酪氨酸酶抑制剂的研究进展

第 46 卷 　第 2 期 厦门大学学报 (自然科学版) Vol. 46 　No. 2 　2007 年 3 月 Journal of Xiamen University (Nat ural Science) Mar. 2007 　 ·综　述· 酪氨酸酶抑制剂的研究进展 陈清西 ,林建峰 ,宋康康 (厦门大学生命科学学院 ,细胞生物学与肿瘤细胞教育部重点实验室 ,福建 厦门 361005) 　　 收稿日期 :2006211224 基金项目 :国家自然科学基金 (30570408) 和福建省重点科技项目 (2004N002)资助 Email :chenqx @xmu. edu. cn 摘要 : 酪氨酸酶 ( EC 1. 14. 18. 1 ,PPO) ,是一种含铜糖蛋白 ,广泛存在于自然界中. 它是生物体合成黑色素的关键酶 ,而 且与果蔬褐化、昆虫皮鞣化、人的色素障碍性疾病及恶性黑色素肿瘤的发生与治疗有重要关系. 目前 ,酪氨酸酶抑制剂 已被用于果蔬保鲜、化妆品中的增白剂、生物农药的杀虫剂添加物. 对酪氨酸酶抑制剂的研究已引起国内外的广泛重视 , 现已研究出许多具有新型结构的酪氨酸酶抑制剂. 为了得到高效的酪氨酸酶抑制剂 ,对各种类型的化合物构效关系及抑 制机理的研究是非常必要的. 关键词 : 酪氨酸酶 ;抑制剂 ;构效关系 ;抑制机理 ;应用 中图分类号 :Q 356. 1 　　　　文献标识码 :A 　　　　　文章编号 :043820479 (2007) 0220274209 　　酪氨酸酶 ( EC 1. 14. 18. 1 , Tyrosinase) 又称酚氧 化酶、多酚氧化酶、儿茶酚氧化酶 ,是结构复杂的多亚 基的含铜氧化还原酶 ,广泛存在于微生物、动植物及人 体中[ 1 ] . 酪氨酸酶具有独特的双重催化功能 ,是生物体 内黑色素合成的关键酶 ,与人的衰老 ,昆虫的伤口愈合 与发育 ,果蔬的褐变有密切关系[2 - 3 ] . 多年来 ,酪氨酸 酶一直受到国内外的关注 ,其研究涉及生物、医学、农 学、化学、药学等多个学科和领域. 酪氨酸酶作为黑色素合成的关键酶 ,其异常过量 表达可导致人体的色素沉着性疾病. 在果蔬中是导致 褐变的主要酶类. 因此 ,酪氨酸酶抑制剂可以治疗目前 常见的色素沉着皮肤病如雀斑、黄褐斑、老年斑. 目前 , 市场上流行的美白化妆品中其增白剂均是酪氨酸酶抑 制剂如熊果甙[ 4 ] 、维生素 C 衍生物[ 5 ] 、及一些中药提 取物[ 6 ]等. 酪氨酸酶抑制剂也被用作食品保鲜剂 ,如 42 已基间苯二酚已被用于虾的保鲜[7 ] . 昆虫表皮的酪氨 酸酶产生的黑色素可以保护昆虫免受紫外线的辐射 , 酪氨酸酶也与昆虫蜕皮过程中的鞣化作用有关[8 ] . 因 此 ,酪氨酸酶是昆虫赖于生存的一种重要的酶. 对该酶 抑制剂的研究将在新型的生物杀虫剂的中起指导 作用. 鉴于酪氨酸酶抑制剂的广泛应用 ,国内外很多学 者致力于寻找具有特异的、高效的酪氨酸酶抑制剂 ,研 究抑制作用机理、抑制动力学、以及抑制剂的应用. 本 实验室研究人员致力于筛选酪氨酸酶抑制剂 ,主要有 以下 3 个渠道 : (1)从天然植物组织分离提取 ; (2)从商 品化合物筛选 ; (3) 有机合成出新的化合物. 本文中我 们重点有关酪氨酸酶抑制剂的作用机理及其构效 关系 ,为该酶抑制剂的研发与应用奠定基础. 1 　含酚基的化合物对酪氨酸酶的抑制 作用 羟基苯甲酸和羟基苯甲醛对酪氨酸酶均有明显得 抑制作用 ,表 1 列出我们研究的几种该类物质的作用. 从表 1 可以看出 ,单酚基化合物对蘑菇酪氨酸酶均表 现为竞争性抑制类型 ,并且 ,对位的抑制强度明显高于 邻位或间位 ,提高幅度达 2～3 倍. 熊果甙也是一种含 酚基的化合物 ,对酪氨酸酶也有抑制作用 ,虽然其抑制 效应明显比羟基苯甲醛和羟基苯甲酸差[ 9 - 10 ] ,但由于 其副作用较小 ,已作为增白剂添加入美白化妆品中[4 ] . 表 1 　酚基化合物对蘑菇酪氨酸酶抑制效应 　Tab. 1 　Inhibitory effect s of phenol compounds on mush2 room tyrosinase 化合物 I C50 / (mmol ·L - 1 ) 抑制类型 抑制常数/ (mmol ·L - 1 ) o2羟基苯甲醛 [9 ] 2. 85 竞争性 1. 66 m2羟基苯甲醛 [9 ] 3. 70 竞争性 2. 20 p2羟基苯甲醛 [9 ] 1. 15 竞争性 0. 69 o2羟基苯甲酸 [10 ] 4. 30 竞争性 2. 50 m2羟基苯甲酸 [10 ] 4. 20 竞争性 2. 38 p2羟基苯甲酸 [10 ] 1. 30 竞争性 0. 73 p2氰基苯酚 [11 ] 0. 80 竞争性 0. 31 熊果甙 [4 ] 5. 30 竞争性 2. 98 　　含间苯二酚结构的化合物大多是酪氨酸酶的抑制 剂 ,当对位存在取代基时 ,这类化合物具有很强的酪氨 酸酶抑制活性. 研究表明 ,它们可以与酪氨酸酶的双铜 离子活性中心结合 ,大多数是酪氨酸酶的竞争性抑制 剂. 目前 , 42己基间苯二酚已作为商品用于虾的保 鲜[7 ] . 2 　芪类及其类似物对酪氨酸酶的抑制 作用 1 ,22二苯乙烯 (Stilbene ,芪 ,化学结构式见图 1)化 合物广泛的存在于植物体内 ,具有重要的生物活性 ,因 此这类结构的抑制剂的研究引起了广泛的关注. 从大 绿柄桑木 Chlorop hora excelsa 的心材中分离得到带 氯菌素[12 ] 、从葡萄等植物中提取出的白藜芦醇 ( Res2 verat rol) [13 ] ,以及从桑 M orus alba 中提取出的氧化白 藜芦醇 (Oxyresverat rol) [14 ] ,均是很强的酪氨酸酶抑 制剂 ,它们的 I C50值分别为 1. 3、54. 6 和 1. 5μmol/ L . Ohguchi 等从买麻藤属 Genus gnet um 提取的买麻藤 醇 ( Gnetol)可以抑制 B16 黑色素的合成[15 ] . 上述这些 从天然植物提取到有机物均是芪类衍生物 ,在 1 ,22二 苯乙烯衍生物的结构核上取代基的性质、位置、数目对 酪氨酸酶的抑制强度有直接的关系. 当只有一个羟基 取代基时 ,该羟基芪没有抑制酪氨酸酶的活性 ;当结构 中有两个羟基时 ,对酪氨酸酶的抑制活性显著增强 ;带 有羟基取代基的比带有甲氧基的芪化合物抑制酪氨酸 酶的活性更强 ;反式芪才有很强的抑制活性 ,而且化合 物结构中烯烃结构的存在对于化合物抑制酪氨酸酶活 性是必要的. 类似于芪类化合物的结构 ,查耳酮类化合物[ 16 ] 也 具有抑制酪氨酸酶的活性. 对该类物质的构效关系研 究表明 :当查耳酮不含羟基或 A 环上的羟基取代基团 不超过 2 个 ,则化合物没有抑制酪氨酸酶的活性 ;而当 B 环上引入羟基则可以大大增强其抑制活性 ;如果化 合物中同时存在儿茶酚和间苯二酚结构时 ,其抑制活 性大大加强. 相较于其结构类似物 芪类化合物 ,查 耳酮类化合物羟基取代基团数目增加不一定会增加其 抑制活性 ,而芪类化合物可以通过增加羟基的数目而 增强其抑制活性. 这可能是由于芪类化合物是几何对 称的 ,而查耳酮几何不对称 ,一个苯环连羰基 ,一个连 接乙烯基. 42位羟基对于查耳酮类化合物的抑制活性 具有重要作用. 而 2′2位引入羟基将导致该类化合物发 生构象扭转 (A 环旋转 47°) ,使化合物难以与酶结合 , 降低其抑制活性. 当第 3～4 个羟基的引入则可使化合 物的抑制活性恢复. 该类化合物对单酚酶活性的抑制 　图 1 　芪 (a)和查耳酮 (b)化合物的化学结构式 　Fig. 1 　Chemist ry st ructures of stilbene (a) and chal2 cones (b) 　　a : R3 = R5 = R7 = R3′= R4′= O H ; R6′= H b : R3 = R5 = R7 = O H ; R3′= R4′= R6′= H c : R3 = R7 = R3′= R4′= O H ; R5 = R6′= H d : R3 = R7 = R4′= O H ; R5 = R3′= R6′= H e : R3 = R5 = R7 = R4′= R6′= O H ; R3′= H f : R5 = R7 = R3 = R4′= O H ; R3 = R6′= H g : R5 = R7 = R4′= O H ; R3 = R3′= R6′= H h : R5 = R7 = O H ; R3 = R3′= R4′= R6′= H i : R5 = R7 = R3′= R4′= O H ; R6′= H ; R3 = OX 　图 2 　类黄酮 (a)栎精 ; (b)高良姜精 ; (c) 非瑟酮 ; (d) 3 ,7 ,42 三羟基黄酮 ; (e) 桑色素 ; (f) 毛地黄黄酮 ; (g) 芹 菜素 ; (h) 5 ,72二羟基黄酮 ; (i)栎精232芸香糖甙的 化学结构 　Fig. 2 　Chemist ry st ructures of flavonoids (a) quercetin ; (b) galangin ; (c) fisetin ; (d) 3 ,7 ,42t rihydroxyflavone ; ( e) morin ; (f ) luteolin ; ( g) apigenin ; (h) chrysin ; (i) quercetin232rutinoside 强于对二酚酶抑制的强度. 3 　黄酮类物质对酪氨酸酶的抑制作用 黄酮类化合物 (化学结构式见图 2) 广泛存在于植 物中 ,尤其是许多中药材中含量丰富 ,属于酚类化合 物 ,植物中的黄酮大体上可分为“黄酮类”与“黄烷酮 类”两大类物质. 已知化学结构的黄酮类物质至少有 ·572·第 2 期 　　　　　　　　　　　　　　　　陈清西等 :酪氨酸酶抑制剂的研究进展 4 000余种 ,其中包括人们熟知的茶多酚 (儿茶素) 、大 豆异黄酮 (染料木素与黄豆甙)和来自柑橘的橙皮甙与 柚甙等[17 ] . 黄酮具有多种药理作用 ,其中包括 :抗氧化 作用、消炎作用、抗癌和抗基因诱变作用[18 ] . 近年来 , 许多富含黄酮类物质的植物天然提取物 (如银杏、甘草 提取物)应用于化妆品中[19 - 20 ] . 同芪类化合物一样 ,黄 酮类化合物也是酪氨酸酶的有效抑制剂. Xie 等[21 ] 研 究了一系列黄酮类化合物对酪氨酸酶活力的影响 ,实 验结果表明 :栎精 (a) ,高良姜精 ( b) ,非瑟酮 (c) ,3 ,7 , 42三羟基黄酮 (d) ,和桑色素 (e) 这些黄酮醇是酪氨酸 酶的竞争性抑制剂. 根据它们的结构可以推测它们是 以螯合酶活性中心的铜来抑制酶活力. 而相应的黄酮 : 毛地黄黄酮 (f) ,芹菜素 (g)和 5 ,72二羟基黄酮 (h)就无 法螯合酶活性中心的铜. 另外 ,如果 32羟基被一个大 的基团如芸香糖苷保护起来 ,栎精232芸香糖甙也无法 　图 3 　黄酮醇螯合活性中心的铜从而抑制二酚酶活力的 机理 　Fig. 3 　Inhibitory mechanism of flavonols on diphenolase activity through chelating the active site of tyrosi2 nase 抑制酶活性. 有一个游离的 32羟基对黄酮醇的螯合能 力似乎是必须的. 这些黄酮醇螯合活性中心的铜从而 抑制二酚酶活力的机理如图 3 所示. 这一螯合反应是 可逆的 ,而底物对酶有很强的保护作用. 底物的存在可 以阻止黄酮醇对酶的抑制. 桑色素 ( e) 对栎精 ( a) 的 I C50值比例是 14. 4 ,而它们抑制常数 KI 的比率是 14. 3 ,表明栎精 (a)对蘑菇酪氨酸酶的抑制力比桑色素 (e)强 14 倍. 栎精 (a) 和桑色素 (e) 的抑制力区别来源 于他们 B 环取代基的不同. 桑色素 (e) 的 32和 2′2羟基 之间形成分子内氢键干扰了 32氢键和 42羰基与酶活 性中心的铜形成螯合构象 ,因此对酶的抑制力较低. 在毛地黄黄酮 (f ) ,芹菜素 (g) 和 5 ,72二羟基黄酮 (h)这三种黄酮之中 ,毛地黄黄酮 (f)的抑制力最大 ,芹 菜素 (g)抑制力很小 ,而 5 ,72二羟基黄酮 ( h) 基本没有 抑制力. 他们结构上的不同主要在于 B 环的羟取代 基. 3′,4′2双羟基取代比 42羟基取代有更大的抑制力 , (f) > (g) . B 环有羟基取代的比没有的抑制力大 , ( g) > (h) . 在黄酮醇里也有类似的结果 ,抑制强度排序为 (a) > (b) , (c) > (d) . 从酶学的角度看含酚羟基类化合物的抑制机理 : 因为酪氨酸酶的活性中心的环境是疏水的 ,与 Eoxy中 双氧结合的质子只能来自于酪氨酸和多巴分子中的羟 基 ,因此酪氨酸和多巴与 Eoxy必需以 HA 酸的形式结 合 ,实验证明 ,同一种 HA 酸在其它条件不变的情况 下 ,它的抑制作用随 p H 值的增大而减弱[22 ] , HA 酸中 含羟基的芳环化合物对酪氨酸酶的作用机理与酪氨酸 和多巴的相似 ,它们通过与酪氨酸和多巴竞争 Eoxy和 Emet . 把一部分酪氨酸酶从黑色素合成的催化环中带 走 ,降低酪氨酸酶在其中的浓度 ,从而抑制黑色素的合 成 ,不过它们中的一部分被氧化后的产物对细胞有副 作用[ 23 ] . 但随着黄酮类新化合物的发现 ,如从福树 Gar2 ci ni a subel l i pt ica 叶子部分的甲醇提取物中分离纯化 出两种二黄酮化合物[24 ] ,从苦参 S op hora f l avescens 的根部甲醇提取物中提取出三个黄酮类化合物[25 ] . 这 些黄酮类化合物中 32位均不存在羟基 ,但抑制活性均 很强 ,后三种化合物甚至强于曲酸的抑制强度. 但这几 种化合物中均具有间苯二酚的结构 ,说明 32位不是黄 酮类具有抑制活性所必须的 ,而间苯二酚的结构对于 该类化合物的抑制活性具有重要的影响. 4 　醛类化合物对酪氨酸酶的抑制作用 醛类化合物可以从植物中提取 ,如茴香醛[26 ] 、枯 茗醛[ 27 ] 、对甲氧基水杨醛[28 ] . 该类化合物主要是通过 羰基与酪氨酸酶活性中心周围的亲核基团如 - SH、- N H2 、- O H 结合[27 ] ,形成稳定的螯合配体结构 (席夫 碱结构) ,生成的产物在酪氨酸酶的疏水性环境中能稳 定存在 ,并在活性中心周围形成空间位阻 ,阻止底物与 活性中心作用 ,从而抑制酪氨酸酶的催化活性 ,抑制黑 色素的合成. 由对天然提取的醛类化合物进行化学改 造 ,研究其抑制酪氨酸酶的构效关系. 结果表明 ,在醛 基化合物的对位引入推电子基团将使化合物对酪氨酸 酶的抑制强度明显增强 ,并且随着推电子基团推电子 能力的增强 ,其抑制强度也增大. 例如 ,对甲氧基水杨 醛和对异丙基水杨醛对酪氨酸酶的抑制强度分别是水 杨醛的 34 倍和 237 倍[28 ,9 ] . 醛肟类化合物的对位引入 ·672· 厦门大学学报 (自然科学版) 　　　　　　　　　 　　　　　　　　　2007 年 羟基或是甲氧基时 ,该类化合物具有很强的抑制酪氨 酸酶的活性 ,对位带有取代基的单取代、二取代均好于 三取代化合物. 第三个取代基的引入形成了空间位阻 , 降低了其抑制酪氨酸酶的活性[29 ] . 例如 ,3 ,42二羟基 苯甲醛 O2乙烷基肟对酪氨酸酶抑制的半抑制浓度 I C50是 0. 30μmol/ L [29 ] . 并且还研究了 3 ,42二羟基苯 乙氰和 42羟基232甲氧基苯乙氰对酪氨酸酶的影响 ,它 们是对应的苯甲醛肟类化合物的氧化产物. 42羟基232 甲氧基苯乙氰没有抑制活性 ,而 3 ,42二羟基苯乙氰的 抑制活性低于对应的苯甲醛肟类化合物的抑制活性. 这说明肟基相较于氰基具有更强的抑制酪氨酸酶的活 性. 5 　羧基化合物作为酪氨酸酶抑制剂的 抑制机理以及构效关系 带有羧基的化合物如苯甲酸[30 ] 、枯茗酸 ( Cumic acid) [31 ] 、肉桂酸类衍生物[32 ] 等对酪氨酸酶都有显著 的抑制作用. 苯甲酸族化合物 ,在苯环的取代基团的类 型与位置对于该类化合物的抑制活性也有重要的影 响 ,也就是说研究抑制剂与酪氨酸酶的构效关系在抑 制剂的研究中是非常重要的. 从酶学的角度来看 ,带羧 基类化合物对氧化态的酶 ( Eoxy ) 的作用机理与酪氨酸 酶与底物的作用机理不同. 因为羧基是强吸电子基 ,它 抑制了 Eoxy中的氧原子与芳环的取代反应 ,于是 Eoxy 与之形成的化合物成了终端化合物 ,从而降低了黑色 素合成过程中的酪氨酸酶浓度 ,抑制黑色素的合成. 羧 酸型抑制剂也能通过与酪氨酸竞争 Emet来抑制黑色素 的合成 ,这有待于用实验进一步证实. 　图 4 　慢结合抑制的模型 　Fig. 4 　Slow2binding inhibitory mechanism通过对具有不同取代基的苯甲酸类衍生物的抑制活性进行研究[10 ,31 ] ,结果表明 :42烷基取代苯甲酸化合物随着对位烷基碳链长度的增加 ,该类化合物对酪氨酸酶的抑制活性增强. 当取代烷基碳链长度为 8 个碳时 ,对酶的抑制活性最强. 由此 ,可推测在酶活性中心附近可能存在一个疏水的狭缝 ,有利于一定长度的碳链插入 ,使酶与抑制剂的结合更加紧密. 同时 ,烷基取代位置的不同 ,可导致化合物抑制类型发生改变. 当烷基在邻位和间位取代时 ,化合物的抑制类型是混合型 的 ;而当烷基取代基团在羧基的对位时 ,化合物是酪氨 酸酶的反竞争型抑制剂. 也就是说 ,42烷基取代苯甲酸 只与酶与底物的复合物作用. 当底物和酶结合时 ,诱导 酶活性中心附近形成一个疏水的狭缝 ,使 42烷基取代 苯甲酸与酶结合而抑制酪氨酸酶的活性. 但 42烷氧基 取代苯甲酸化合物对酪氨酸酶的作用不同于 42烷基 取代苯甲酸化合物 ,碳链长度对于该类化合物对酶的 抑制效应没有太大的影响. 由此可以推测 ,含苯环的抑 制剂 ,其烷氧取代基与烷基取代基对酪氨酸酶的抑制 机理不同. 　图 5 　苯基硫脲与酪氨酸酶 ( Emet ) 复合体活性中心的结 构 [36 ] 　Fig. 5 　The st ructure of phenyl thiourea binging to the active site of tyrosinase ( Emet ) 对水杨酸进行结构改造 ,比较其抑制酪氨酸酶的 构效关系[33 ] . 对位烷氧基取代水杨酸比对应的对烷氧 基取代苯甲酸的抑制活性弱. 由此可以看出 ,化合物的 羧基在抑制作用中起着关键性的作用 ,当羧基邻位引 入羟基时 ,使之产生空间位阻 ,阻碍抑制剂与酶的作 用 ,从而使其抑制活性降低. 同时 ,苯环上取代基的位 置对于抑制剂抑制活性的影响也是非常重要的. 当取 代基团位于水杨酸基团的对位时 ,化合物的抑制活性 最强. 其次是间位 ,水杨酸的邻位取代化合物的抑制活 性最弱. 6 　硫化合物作为酪氨酸酶抑制剂的抑 制机理以及构效关系 从黑白块菌中提取出两种含硫的香味化合物[34 ] , 它们与酪氨酸酶的结合是属于缓慢结合型 ( slow2 binding) ,类似的结合机理也在 L2含羞草氨酸 ( L2mi2 mo sine) 、Troplone、m2香豆素等中发现[35 ] . 其可逆的 结合模型表示如图 4. L2Mimosine 的抑制活性强于半 胱氨酸和谷胱苷肽的抑制活性. 在一定时间内 ,反应初 速度降低得到抑制稳态速度. 随着抑制剂浓度的增加 , 反应初速度和抑制稳态速度均降低. 抑制剂与酶迅速 形成抑制剂酶的复合物 ,随后酶催化反应进行相对缓 慢的可逆反应. 苯基硫脲、二硫苏糖醇和巯基乙醇 ,也 是含硫化合物 ,它们均是酪氨酸酶的抑制剂 ,所不同的 ·772·第 2 期 　　　　　　　　　　　　　　　　陈清西等 :酪氨酸酶抑制剂的研究进展 是这些化合物对酪氨酸酶的抑制作用是不可逆的. 硫 脲与酪氨酸酶还原态形式的酶结合 (图 5) ,将导致永 久性失活 ,其抑制作用主要是通过硫脲上的硫取代 Emet活性中心两个铜离子之间的氢氧化物桥联配体 , 从而与酶活性中心形成很牢固的结合 ,使化合物具有 不可逆抑制酪氨酸酶的活性. 含硫化合物中 ,亚硫酸盐 及二氧化硫也均是酪氨酸酶的强效抑制剂 ,曾经作为 果蔬的常用保鲜剂 ,由于安全性问题已被禁用. 　图 6 　杂环类化合物酪氨酸酶抑制剂的分子结构 　Fig. 6 　Chemist ry st ructures of heterocyclic compounds as inhbitors on tyrosinase 巯基化合物是酪氨酸酶独特的抑制剂 ,例如半胱 氨酸、L2半胱氨酸二羧酸盐、半胱氨酰色氨酸等半胱氨 酸衍生物以及卡托普利 (Captop ril) [37 ] 、甲巯咪唑 ( Th2 iamazole)等化合物都是酪氨酸酶的有效抑制剂. 在这 些巯基化合物中的巯基具有较强的还原能力和化学反 应活性 ,可与酪氨酸酶的活性中心络合或是与酪氨酸 酶的催化产物结合形成无色化合物 ,所以对酪氨酸酶 具有很强的抑制活性. 在这些化合物中 ,有些是作为人 类疾病毒药物而得以应用. 例如 ,卡托普利是一种抗压 药物 ,甲巯咪唑被用于治疗甲状腺疾病. 在这些化合物 中 ,倘若把原子硫取代掉 ,将大大降低对酪氨酸酶的抑 制作用 ,显示硫原子的重要作用. 7 　杂环类化合物 随着酪氨酸酶抑制剂研究的深入 ,研究出许多具 有新型母核结构的抑制剂 ,化学结构式如图 6 所示. 下 面分别作简要的介绍 : (1) N2取代的亚硝基羟基胺类化合物 :亚硝基羟 基胺母核结构 (化合物 I) 基础上进行结构改造 ,其 R 取代基团为带有不同取代基及取代基位置不同的苯 环、直链、支链和环烷烃. 该类化合物可以通过互变异 构体而与酶的底物竞争结合到酶的活性中心的双铜离 子而产生抑制作用 ,其互变异构体见化合物 II. R 取代 基团可以通过位阻效应而影响化合物的生物学活性. 例如 ,铜铁试剂 ( Cupferron 化合物 III) 是酪氨酸酶典 型的抑制剂[38 ] ,我们对它的酪氨酸酶抑制作用机理及 抑制动力学进行系统地研究 ,铜铁试剂对蘑菇酪氨酸 酶的单酚酶和二酚酶活力的抑制作用 I C50分别为0. 52 μmol/ L 和 0. 84μmol/ L . 铜铁试剂对单酚酶的效应不 仅能显著地延长迟滞时间 ,而且能降低稳定态的活力. 铜铁试剂对二酚酶的效应表现为可逆的竞争性抑制类 型 ,该抑制作用可以通过加入铜离子而复活. 实验结果 表明 ,铜铁试剂对酪氨酸酶的抑制作用是通过螯合酶 活力中心铜离子而导致酶活力的丧失. Dopastin ( IV) 也是酪氨酸酶的有效抑制剂 ,其抑制作用的 I C50为 20 μmol/ L ,抑制作用表现为可逆的竞争性类型[39 ] . (2) Oxadiazole 类似物 :带氧杂环化合物 ,如化合 物 V、V I、V II ,也是酪氨酸酶的有效抑制剂[40 ] . 化合物 V 具有两个杂环 ,化合物 V I 中有一个杂环和一个苯 环 ,化合物 V II 的具有化合物 V 和化合物 V I 的结构 , 以化合物 V II 的抑制活性最强 ,它对酪氨酸酶的 I C50 为 2. 18μmol/ L . (3)含硒化合物 :硒与硫属于同族化合物 ,是生物 电子等排体 ( Classical isostar) . 具有一定结构的含硒 的化合物也是酪氨酸酶的抑制剂 ,如化合物 V III、IX、 X、XI. 化合物 X 具有吡啶五元环 ,它的抑制活性要强 于 V III、IX、XI 的活性 ,而且 ,化合物 X 对黑色素细胞 中的黑色素的生成有显著抑制作用. 在化合物 XI 系 列化合物中的 4′位甲基和 R1 取代基对其抑制活性具 有重要的影响[41 - 42 ] . 8 　卤代化合物 我们研究 42卤代苯甲酸[43 ] (42氟苯甲酸、42氯苯甲 ·872· 厦门大学学报 (自然科学版) 　　　　　　　　　 　　　　　　　　　2007 年 酸、42溴苯甲酸)对蘑菇酪氨酸酶的单酚酶和二酚酶活 力的影响 ,结果表明 ,42卤代苯甲酸对蘑菇酪氨酸酶的 单酚酶和二酚酶均有抑制作用. 它们对单酚酶的 I C50 分别为 1. 03 mmol/ L 、0. 75 mmol/ L 和 0. 60 mmol/ L ;对二酚酶的 I C50分别为 0. 26 mmol/ L 、0. 20 mmol/ L 和 0. 18 mmol/ L ;其抑制活性大小顺序是 :氟代化合 物 > 氯代化合物 > 溴代化合物. 对二酚酶的抑制作用 表现为可逆的反应 ,属于非竞争性类型 ,抑制常数分别 为 0. 25 mmol/ L 、0. 20 mmol/ L 和 0. 17 mmol/ L . 氟 代苯甲醛类 (22氟苯甲醛、32氟苯甲醛、42氟苯甲醛) 对 蘑菇酪氨酸酶的单酚酶和二酚酶也有抑制作用. 它们 对单酚酶的 I C50 分别为 1. 35 mmol/ L 、1. 18 mmol/ L 和 1. 05 mmol/ L ;对二酚酶的 I C50分别为 1. 65 mmol/ L 、1. 10 mmol/ L 和 0. 15 mmol/ L ;其抑制活性大小顺 序是 :42氟苯甲醛 > 32氟苯甲醛 > 22氟苯甲醛. 它们对 二酚酶的抑制作用也是可逆反应 ,42氟苯甲醛和 32氟 苯甲醛的抑制作用是混合型 ,而 22氟苯甲醛的抑制作 用属于竞争性类型. 22氟苯甲醛、32氟苯甲醛和 42氟苯 甲醛对游离酶的抑制常数 ( KI ) 分别是为 0. 93 mmol/ L 、0. 68 mmol/ L 和 0. 11 mmol/ L . 42氯水杨酸也是酪 氨酸酶的有效抑制剂 ,我们测定它对蘑菇酪氨酸酶的 单酚酶和二酚酶的抑制作用的 I C50 分别为 1. 89 mmol/ L 和 1. 05 mmol/ L ,42氯水杨酸也能显著地延 长单酚酶的迟滞时间 ,并且对多种微生物有抑制生长 作用 ,对大肠杆菌的最低抑制浓度 ( MIC) 为 250μg/ mL ,最低杀菌浓度 (MBC)为 500μg/ mL . 9 　从动植物体内提取生物活性物质 酪氨酸酶抑制剂广泛存在于生物有机体中 ,例如 , 从柑橘中提取的鞣酸、从苹果中纯化的苹果多酚、Car2 dol 等植物多酚类物质具有抑制酪氨酸酶的活性. 我 们曾经报道了鞣酸对蘑菇酪氨酸酶的单酚酶和二酚酶 活力的影响[44 ] . 鞣酸对单酚酶活力的影响主要表现在 它能显著延长酶作用的迟滞时间 ,而对稳态活力的影 响不大 ,但鞣酸对二酚酶活力的抑制作用很强 ,它是一 种可逆的竞争性抑制剂 , I C50为 65μmol/ L ,抑制常数 KI 为 36. 3μmol/ L . 有文献报道 ,从 Crocus sa f i v us 的 花瓣中分离纯化的化合物 (1)和 (2) [45 ] . 结构式见图 7. 它们是同分异构体 ,化合物 (1) 对酪氨酸酶没有作用 , 而 (2)具有较强的抑制活性. 说明 42位和 52位的羟基 的取向决定了该类化合物是否具有抑制酪氨酸酶的活 性.化合物 (3)是从 Crocussa f i v us 柱头中提取的新的 化合物 ,也具有很强的抑制酪氨酸酶的活性[46 ] . 从 S alsol a f oeti da 提取的化合物 (4) 、(5) 和 (6) 　图 7 　从 Crocus sa f i vus 提取的酪氨酸酶抑制剂结构 　Fig. 7 　Chemist ry st ructures of inhibitors ext racted f rom Crocus sa f i vus 　　(4) R = H , R′= H (5) R = MeO , R′= H (6) R = H , R′= Me 　图 8 　从 S alsola f oeti da 提取的酪氨酸酶抑制剂结构式 　Fig. 8 　Chemist ry st ructures of inhibitors ext racted f rom S alsola f oeti da 　图 9 　从 R hododend ron col lettianum 提取的酪氨酸酶抑 制剂结构式 　Fig. 9 　Chemist ry st ructures of inhibitors ext racted f rom R hododend ron col lettianum 结构式见图 8. 它们对酪氨酸酶有很强的抑制作用 , I C50分别为 2. 61 ,1. 85 ,0. 40μmol/ L ,化合物 (6) 的抑 制活性最强[47 ] ,比较其结构特点 ,我们可以看到 ,R 和 R′取代基团的类型在抑制作用中起作用. 从 R hodo2 dend ron col lett i anum 气生部分提取的新型化合物结 构式见图 9 ,其抑制活性 ( I C50 = 1. 33μmol/ L) 强于曲 酸的抑制活性 ( I C50 = 16. 67μmol/ L ) [48 ] . 天然提取的 化合物对酪氨酸酶有抑制活性 ,可以通过筛选这些抑 制剂 ,寻找出高效抑制酪氨酸酶活性的母核结构 ,在此 基础上对其结构进行改造 ,以设计新型高效无毒副作 用的酪氨酸酶抑制剂. 有文献报道 ,存在于蜂蜜中有一种分子量约为 600 的多肽具有抑制酪氨酸酶活性的作用[49 ] . 我们从 文蛤也分离到一个分子量为 3 147 的多肽对酪氨酸酶 ·972·第 2 期 　　　　　　　　　　　　　　　　陈清西等 :酪氨酸酶抑制剂的研究进展 也有很强的抑制作用[50 ] , Sugumaran1 和 Nellaiappan 也从 M. sex ta 幼虫的表皮中提取到分子量约为 380 ku 物质 ,是一种热敏感蛋白质 ,也具有酪氨酸酶抑制 作用的活性[51 ] . Goetghebeur & Kermasha[52 ] 从 A . ni ger 中提取到一种金属硫蛋白 ,也具有抑制酪氨酸 酶的活性 ,该蛋白可选择性地与重金属如 Zn2 + ,Cu2 + , Cd2 + 或 Hg2 + 等结合. 在人的皮肤中也存在酪氨酸酶 抑制剂 ,分子量为 66 ku[53 ] . Tsukamoto 等从家蝇的蛹 中提取到三个低分子量的蛋白均为酪氨酸酶的抑制 剂[54 ] . 研究结果表明 ,这类抑制剂主要是通过与酪氨 酸酶结合形成稳定的复合物而抑制酪氨酸酶的催化活 性. 随着结构生物学的发展 ,对海洋生物活性物质的 分离、鉴定 ,不断出现新型的酪氨酸酶抑制剂 ,例如 Tekraketones、cycloartanle 型三萜化合物、含有哌啶 环的化合物等等[ 55 ] ,它们都具有很强的酪氨酸酶抑制 作用. 通过对这些物质的构效关系研究 ,提供了具有新 型母核结构的酪氨酸酶抑制剂 ,为进一步提高化合物 的抑制活性提供了有用的信息. 10 　酪氨酸酶抑制剂的应用 酪氨酸酶抑制剂在医学上具有重要的应用价值 , 这是因为酪氨酸酶作为黑色素合成的关键酶 ,其异常 过量表达可导致人体的色素沉着性疾病. 当前化妆品 市场上的美白产品大多数以酪氨酸酶抑制剂为主 ,并 且每年以较快的速度发现新的该类化合物. 目前市场 上主要的美白剂有曲酸及其衍生物、Vc 及其衍生物、 绿茶提取物、甘草提取物等中药提取物 ,研究表明这些 均是酪氨酸酶的抑制剂 ,并主要是通过抑制酪氨酸酶 的活性而达到抑制黑色素合成 ,进而发挥美白的作用. 虽然随着研究的深入 ,会出现不仅仅只是通过抑制酪 氨酸酶而达到降低黑色素生成的美白剂 ,但是酪氨酸 酶抑制剂作为化妆品美白剂的地位仍会是举足轻重. 酪氨酸酶又称多酚氧化酶 ,广泛存在于果蔬中 ,是 引起水果、蔬菜发生酶促褐变的主要酶类. 它可使很多 果蔬在贮存、处理、加工过程中容易产生褐变反应 ,如 桃子、葡萄、苹果、马铃薯、鳄梨等. PPO 可以氧化果蔬 中的内源性多酚物质生成黑色素 ,影响了果蔬制品的 营养、风味及外观品质和商品价值 ,使产品难以进入市 场. 目前采用酪氨酸酶抑制剂如半胱氨酸、Vc、柠檬酸 等处理果蔬 ,是水果保鲜手段之一. 多酚氧化酶在昆虫体内也普遍存在. 1978 年 Rockstein 指出多酚氧化酶在昆虫脱皮时的鞣化过程 中起重要作用. 早在 1993 年 ,张宗炳指出 ,探索新杀虫 药剂的一条最有希望的途径是生物合理途径 ,主要有 8 个方面 ,其中“原酪氨酸酶抑制剂”和“鞣化过程抑制 剂”被列在第一、二位[8 ] ,酪氨酸酶抑制剂有希望发展 成为新型的生物杀虫剂. 参考文献 : [1 ] 　Sánchez2Ferrer # , Rodríguez2López J N , García2Cánovas F ,et al. Tyrosinase :a comprehensive review of it s mecha2 nism[J ] . Biochimics et Biophysica Acta ,1995 ,1247 : 1 - 11. [2 ] 　陈清西 ,宋康康. 酪氨酸酶的研究进展 [J ] . 厦门大学学 报 :自然科学版 ,2006 ,45 (5) :731 - 737. [3 ] 　李韶勇 ,孙命 ,曲娜 ,等. 黑色素的合成及其常见抑制剂的 作用机理 [J ] . 天津师范大学学报 :自然科学版 ,2002 ,22 (1) :17 - 22. [4 ] 　宋康康 ,邱凌 ,黄璜 ,等. 熊果甙作为化妆品添加剂对酪氨 酸酶抑制作用 [J ] . 厦门大学学报 :自然科学版 ,2003 ,42 (6) :791 - 794. [5 ] 　王白强 ,曾晓军. 酪氨酸酶活性的抑制研究及皮肤美白化 妆品的研制[J ] .福建轻纺 ,2005 (7) :1 - 6. [6 ] 　韩强 ,林惠芬 ,朱玲莉. 几种中药提取物对酪氨酸酶活性 的抑制[J ] . 香料香精化妆品 ,1998 ,12 (4) :22 - 24. [7 ] 　McEvily A J , Iyengar R ,Otwell W S. Sulfite alternative prevent s shrimp melanosis [J ] . 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