表达缺失无关。 （6）乳腺癌 在转移乳腺癌细胞系和高侵袭的乳腺癌标本中，KAI1的表达呈低调节。在荷瘤裸鼠体内的研究表明，该基因对此癌转移的作用可能是一种阴性的调节。 这在肺癌中也有类似的结果。 （7）其他 经对100例肿瘤（食道癌41例、胃癌35例和十二指肠乳头癌24例）及38例相对应的正常组织（15例正常食道、14例正常胃和9例正常十二指肠乳头）的研究发现， KAI1 mRNA分别在转移和非转移的食道癌、胃癌和十二指肠乳头癌中均无显著性差异（P>0.05）。 在急慢性髓细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病等恶性肿瘤中， KAI1呈过度表达。 经国内外的研究结果显示，KAI1在大多数的肿瘤中均有抑制其浸润和转移作用。但也有学者得到不同的结论，这可能与其实验对象、方法和条件，以及抑制肿瘤浸润和转移的作用并非KAI1一种因素所致等有关。 Mashimo等的研究发现，抑瘤基因p53可通过与KAI1基因5’上游区的结构相互作用而直接激活KAI1基因。但也有的报道认为，p53对KAI1表达的调节作用不明显，而且KAI1基因不是p53作用的转录靶基因等。 这些都需要进一步的研究。 4．KAI 1 基因在胰腺癌中的表达及与转移关系的研究 胰腺癌（PC）的诊断和治疗都属最棘手的一种恶性肿瘤，并被列为21世纪医学顽固堡垒。此癌的发病率不仅呈上升趋势，而且死亡率也较高。因此，攻克PC已是刻不容缓的研究课题。 转移是癌症病人死亡的一种主要原因，更是胰腺癌的一种突出特征。由于KAI1基因对肿瘤转移的抑制作用，因此对其在胰腺癌中的进一步研究已引起人们的广泛关注。 下面就我们对KAI1基因在胰腺癌中的有关基础和临床方面的研究简介如下。 （1）基础方面 1）KAI1基因制备的相关技术 将cRNA逆转录为cDNA后行PCR扩增，与pCR-II载体重组，转染到E.coli JM109细菌体内，通过质粒扩增和线性化处理后，用地高辛标记KAI1基因探针。 2）7S cDNA探针制备技术 7S cDNA探针采用上述相似的方法制备，以[α-32P]dCTP标记，其放射性为0.5―1×109cpm/微克，以此作为KAI1基因平行上样的标准。 3）KAI1基因和7S基因的氨基酸序列分析技术 所制备的KAI1基因探针和7S基因采用ABI373自动DNA-序列检测系统进行序列分析。 4）胰腺癌等组织中RNA提取、电泳及转移电泳技术 采取异硫氰酸胍一步法提取RNA，并通过琼脂糖凝胶电泳把RNA转移至尼龙膜上，经紫外线照射交联固定RNA。 5）KAI1 mRNA在胰腺癌等组织中的分子水平分析 Northern blot分析技术 ： 将含有胰腺癌等组织的RNA电泳转移到尼龙膜上，经预杂交和杂交及CDP-star化学法使X线胶片感光，通过微机自动显像定量系统测出各样品的信号值，再除以7S对应上样的信号值，从而判定胰腺癌等不同组织中的RNA水平。 原位杂交分析技术 ： 采用地高辛标记的KAI1探针（缩短至150bp的片段），在固定有胰腺癌等组织的superfrost特制的玻片上进行预杂交和杂交后，对正常胰腺、胰腺癌、转移癌等组织细胞中的mRNA进行定位分析。 6）KAI1基因在胰腺癌中编码蛋白质的检测分析 采用抗KAI1基因的单克隆抗体C33，通过免疫组织化学法对胰腺癌等组织中的抗原蛋白，即KAI1基因翻译的KAI1蛋白质进行表达分析。 7）胰腺癌等组织中基因突变分析技术 用正常和胰腺癌组织中的RNA逆转录成cDNA，通过2次PCR后，并把其扩增产物再逆转录成cRNA，用核糖核酸酶III（RNaseIII）酶切后行凝胶电泳，通过序列分析确定其突变方式。 （2）临床方面的研究 1）采用Northern blot和原位杂交对44例正常胰腺和95例原发性胰腺癌的测定结果显示，84%(80/95)的胰腺癌组织中有不同程度的KAI1 mRNA表达，其中有转移的胰腺癌组织明显低于没有转移的原发性胰腺癌中的 mRNA水平(P<0.005)。在54例有转移的原发性胰腺癌中，25例(46%)的KAI1 mRNA为弱表达，15例(28%)无表达，其余的14例(26%)为中度表达。 2） 经对原发性胰腺癌转移淋巴结的分析发现，20例淋巴结转移癌中有6例(30%)的KAI1mRNA为弱表达，其余14例(70%)转移癌均无KAI1表达，与其相应的原发性胰腺癌相比有显著性差异(P<0.05)；11例肝转移癌与原发性胰腺癌相比有非常显著的差异性(P<0.01)，而胰腺癌的淋巴结转移癌和肝转移癌之间的结果相似(P>0.05)。 3） 早期原发性胰腺癌的KAI1 mRNA水平与晚期转移的原发性胰腺癌相比有非常显著的差异性(P<0.01)，而高、中分化胰腺癌的KAI1 mRNA 水平明显低于低分化和未分化的原发性胰腺癌(P<0.05)。 4） KAI1 mRNA的定位发现，在胰腺癌细胞胞质内有不同程度的分布表达，而癌周围基质、炎症细胞、胰岛细胞，以及邻近癌旁组织腺泡内的mRNA无或弱表达。其细胞蛋白质水平的定位除胰岛细胞有中、高度表达外，其余与KAI1 mRNA的分布一致。 5） 经对24例原发性胰腺癌基因突变分析发现，其中7例(29%)在其核苷酸链第886位点上的碱基发生点突变，即A（腺嘌呤）→G（鸟嘌呤）的突变，由于这种突变导致了异亮氨酸被缬氨酸取代。在无转移的胰腺癌和正常胰腺组织中的此基因无突变发生，而有突变的7例均为晚期转移的原发性胰腺癌，其突变率占17例晚期转移原发性胰腺癌的41%(7/17)。 （3）上述的研究表明 ① AI1基因在胰腺癌中呈低表达或无表达时则出现浸润转移，而高表达时无转移。揭示了该基因在胰腺癌中具有抑制其转移的作用。 ②KAI1基因的mRNA水平在早期胰腺癌患者中明显高于有转移的晚期胰腺癌患者（P<0.001），表明该基因的这种生物学行为与此癌的发生及其转移机制有关。 ③ KAI1基因序列分析显示，其在胰腺癌患者中的突变方式为点突变。在该基因的核苷酸链第886位上的异亮氨酸被缬氨酸取代。这为阐明该基因在胰腺癌中的抗转移作用提供了重要的理论依据。 ④ KAI1基因在肝癌中的变化与胰腺癌相似,但在胃癌、食道癌和十二指肠乳头癌的转移与KAI1基因关系不大,表明该基因在不同癌组织中呈不均一性分布。 ⑤ KAI1 cDNA亚克隆的制备及其非同位素的标记，为胰腺癌有关抗转移作用的研究提供了分子探针。 5．结语 近年来的研究表明，KAI1基因是一种与多种恶性肿瘤的转移抑制有关而新的抗肿瘤转移基因。这对临床肿瘤的分期、预后，以及治疗等均有重要的作用。由于该基因的这些作用和特性，因此引起肿瘤学界的广泛关注，并已对其进行有关的实验研究和临床病例的分析，这必将为恶性肿瘤的深入研究和基因治疗提供新的理论及实验依据。 参考文献 1 曾益新. 肿瘤学. 北京: 人民卫生出版社, 1999 2 成军. 肿瘤相关基因. 北京: 北京医科大学出版社, 2000 3 陈志南, 刘民培. 抗体分子与肿瘤. 北京: 人民军医出版社, 2002 4 金伯全. 细胞和分子免疫学. 北京: 科学出版社，2001 5 伍兴星, 聂 广, 胡继鹰. 医学分子生物学原理与方法. 北京: 科学出版社，2000 6 顾健人, 曹雪涛. 基因治疗. 北京: 科学出版社，2001 7 贺林. 译码生命——人类基因组计划和后基因组计划. 北京: 科学出版社， 2000 8 陈 竺, 强伯勤, 方福德. 基因组科学与人类疾病. 北京: 科学出版社，2001 9 吴乃虎. 基因工程原理. 北京: 科学出版社，2000 10 梁国栋. 最新分子生物学实验技术. 北京: 科学出版社，2001 11 李育阳. 基因表达技术. 北京: 科学出版社，2002 12 沈倍奋. 分子文库. 北京: 科学出版社，2001 13 Richard M. 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