健脾中药复方胃肠安对人胃癌裸小鼠

① 健脾中药复方胃肠安对人胃癌裸小鼠 原位移植瘤生长和转移的影响 赵海磊1 ,赵爱光1 , 尤圣富2 ,顾 缨1 , 唐莱娣2 ,杨金坤1 (1 . 上海中医药大学龙华医院肿瘤科 , 上海 200032 ; 2 . 上海中医药大学龙华医院科研实验室 , 上海 200032 ) [摘要 ] 目的 :观察以健脾为基础的中药复方胃肠安对人胃癌裸小鼠原位移植瘤生长和转移的抑制作用。 方法 :采用人胃癌细胞 SGC-7901 , 裸小鼠 66 只 , 其中 41 只制作原位移植瘤模型 , 另 25 只制作皮下移植瘤模 型。两种模型的裸小鼠分别随机分为 3 组 : 胃肠安组 , 5-FU 组和生理盐水对照组。胃肠安组予以含生药 0 .12 g/ ml的胃肠安煎剂 0 .5 ml 灌胃 , 1 次/ d; 5-FU 组以 5-FU 50 mg/ kg行腹腔化疗 , 1 次/ 周 ; 生理盐水对 照组予以生理盐水 0 .5 ml/ d灌胃。原位移植瘤裸小鼠于造模后第 64 天处死 ; 皮下移植瘤裸小鼠于造模后 第 41 天处死。观察各组的抑瘤率 , 原位移植瘤各组肿瘤的转移情况 ,皮下移植瘤各组增殖细胞核抗原 ( pro- liferating cell nuclear antigen, PCNA ) 和细胞凋亡情况。结果 : 原位移植瘤模型中 , 胃肠安组和 5-FU 组抑 瘤率分别为 40 .82%和 37 .92% ; 皮下移植瘤模型中两组的抑瘤率则分别为 48 .70 %和 60 .10%。原位移植 瘤模型中 ,胃肠安组和 5-FU 组裸小鼠胃周淋巴结转移、肝转移、肝门淋巴结转移、横膈转移和腹膜转移比生 理盐水对照组明显减少 , 3 组的总转移率分别为 30 .77 %、28 .57 %和 71 .43% ( P < 0 .05 )。皮下移植瘤模型 中 ,胃肠安组和 5-FU 组的 PCNA 总阳性率低于生理盐水对照组 , 细胞凋亡指数高于生理盐水对照组 , 差异 有统计学意义 ( P < 0 .05 或 P < 0 .01 )。胃肠安组和 5-FU 组瘤重、总转移率和 PCNA 总阳性率比较 ,差异 无统计学意义 ,但胃肠安组细胞凋亡指数明显高于 5-FU 组 ( P < 0 .05 )。结论 :健脾中药复方胃肠安具有抑 制人胃癌裸小鼠原位移植瘤生长和转移的作用。胃肠安对胃癌细胞的体内抑制作用可能通过抑制增殖、诱 导肿瘤细胞凋亡而实现 ,对其抑制转移的机制尚需作进一步的研究。 [关键词 ] 胃肿瘤 ; 复方 ( 中药 ) ; 肿瘤移植 ; 细胞凋亡 [中图分类号 ] R286 .91; R735 .2 [文献标识码 ] A [文章编号 ] 1672-1977 (2005) 05-0378-04 Growth-inhibiting and anti-metastasis effects of Weichang’an Decoction on orthotopic transplant nude mouse model of human gastric cancer ZHAO Hai-Lei1 , ZHAO Ai-Guang1 , YOU Sheng-Fu2 , GU Ying1 , TANG Lai-Di2 , YANG J in-Kun1 ( 1 . Department of Oncology, Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032 , China; 2 . Science and Research Laboratory, Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032 , China) ABSTRACT Objective: To evaluate the growth-inhibiting and anti-metastasis effects of Weichang’an Decoc- tion ( WCAD) on orthotopic transplant nude mouse model of human gastric cancer . Methods: Forty-one nude mice were implanted with SGC-7901 cells at orthotopic site, whereas 25 were implanted with SGC-7901 cells subcutaneously . Then the nude mice in each transplantation model were divided into the same three groups which were WCAD-treated group with WCAD 0 .5 ml/ d taken orally, 5-FU-treated group with 5-FU 50 mg/ kg intraperitoneally injected weekly and untreated control group with physiological saline 0 .5 ml/ d taken orally . The growth-inhibiting rates of transplant tumors were detected and the metastatic lesions were examined in the orthotopic transplant mouse model while PCNA-positive rate and apoptotic index ( AI ) were observed in ·873· 中西医结合学报 2005 年 9 月第 3 卷第 5 期 J Chin Integr M ed, September 2005 , Vol .3 , No .5 ①[基金项目 ] 上海市科委青年科技启明星资助项目( No . 02QB14043 ) ; 上海市教委研究基金资助项目 (No . 1C06) [作者简介 ] 赵海磊 (1972- ) , 男 , 博士 , 主治医师 . Correspondence to: ZHAO Ai-Guang, MD, Associate Professor . E-mail : aiguang@hotmail .com the subcutaneous transplant mouse model . Results: The growth-inhibiting rates in the WCAD- treated and 5- FU-treated groups of orthotopic transplant mouse model were 40 .82 % and 37 .92% respectively whereas those of subcutaneous transplant mouse model were 48 .70% and 60 .10% . The incidence rates of metastasis in perigastric lymph notes, lymphnodes in the porta hepatis, liver, diaphragm and peritoneum in the WCAD- treated and 5-FU-treated groups were lower than those in the untreated control group, and the total metasta- sis rates in the WCAD- treated, 5-FU-treated and the untreated control groups were 30 .77 % , 28 .57 % and 71 .43% respectively with significant differences ( P < 0 .05 ) . The total PCNA-positive rates in the WCAD- treated and 5-FU-treated groups were obviously lower than that in the untreated control group ( P < 0 .05 or P < 0 .01 ) while the AI was higher than that in the untreated control group ( P < 0 .01 ) . The growth-inhibiting rate, total PCNA-positive rate and total metastasis rate in the WCAD-treated group had no significant differ- ences as compared with those in the 5-FU- treated group, but the AI in the WCAD-treated group was signifi- cantly higher than that in the 5-FU-treated group ( P < 0 .05) . Conclusion: WCAD has the inhibiting effects on tumor growth and metastasis of gastric cancer which is orthotopic implanted onto nude mice . This effect may be obtained by proliferation suppression and apoptosis induction in cancer . KEY WORDS stomach neoplasms ; compounds (TCD) ; neoplasm transplantation; apoptosis J Chin Integr Med, 2005 , 3 (5 ) : 378-381 运用中药复方治疗胃癌具有一定的临床疗 效 [ 1 , 2 ] 。我们采用以健脾益气为基础的中药复方胃 肠安煎剂 ( Weichang’an Decoction, WCAD) 治疗无 手术和化疗指征的中晚期胃癌患者 , 发现该方具有 一定的抑制肿瘤生长 , 提高患者生命质量和延长患 者生存期的作用 [ 3 ] , 对于胃癌根治术后的患者则有 一定的降低复发和转移的作用。通过对其作用机制 的研究 ,我们发现胃肠安具有抑制裸小鼠移植性人 胃癌细胞增殖和诱导其凋亡的作用[ 4 ] 。我们以往的 研究采用的是人胃癌裸小鼠的皮下移植瘤模型 , 皮 下移植瘤虽基本保持了来源肿瘤的组织结构和生化 特性 ,但这种肿瘤一般具有包膜 , 因此缺乏恶性肿瘤 的转移特征。本研究采用人胃癌裸鼠原位移植模 型 ,观察胃肠安对裸鼠原位移植瘤生长和转移的抑 制作用。现报道如下。 1 材料与方法 1 .1 材料 1 .1 .1 实验动物 6～7 周龄 BALB/ C-nu/ nu雄性 裸小鼠 66 只 , 体质量 18～22 g, 由上海市肿瘤研究 所提供。按清洁级动物实验要求分笼饲养与管理。 1 .1 .2 细胞株及移植瘤种 SGC-7901 人胃癌细胞 株 ,中国科学院上海市细胞库提供。经体外和体内 传代形成稳定的皮下移植瘤 , 体内第 3 代作为移植 瘤种。 1 .1 .3 药物 胃肠安煎剂由太子参、炒白术、茯苓、 白扁豆、红藤、生牡蛎、夏枯草等组成 , 水煎浓缩成含 生药 0 .12 g/ ml 的煎剂 ; 5-FU 注射液 , 上海旭东海 普药业有限公司生产 (批号 : 030601 ) , 使用前用生理 盐水配制成浓度为 2 .5 mg/ ml 的 5-FU 溶液。 1 .2 实验方法 1 .2 .1 模型建立与分组给药 ( 1) 原位移植瘤模型 的建立[ 5 ] 。从 66 只裸小鼠中随机选取 41 只行人胃 癌裸 小 鼠 原 位 移 植。术 前 禁 食 12 h, 氯 胺 酮 20 mg/ kg腹腔注射麻醉 , 处死荷瘤鼠后 , 无菌操作 完整取下肿瘤组织 , 剪取直径 3 mm左右的肿瘤组 织 (约 150 mg) 。常规裸小鼠皮肤消毒后 , 行腹部左 侧正中旁切口 ,打开腹腔 , 将胃拉出 , 用医用无损伤 缝线行胃壁浆膜层荷包缝合 (直径约 0 .5 cm) , 用眼 科剪剪开荷包中心胃壁浆肌层 , 制备胃黏膜小囊。 将肿瘤组织包埋于小囊内 , 扎紧荷包缝线后分别缝 合腹膜和皮肤。造模后 41 只裸小鼠随机分为 3 组 : 胃肠安组 13 只 , 5-FU 组 14 只和生理盐水对照组 14 只。造模后第 28 天起 , 胃肠安组予以胃肠安煎 剂灌胃 , 0 .5 ml/ d; 5-FU组予以 5-FU 腹腔化疗 , 50 mg/ kg,每周 1 次 ; 生理盐水对照组予以生理盐 水灌胃 , 0 .5 ml/ d。各组用药直至造模后第 63 天。 造模后第64 天处死动物。 (2 ) 皮下移植瘤模型的建 立。25 只裸小鼠行皮下移植瘤接种造模。采用套 管针法 ,将直径 1 .5 mm的肿瘤组织接种于裸小鼠 右侧颈背部。接种后的裸小鼠随机分为 3 组 : 胃肠 安组 8 只 , 5-FU 组 9 只和生理盐水对照组 8 只。造 模后胃肠安组予以胃肠安煎剂灌胃 , 0 .5 ml/ d; 5-FU组予以 5-FU 腹腔化疗 , 50 mg/ kg, 每周 1 次 ; 生理盐水对照组予以生理盐水灌胃 , 0 .5 ml/ d。各 组用药直至造模后第 40 天。造模后第 41 天处死动 物。 1 .2 .2 观察项目 ( 1) 动物一般状况。记录每组动 ·973·中西医结合学报 2005 年 9 月第 3 卷第 5 期 J Chin Integr M ed, September 2005 , Vol .3 , No .5 物每周的进食量、体质量、粪便及活动情况。 ( 2 ) 肿 瘤抑制率。处死动物后 ,称取肿瘤质量 , 计算肿瘤抑 制率。肿瘤抑制率 = (生理盐水对照组肿瘤质量 - 用药组肿瘤质量 )/ 生理盐水对照组肿瘤质量× 100%。 ( 3) 病理组织学。观察腹腔淋巴结、肝脏、腹 膜和横膈等处的肿瘤转移情况。取转移灶作常规固 定、切片、染色后 ,行光镜观察。 ( 4) 皮下移植瘤增殖 细胞 核 抗 原 ( proliferating cell nuclear antigen, PCNA )和细胞凋亡。PCNA 鼠单克隆抗体和 3 , 3’- 二氨基联苯胺 ( 3 , 3’-diaminobenzidine, DAB ) 底物 购自上海长岛生物科技有限公司 , 采用免疫组织化 学法检测[ 6 ] 。细胞凋亡采用免疫组织化学法和末端 脱氧核苷酰基转移酶介导性 dU TP 切口末端标记 法检测[ 7 ] , 试剂盒购自上海罗氏诊断试剂公司 ,蛋白 酶 K 购自 Calbiochem公司。 1 .3 统计学方法 采用 SPSS 10 .0 软件进行统计 学分析 ,计量资料采用方差分析 , 计数资料采用卡方 检验。 2 结 果 2 .1 胃肠安对人胃癌裸小鼠原位移植瘤及皮下移 植瘤的生长抑制作用 人胃癌裸小鼠原位移植瘤胃 肠安组、5-FU 组的瘤重分别为 ( 1 .82± 1 .42 ) g 和 (1 .91± 1 .12 ) g, 与生理盐水对照组的 ( 3 .08 ± 1 .68 ) g比较有明显降低 , 差异有统计学意义 ( P < 0 .05 ) ; 胃肠安组、5-FU 组的肿瘤抑制率分别为 40 .82%和 37 .92%。人胃癌裸小鼠皮下移植瘤胃 肠安组、5-FU 组的瘤重分别为 (0 .99± 0 .76 ) g 和 (0 .77±0 .48) g,与生理盐水对照组的 ( 1 .93±0 .58 ) g比较有明显降低 , 差异有统计学意义 ( P < 0 .05 或 P < 0 .01) ;胃肠安组瘤重大于5-FU组 , 但差异无统 计学意义 ;胃肠安组、5-FU 组的肿瘤抑制率分别为 48 .70% 和 60 .10 %。说明胃肠安可抑制人胃癌裸 小鼠原位移植瘤及皮下移植瘤的生长。 2 .2 胃肠安对人胃癌裸小鼠原位移植瘤转移的影 响 胃肠安组和 5-FU 组胃周、肝门淋巴结转移 , 肝、横膈和腹膜转移比生理盐水对照组明显减少 ; 胃 肠安组和 5-FU 组总转移率与生理盐水对照组相比 有明显降低 , 差异有统计学意义 ( P < 0 .05 ) ; 胃肠 安组和 5-FU 组总转移率的比较无统计学差异。见 表 1。 2 .3 胃肠安对人胃癌裸小鼠皮下移植瘤 PCNA 和 细胞凋亡的影响 胃肠安组和 5-FU 组皮下移植瘤 PCNA 总阳性率低于生理盐水对照组 , 差异有统计 学意义 ( P < 0 .05 或 P < 0 .01 ) ; 胃肠安组 PCNA 总阳性率与 5-FU 组比较 , 差异无统计学意义 ; 胃肠 安组和 5-FU 组细胞凋亡指数高于生理盐水对照 组 ,差异有统计学意义 ( P < 0 .01 ) ; 胃肠安组细胞 凋亡指数比 5-FU 组高 , 差异有统计学意义 ( P < 0 .05 )。见表 2。 表 1 胃肠安对人胃癌裸小鼠原位移植瘤转移的影响 Tab 1 Tumor metastasis of orthotopic transplant nude mouse model of human gastric cancer in 3 groups ( % ) Group n Perigastric lymph nodes Liver L ymph nodes in the porta hepatis Diaphragm Peri toneum Total metastasis rate WCAD- treated 13 F0 ¢7 C.69 ( 1/ 13 ) 0 ™7 q.69 (1/ 13 ) 15 �.38 ( 2/ 13 ) 30 †.77( 4/ 13 ) * 5-FU- treated 14 F0 ¢21 X.43 ( 3/ 14 ) 0 ™0 )14 �.29 ( 2/ 14 ) 28 †.57( 4/ 14 ) * Untreated control 14 F7 ê.14 ( 1/ 14) 50 (7/ 14 ) 28 è.57 ( 4/ 14 ) 28 x.57 ( 4/ 14 ) 42 �.86 ( 6/ 14 ) 71 ƒ.43 (10/ 14 ) * P < 0 .05 , vs untreated control group 表 2 胃肠安对胃癌裸小鼠皮下移植瘤 PCNA 和细胞凋亡的影响 Tab 2 Expression of PCNA and apoptotic index in subcutaneous transplant nude mouse model of human gastric cancer in 3 groups ( x± s, % ) Group n Total PCNA - positive rate A poptotic index WCAD-treated 8 A39 ý.03±7 .37 * * 9 ].72±4 .51 * * △ 5-FU-treated 9 A43 ý.48±19 .77 * 5 ].74±1 .75 * * Untreated control 8 A62 ý.26±13 .80 2 ].45±1 .37 * P < 0 .05 , * * P < 0 .01 , vs untreated control group; △ P < 0 .05 , vs 5- FU-treated group 3 讨 论 进展期胃癌患者多出现肿瘤复发、转移和恶液 质 ,严重影响患者的生命质量。运用中医健脾治则 治疗进展期胃癌的研究表明 : 一些健脾类中药复方 能延长胃癌患者的生存期和提高生命质量 [ 3 ] 。因 此 ,研究中药复方对人胃癌裸鼠原位移植瘤生长和 转移的抑制作用及探讨其作用机制 , 具有十分重要 的临床意义。胃癌原位移植肿瘤模型能动态地反映 胃癌从原位生长、局部浸润到远处转移的发展过程 , 充分体现了胃癌的生长和转移特点。本实验中我们 ·083· 中西医结合学报 2005 年 9 月第 3 卷第 5 期 J Chin Integr M ed, September 2005 , Vol .3 , No .5 采用胃小囊法建立了人 SGC-7901 胃癌细胞裸小鼠 原位移植模型 ,并以生理盐水和 5-FU 作为对照 , 观 察胃肠安煎剂对原位移植瘤腹腔转移的影响 ; 同时 我们也应用胃癌裸小鼠皮下移植瘤模型观察了胃肠 安煎剂对皮下移植瘤生长的影响。在原位移植瘤造 模过程中 , 41 只裸小鼠胃原位肿瘤移植成功率为 100%。随着实验的进展 , 我们观察到因原位移植肿 瘤增大 ,裸小鼠出现进食减少、消瘦和活动减少等现 象 ,符合晚期胃癌患者的临床表现。实验结果表明 : 胃肠安组和 5-FU 组原位移植瘤的瘤重明显小于生 理盐水对照组 ,抑瘤率情况与我们以往的研究结果 相仿 [ 4 ] 。在皮下移植瘤模型中 , 胃肠安组和 5-FU 组的瘤重明显小于生理盐水对照组。说明胃肠安煎 剂可抑制人 SGC-7901 胃癌裸小鼠移植瘤的生长。 本实验中 , 我们发现原位移植瘤模型生理盐水 对照组裸小鼠出现了较多的转移灶 (胃周淋巴结、肝 脏、肝 门淋 巴 结、横膈 和 腹膜 转 移 ) , 总转 移 率 71 .43%。说明人胃癌裸小鼠原位移植瘤模型是有效 的。胃肠安组和 5-FU 组的总转移率明显低于生理 盐水对照组。胃肠安组肝转移率为 7 .69% , 明显低 于 5-FU 组的 21 .43% , 可能是由于胃肠安煎剂灌胃 后经门静脉系统吸收 ,肝内药物浓度较高 , 降低了肝 脏的转移 ;5-FU 组横膈和腹膜转移率低于胃肠安组 的原因可能亦是由于 5-FU 腹腔化疗降低了肿瘤的 腹膜转移。胃肠安组和 5-FU 组总转移率降低说 明 :临床运用中西医结合治疗为主的综合治疗方案 治疗胃癌术后的患者 ,有可能会进一步提高疗效 , 降 低胃癌术后的复发和转移。 PCNA 是一种分子量为 35 000 的核蛋白 ,它的 高表达与细胞的增殖状态密切相关。有报道表明 : PCNA 与胃癌的浸润、生长和淋巴结转移关系密 切 [ 8 ] 。凋亡指数反映了细胞程序性死亡的程度 , 其 指数的增高反映了药物的抑瘤效果。本实验中 , 胃 肠安组 PCNA 总阳性率较生理盐水对照组明显降 低 ,凋亡指数较生理盐水对照组和 5-FU 组亦有明 显升高。说明胃肠安煎剂对移植瘤生长的抑制作用 可能是通过诱导胃癌细胞凋亡实现的。胃肠安煎剂 是以太子参、炒白术、茯苓等健脾药物为基础组成的 中药复方 ,临床应用及实验研究证明其不仅具有明 确的健脾作用 , 对胃癌亦有一定的治疗效果。本实 验中 ,我们选用人胃癌裸小鼠原位移植瘤模型 , 动物 显现出食欲不振、进食减少、消瘦、大便溏薄等中医 脾虚症候 , 运用胃肠安煎剂治疗后取得了与 5-FU 组相似的抑制胃癌生长和转移的疗效。我们还观察 到 5-FU 组虽然有较高的抑瘤率 , 但裸小鼠经化疗 后普遍变得瘦小、活动减少、皮肤粗糙 , 有的甚至出 现了脱肛等严重的脾虚症候。今后可通过延长实验 观察时间 ,计算生存期和肿瘤转移情况 , 以获得进一 步的实验结果。 [参考文献 ] 1 李佩文 . 中医药对维护肿瘤患者生活质量的作用 [ J ] . 中 华肿瘤杂志 , 2002 , 24( 2) : 203-204 . 2 王坤根 . 中医辨证治疗胃癌 93 例 [ J ] . 中医杂志 , 2004 , 45 (6) : 441-442 . 3 邱佳信 , 贾筠生 , 杨金坤 , 等 . 健脾法为主治疗晚期胃 癌的探讨 [ J ] . 中医杂志 , 1992 , 33 (8) : 23-25 . 4 赵爱光 , 杨金坤 , 赵海磊 . 健脾中药诱导人胃癌细胞裸 小鼠移植瘤细胞凋亡的实验研究 [ J ] . 世界华人消化杂 志 , 2000 , 8(7 ) : 737-740 . 5 赵爱光 , 赵海磊 , 杨金坤 , 等 . 人胃癌原位移植模型中 宿主脾虚证的探讨 [ J ] . 中国中西医结合消化杂志 , 2001 , 9( 4) : 198-200 . 6 王立生 , 潘令嘉 , 郑跃杰 , 等 . 双歧杆菌对裸鼠腹腔巨 噬细胞分泌 IL-1 以及 I L-2 的影响 [ J ] . 中国肿瘤生物治 疗杂志 , 1998 , 5(3 ) : 214 , 203 . 7 Zhao AG, Zhao HL , J in XJ , et al . 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