关于克隆的论文：诺氟沙星单克隆抗体的制备及其特性鉴定

诺氟沙星 (Norfloxacin，NFLX)是第 3 代氟喹诺 酮类药物(Fluoroquinolones，FQNS)重要的一种，具 有广谱抗菌作用，主要用于治疗畜禽细菌性疾病和 支原体感染，尤其对需氧革兰阴性杆菌的抗菌活性 高，而且在体外对多重耐药菌亦具抗菌活性，因此 被广泛大量地添加到饲料中，应用于畜禽疾病的治 疗和预防。然而， NFLX 进入畜禽机体后，在动物 体内消除缓慢，半衰期长，形成严重的残留，造成 对动物源性食品安全和人类食源性疾病的发生 [1-2]， 鉴于 FQNS的毒副作用，世界各国都对其使用范围和 使用对象做出了限定，我国规定其最大残留限量为 50μg/L[3]。目前检测 NFLX 残留的方法多是高效液相 诺氟沙星单克隆抗体的制备及其特性鉴定 刘庆堂，职爱民，李青梅 ，柴军，赵 东，张 磊，邓瑞广，张改平 * (河南省农业科学院 农业部动物免疫学重点开放实验室，河南 郑州 450002) 摘 要：为制备诺氟沙星单克隆抗体(MAb)，用碳二亚胺法将诺氟沙星(Norfloxacin，NFLX)分别偶联于载体 蛋白牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)，合成免疫原 BSA-NFLX和包被原 OVA-NFLX，并用紫外(UV)扫描、 SDS-PAGE电泳和免疫小鼠进行鉴定；用 BSA-NFLX免疫 BALB/C 小鼠，间接 ELISA和阻断 ELISA选择细胞融 合备用鼠；应用杂交瘤技术建立分泌 NFLX MAb的细胞株，用体内诱生腹水法制备 NFLX MAb；对 NFLX MAb 的效价、敏感性和特异性等特性进行测定。结果明：NFLX人工抗原制备成功，融合筛选后获得 3C6、3G11两 株特异敏感的杂交瘤细胞，两株细胞培养上清液效价为 1∶512，腹水效价为 1∶6.4×105，3C6株对 NFLX的 IC50为 2.52 μg/L，与二氟沙星、沙拉沙星有小于 0.03 %的交叉反应性，与其他抑制物无交叉反应性。本实验获得了高效 价、敏感、特异的抗 NFLX MAb，为 NFLX残留快速检测方法的建立奠定了基础。 关键词：诺氟沙星；单克隆抗体；免疫学特性 中图分类号：S851.4 文献标识码：A 文章编号：1008-0589(2010)09-0716-05 Development of monoclonal antibody agains t Norfloxacin LIU Qing-tang, ZHI Ai-min, LI Qing-mei, CHAI Shu-jun, ZHAO Dong, ZHANG Lei, DENG Rui-guang, ZHANG Gai-ping* (Key Laboratory for Animal Immunology of the Ministry of Agricultural, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China) Abs tract: Monoclonal antibody (MAb) directed against Norfloxacin was developed by fusion of myeloma cells with spleen cells obtained from mice immunized with BSA coupled norfloxacin antigen (BSA-NFLX). Two hybridoma cell lines, 3C6 and 3G11 that secret MAb specific for NFLX were established. The titer of the MAb determined by indirect ELISA were 1 ∶512 in supernatant and 1 ∶6.4×105 in ascites, repectively. The MAb secreted by 3C6 showed an IC50 of 2.52 μg/L and had less than 0.03% cross-reactivity with difloxain and sarafloxacin. This MAb has a high titer and is specific and highly sensitive which could be used for immunoassays to detect NFLX residues. Key words : Norfloxacin; monoclonal antibody; immunological traits 收稿日期：2009-12-15 基金项目：“十一五”国家科技支撑计划(2006BAK02A21) 作者简介：刘庆堂(1970-)，男，河南内黄人，主要从事兽药残留检测研究. * 通信作者 *Corresponding author 中 国 预 防 兽 医 学 报 Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine 第 32卷 第 9期 2010 年 9 月 Vol. 32，No.9 Sep. 2010 doi: 10.3969/j.issn.1008-0589.2010.09.14 质谱(HPLC)和液质联用(HPLC-MS)[4-10]等理化方法， 虽然可以精确测定，但存在需要昂贵仪器，样品前 处理复杂、繁琐费时、不能现场操作等缺陷，限制 了其应用。免疫学方法具有灵敏、快速、特 异、简便等优点，近年来在兽药、农药残留检测领 域已被广泛应用 [11-14]。本研究应用 NFLX 人工抗原 免疫 BALB/c 小鼠，建立分泌抗 NFLX MAb 的杂交 瘤细胞株，为免疫学检测方法的建立和拥有自主知 识产权检测产品的开发奠定基础。 1 材料和方法 1.1 试剂与溶液 盐酸诺氟沙星为中国兽医药品监 察所产品；BSA 和 OVA 为 Pierce 产品；完全佐剂 (Freund's complete adjuvant, FCA)、 不 完 全 佐 剂 (Freund's incomplete adjuvant, FIA)、 细 胞 培 养 基 RPMI-1640、选择培养基 HAT、HT 和 PEG-1500 为 GIBCO产品；新生牛血清为杭州四季青生物材 料有限公司产品；3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB) 为 Sigma 产品；羊抗鼠酶标二抗(GaMIgG-HRP)为华 美生物工程有限公司产品；其它试剂均为 AR 级。 NFLX 标准液，0.01 mol/L pH7.4 的磷酸盐缓冲液 (PBS)为稀释液，根据需要配制；洗液(PBST)为 PBS 含 0.05 % Tween-20；包被液(CBS)为 0.1 mol/L pH9.6 的碳酸盐缓冲液；间接 ELISA和阻断 ELISA的封闭 液、稀释液为含 5 %猪血清的 PBST；显色液为 TMB 的醋酸 - 柠檬酸缓冲液；终止液为 2 mol/L 的 硫酸溶液。 1.2 实验动物和细胞 6 周龄 SPF 级 BALB/c 小鼠 购自郑州大学医学院实验动物中心；小鼠骨髓瘤细 胞株 NS0由英国国家动物健康研究院惠赠。 1.3 人工抗原的合成与鉴定 1.3.1 人工抗原的合成 采用碳二亚胺法合成 BSA-NFLX 完 全 抗 原 。 同 法 制 得 包 被 抗 原 OVA-NFLX。 1.3.2 人工抗原的鉴定 1.3.2.1 UV 鉴定 用 PBS 配制 NFLX 和 BSA 标准 溶液，取一定量的 BSA-NFLX 溶于 PBS，测定其蛋 白质的浓度，据此浓度调节 BSA-NFLX 溶液中 BSA 的浓度与 BSA 标准溶液一致，在波长 200 nm～ 400 nm范围内进行紫外扫描，根据扫描结果判定偶 联效果。 1.3.2.2 SDS-PAGE鉴定 参照文献报道[15]方法进 行试验，浓缩胶为 5 % (W/V)，分离胶为 10 % (W/V)，浓缩电压为 70 V，分离电压为 85 V，上样 量为 20 μL，考马斯亮蓝染色 5 h～6 h 后，置脱色 液中脱色过夜。 1.4 小鼠多抗血清(pAb)效价测定 1.4.1 小鼠免疫 用 0.22 μm 滤膜无菌过滤的 BSA-NFLX 免疫 6 周龄雌性 BALB/c 小鼠 3 只，免 疫剂量为 50 μg 200 μL/ 只，背部皮下分 4～6 点注 射。首免用无菌 PBS 溶解 BSA-NFLX 与等量 FCA 混合，充分乳化；加强免疫将 PBS 溶解的 BSA- NFLX与等量 FIA混合，首免后 2周进行，共免疫 4 次，每次间隔 2周，最后 1次免疫后 12 d 断尾采血 分离血清。用间接 ELISA 检测抗 NFLX 抗体效价， 若效价 >1.6×10-3即可用于细胞融合；超强免疫用 无菌 PBS 溶解 BSA-NFLX，最后 1 次加强免疫后 4 周，细胞融合前 4 d，腹腔注射 BSA-NFLX 50 μg 200 μL/只。 1.4.2 小鼠抗血清效价和敏感性测定 1.4.2.1 间接 ELISA 测定 pAb 的效价 基本程序参 照 Tijssen[16]的方法，具体如下：OVA-NFLX 1 μg/mL 包被酶标板并封闭，加入待检血清，室温孵育 20 min，PBST洗涤 3次；每个样品孔中加入 1∶1 000 稀释的 GaMIgG-HRP 50 μL，室温孵育 20 min，PB- ST洗板 6次；每孔加入底物缓冲液 A、底物缓冲液 B 混合液 50 μL，室温显色反应 10 min，加入终止 液 50 μL终止反应；用酶标仪读取各孔 OD450nm值。 1.4.2.2 阻断 ELISA 测定抗体敏感性 OVA-NFLX 1 μg/mL 包被酶标板并封闭，加入不同浓度的 NFLX 等标准液和工作浓度的待检抗血清，设阴性 和空白对照，室温孵育 20 min，PBST 洗板 3 次， 加入 GaMIgG-HRP，室温孵育 20 min，PBST 洗板 6 次，显色 10 min，终止并读取 OD450nm值，计算 IC50值。 1.5 杂交瘤细胞株的建立 1.5.1 融合备用鼠选择 用阻断 ELISA筛选抑制价 最低的小鼠作为融合备用小鼠。 1.5.2 细胞融合 用 1640 完全培养液培养 NS0 骨 髓瘤细胞，于融合前 2 d 传代培养；融合前 1 d 取 昆明鼠一只，腹腔注入冷的 HAT培养基 6 mL～8 mL， 轻轻揉动后抽出腹腔巨噬细胞并以 50 μL/孔铺于 96 细胞培养板中，作为饲养细胞，小鼠超强免疫后 4 d， 摘除眼球，眶下窦采血，分离阳性血清；脱颈致死 刘庆堂，等. 诺氟沙星单克隆抗体的制备及其特性鉴定第 9期 717 图 3 免疫小鼠血清多抗血清效价 Fig.3 Titer curve of BALB/C immunized mice antisera 图 1 BSA、NFLX和 BSA-NFLX的紫外扫描光谱 Fig.1 UV scanning spectrum of BSA, NFLX and BSA-NFLX 小鼠，无菌取脾脏制备脾细胞，在 50 % PEG-1500 作用下与 NS0细胞融合；将融合后的细胞悬液加到 已铺有饲养细胞层的 96 孔细胞培养板中，用 HAT 培养基置于 37 ℃ 5 % CO2培养箱培养。 1.5.3 融合细胞的培养及阳性杂交瘤的筛选与克隆 融合细胞于第 10 d 用 HT 培养液半量换液；用间接 ELISA 和阻断 ELISA 进行阳性孔筛选，选择强阳 性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克 隆化，而后扩大培养、冻存、鉴定和建株。 1.5.4 MAb 制备 参照文献[17]用体内诱生腹水法 制备 MAb。 1.6 MAb 免疫学特性鉴定 1.6.1 效价测定 间接 ELISA测定其效价。 1.6.2 敏感性鉴定 用阻断 ELISA 测定 3C6 MAb 对不同浓度 NFLX 的抑制率，以吸光率 B/B0 (B 为 NFLX 不同浓度的 OD450nm值，B0 为 NFLX 0 标准浓 度的 OD450nm值 )为纵坐标，以不同浓度 NFLX 的对 数值为横坐标，绘制标准抑制曲线，进行相关回归 分析，计算 3C6 MAb对 NFLX的 IC50。 1.6.3 特异性鉴定 NFLX 及其同系喹诺酮类药物 作为抑制剂，用阻断 ELISA 测定各抑制物的 IC50， 以 MAb对 NFLX的 IC50与各抑制物的 IC50之比的百 分数为其交叉反应率(CR %)[18]。 2 结 果 2.1 人工抗原鉴定结果 BSA的吸收峰在 278 nm， NFLX的最大吸收峰在 272 nm，325 nm 处也有一吸 收峰。 BSA 与 NFLX 偶联后，280 nm 处两者的峰 叠加，325 nm处也有 NFLX 特征峰出现，表明偶联 成功；依据朗伯 - 比尔定律，推算 BSA 与 NFLX 的 分子结合比约为 1 ∶16.8 (图 1)。SDS-PAGE 鉴定显 示，BSA 的泳动速度大于 BSA-NFLX，表明 BSA- NFLX的分子量大于 BSA，证明偶联成功(图 2)。 2.2 小鼠血清效价敏感性测定结果 免疫的 3只小 鼠血清抗体效价均达到 10-4，获得较好的免疫效果 (图 3)，其中 1 号鼠血清效价较高，并且 IC50 最低 (图 4)，用于细胞融合。 2.3 杂交瘤细胞株的建立 细胞融合后 10 d 观察 融合效果，4 块细胞培养板 384 孔中有杂交瘤克隆 形成的 326 孔，融合率为 85 %；间接 ELISA 检测， 强阳性 23 孔，强阳性率为 7.1 %；3 次亚克隆后获 得 4 株杂交瘤，分别测定其 IC50，筛选出 2 株杂交 瘤，分别命名为 3C6、3G11，经多次传代、冻存及 复苏，杂交瘤细胞分泌抗体稳定。 2.4 MAb 免疫学特性鉴定结果 2.4.1 效价测定结果 杂交瘤分泌的抗 NFLX MAb 具有较高的效价，两株杂交瘤 3C6 和 3G11 株效价 相似，细胞培养上清和腹水效价分别达到 1 ∶5.12× 102和 1∶6.4×105 (表 1)。 2.4.2 敏感性鉴定结果 3C6 MAb标准抑制曲线的 1: Marker; 2: BSA-NFLX; 3: BSA 图 2 BSA-NFLX偶联的 SDS-PAGE 鉴定 Fig.2 Identification of BSA-NFLX conjugation by SDS-PAGE Diluted concentration of NFLX antisera (103) O D 45 0n m 中 国 预 防 兽 医 学 报 2010年718 12.18 11.00 10.00 9.00 8.00 7.00 6.00 5.00 4.00 3.00 2.00 1.00 -1.22 240 260 280 300 320 340 360 380 400220 BSA NFLX BSA-NFLX mice 1 mice 2 0 mice 3 5 10 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 [1] [2] [3] [4] 线性回归方程为 y＝-37.043x+85.918，根据回归方 程计算出 3C6 MAb 对 NFLX 的 IC50 为 2.52 μg/L， 本实验所获得的 MAb 对 NFLX 具有较高的敏感性 (图 5)。 2.4.3 交叉反应试验 NFLX 的 IC50 为 2.52 μg/L， NFLX MAb 对二氟沙星有 0.028 %的交叉反应性， 对沙拉沙星有小于 0.016 %的交叉反应性，对其它 抑制物无交叉反应(表 2)。 3 讨 论 为获得稳定分泌抗目标抗原抗体的杂交瘤细胞 株，免疫抗原须具备较高的纯度和合适的偶联比 率，针对不同免疫对象应用不同的载体蛋白、剂 量、佐剂和免疫周期，激发受免动物对该抗原的适 度免疫应答，以利于获得高特异性、高亲和力的抗 体。本实验使用高纯度的完全抗原免疫，适量的免 疫剂量和周期，获得了较为理想的免疫效果，免疫 小鼠多抗血清的半数抑制已经满足了国家标准的检 测需求。高特异性、高亲和力 MAb 的获得，除了 良好的免疫效果外，还需要有效的筛选系统。本实 验免疫多抗血清使用阻断 ELISA，用来甄别遴选具 备高效价高亲和力的小鼠，使用亲和力最高的小鼠 进行 MAb 制备，并以此获得了理想的杂交瘤细胞 株。MAb的特异性由同类药物对 NFLX 抗体的交叉 反应来体现，除与二氟沙星和沙拉沙星有较小的 交叉反应以外，与其抑制物的交叉反应性都低于 0.01 %，表明本实验制备的 NFLX 杂交瘤细胞株具 备较高的特异性。本研究合成 NFLX 完全抗原，获 得了满意的免疫效果，通过杂交瘤技术获得 2 株高 亲和力和高特异性的、稳定分泌抗体的杂交瘤细胞 株，为 NFLX 残留快速检测产品的研制提供了保 证。 参考文献： Hong J, Kim J M, Jung W K, et al. 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Rapid and economical 表 1 NFLX MAb 的间接 ELISA 效价 Table 1 The indirect ELISA titer of NFLX MAb 单克隆抗体 MAb 3C6 3G11 上清 Supernatant 1:5.12×102 1:5.12×102 腹水 Astices 1:6.4×105 1:6.4×105 图 5 阻断 ELISA检测 NFLX IC50 Fig.5 Inhibitive curve of NFLX MAb IC50 by blocking ELISA 表 2 NFLX MAb 与其他药物的交叉反应 Table 2 The cross-reactivity of NFLX MAb with other compounds 化合物 Compounds 诺氟沙星 Norfloxacin 二氟沙星 Difloxacin 沙拉沙星 Sarafloxacin 链霉素 Streptomycin 氨苄青霉素 Ampicillin 莱克多巴胺 Ractopamine 磺胺甲基嘧啶 Sulfamerazine 新霉素 Neomycin 半数抑制浓度(μg/L) IC50 2.52 9×103 1.6×104 >3.2×104 >3.2×104 >3.2×104 >3.2×104 >3.2×104 交叉反应性(%) Cross-reactivity 100 0.028 <0.016 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 图 4 免疫小鼠血清的抑制曲线 Fig.4 The inhibitive curve for immunized mice antisera y=-37.745x+96.493 R2=0.9465 mice 1 IC50=17.05 μg/L mice 2 mice 3 log10 [NFLX concentration (μg/L)] log10 [NFLX concentration (μg/L)] R2=0.9711 99 89 79 69 59 49 39 29 19 9 -1 IC50=2.52 μg/L 刘庆堂，等. 诺氟沙星单克隆抗体的制备及其特性鉴定第 9期 719 (B /B 0) % 1 2 30 120 100 80 60 40 20 0 y=-40.204x+66.893 0.50 1 1.5 2-0.5 (B /B 0) % high-performance liquid chromatographic method for the deter- mination of norfloxacin in serum using a microparticulate C18 guard cartridge [J]. 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