基因工程药物论文：视神经组织工程重建中基因治疗工具的作用

中国组织工程研究与临床康复 第 14 卷 第 33 期 2010–08–13 出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research August 13, 2010 Vol.14 No.33 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 cn.zglckf.com 6226 视神经组织工程重建中基因治疗工具的作用*★ 郭 兵，许家军 Gene therapy for optic nerve tissue engineering reconstruction Guo Bing, Xu Jia-jun Abstract BACKGROUND: Current treatments for optic nerve disease include cell transplantation, gene therapy, medication and operation intervention. Moreover, gene therapy has aroused increasing attention and may become an alternative to some optic nerve diseases. OBJECTIVE: To summarize gene therapy for optic nerve injury from aspects of gene vector, neurotrophic factor, and tissue engineering. METHODS: A computer-based online search of VIP, Pubmed and Elsevier databases was performed for related articles with the key words “optic nerve regeneration, gene therapy, tissue engineering” in Chinese and English. Articles related to gene therapy for optic nerve injury were included, and repetitive studies were excluded. RESULTS AND CONCLUSION: A total of 268 articles were collected, and 29 were included. Increasing gene therapies utilized non-virus and viral vector to transfect retinal ganglion cells, including many vector transfection methods, such as non-viral vector transfection, lentiviral vector transfection, adenovirus vector transfection, and adeno-associated virus vector transfection. Recombinant adenovirus vectors have been frequently used. These gene vectors can enhance retinal ganglion cells survival and promote axonal regeneration. Guo B, Xu JJ. Gene therapy for optic nerve tissue engineering reconstruction.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(33):6226-6229. [http://www.crter.cn http://en.zglckf.com] 摘要 背景：目前治疗视神经疾病的方法主要有细胞移植治疗，基因治疗，药物治疗，手术干预等。其中，基因治疗研究逐步受到 重视，并有望成为某些视神经疾病的可供选择的治疗方法之一。 目的：从各种基因载体应用、神经营养因子、组织工程修复以及临床应用等方面，全面了解视神经损伤后基因治疗修复的方 法。 方法：以“视神经修复(optic nerve regeneration)，基因治疗(gene therapy)，组织工程(tissue-engineering)”为检索词，应 用计算机检索维普数据库，Pubmed 数据库，Elsevier 数据库相关文章。纳入与视神经损伤后基因治疗修复密切相关的文献， 排除重复性研究。 结果与结论：共检索到 268 篇文献，排除无关重复的文献，保留 29 篇文献进行综述。目前视神经损伤后，越来越多的研究 采用非病毒及病毒载体从基因角度感染视网膜节细胞，其中病毒载体包括慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体，当前 大部分研究是采用重组的腺相关病毒载体。通过这些基因载体工具的应用，能增强视网膜节细胞的存活，促进受损视神经轴 突的再生。 关键词：病毒载体；非病毒载体；基因治疗；视神经；修复；组织工程 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.33.036 郭兵，许家军．视神经组织工程重建中基因治疗工具的作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(33):6226-6229. [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com] 0 引言 视神经属于中枢神经系统，由视网膜节细 胞发出的轴突组成。临床上视神经疾病有青光 眼视神经疾病，视神经炎，视神经退化等，治 疗此类疾病需要寻找方法来促进视网膜节细胞 的存活及轴突再生。目前治疗视神经疾病的方 法主要有细胞移植治疗，基因治疗，药物治疗， 手术干预等。 对于受损的视网膜节细胞，单次注射重组 的神经营养因子只能提供暂时的保护作用[1]， 而且在玻璃体内移植可分泌神经营养因子的细 胞可能对视觉通路功能恢复有负面作用，为了 使视网膜节细胞能获得持久的神经营养作用， 目前常采用载体转染的方法。基于此，文章主 要针对促进视网膜节细胞的存活及轴突再生的 基因治疗，从不同基因载体的角度展开综述。 1 资料和方法 1.1 资料检索 检索人相关：第一作者。 检索时间范围：1994/2009。 检索词：中文检索词：视神经修复，基因 治疗，组织工程。英文检索词：optic nerve Teaching and Research Section of Human Anatomy, Second Military Medical University of Chinese PLA, Shanghai 200433, China Guo Bing★, Studying for master’s degree, Teaching and Research Section of Human Anatomy, Second Military Medical University of Chinese PLA, Shanghai 200433, China Correspondence to: Xu Jia-jun, Professor, Teaching and Research Section of Human Anatomy, Second Military Medical University of Chinese PLA, Shanghai 200433, China taohair@163.com Supported by: the Major State Basic Research Development Program of China, No. 2005CB724302* Received: 2010-02-04 Accepted: 2010-03-10 解放军第二军医 大学人体解剖学 教研室，上海市， 200433 郭 兵★，男， 1981 年生，上海 市宝山区人，解放 军第二军医大学 在读硕士，主要从 事视神经损伤修 复方面的研究。 通讯作者：许家 军，教授，解放军 第二军医大学人 体解剖学教研室， 上海市 200433 taohair@163. com 中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号: 1673-8225 (2010)33-06226-04 收稿日期：2010-02-04 修回日期：2010-03-10 (20100107003 / WLM·A) 郭兵，等．视神经组织工程重建中基因治疗工具的作用 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 6227 www.CRTER.org regeneration，gene therapy，tissue-engineering。 检索数据库：维普数据库，网址 http://www.cqvip.com; Pubmed 数据库，网址 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/; Elsevier 数 据 库 ， 网 址 http://www. sciencedirect.com/。 检索文献量：共检索到 268 篇相关文献。 1.2 入选标准 纳入标准：与视神经损伤后基因治疗修复方法密切相 关的文献。 排除标准：重复性研究。 1.3 质量评估 计算机检索得到 268 篇文献，中文 56 篇，英文 212 篇，阅读标题与摘要进行筛选，排除与此 文无关的文献。对于同一领域选择近期发或在权威杂 志上发表的文章。 2 结果 2.1 纳入文献基本情况 共纳入 29 篇文献，其中 1 篇涉 及各种修复方法[1]，6 篇涉及非病毒载体转染[2-7]，5 篇 涉及慢病毒载体[8-12]，4 篇涉及腺病毒载体[13-16]，11 篇 涉及腺相关病毒[17-27]， 2 篇涉及存在问题[28-29]。 2.2 文献证据综合提炼 目前，基因载体包括非病毒载 体、慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体等，当 前大部分研究是采用重组的腺相关病毒载体。 2.2.1 非病毒载体转染 非病毒载体工具常见是采用 质粒 DNA 工具，Thaler 等[2]应用质粒 DNA 编码碱性成 纤维细胞生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养素 3 移植于视神经损伤断端，然后逆向运输入视网膜神经节 细胞，可以增加视网膜神经节细胞存活至少 3 个月。而 将编码基因的质粒 DNA 注射入玻璃体内，对视网膜神经 节细胞的转染效果较差[3]，最近发现主要是由于玻璃体阻 止了多聚体(如质粒 DNA)的扩散[4]。目前对于质粒转染， 研究热门的是采用电穿孔法，即采用高压电场使细胞膜 短暂开放让其他分子进入细胞内，Ishikawa 等[5]在玻璃 体内注射质粒-绿色荧光蛋白，并采用电穿孔法发现大 约有 24.4%的视网膜神经节细胞被转染，后又在玻璃体 内注射质粒-胶质细胞源性神经营养因子，可观察到视 网膜神经节细胞存活 2~4 周。方媛等[6]应用带有睫状神 经营养因子-绿色荧光蛋白的质粒通过电穿孔法转染许 旺细胞，3 h 后就可看到许旺细胞有绿色荧光蛋白阳性 表达，12 h 后可见许旺细胞有较多的绿色荧光蛋白阳性 表达，24~72 h 绿色荧光蛋白阳性的许旺细胞数量达到 高峰，7 d 后仍可看到绿色荧光蛋白阳性的许旺细胞。 除了质粒工具外还有其他的非病毒载体工具，如应用反 式激活因子(其中含有蛋白转染区)[7]，它可连接其他分 子并携带其穿过脂质细胞膜，但这种方式特异性较差。 总体来讲，虽然许多人认为非病毒载体转染较病毒载体 安全，但是非病毒载体有其转染效率低，表达短暂的局 限性，另外高浓度的质粒 DNA 对细胞也有毒性。 2.2.2 慢病毒载体转染 慢病毒是以人类免疫缺陷病 毒 1 为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和 非分裂细胞均具有感染能力。在慢病毒载体应用于视神 经损伤方面目前已取得一些成果。Cheng 等[8]发现在兔 的玻璃体内注射慢病毒转染视网膜神经节细胞的毒性 较小。后来 van Adel 等[9]应用慢病毒-睫状神经营养因 子注射到大鼠玻璃体内可促进视网膜神经节细胞存活 3 周以上，另外可用慢病毒-神经营养因子转染 muller 细 胞，也可间接的对视网膜神经节细胞的存活有营养支持 作用[10]。但是相对于其他病毒载体，玻璃体内注射慢病 毒对视网膜神经节细胞的转染效率较低[11]。有研究表 明，用携带绿色荧光蛋白的慢病毒载体注射入玻璃体 内，发现被转染的细胞大部分限制在色素上皮内，部分 在巩膜、结膜、脉络膜上。另外对视神经损伤的治疗， 近年来有应用慢病毒编码不同类型的神经营养因子并 在体外转染许旺细胞，发现慢病毒载体能有效感染较大 比例的许旺细胞。Hu 等[12]应用慢病毒-睫状神经营养因 子感染许旺细胞，再种入脱细胞周围神经支架，将此构 建好的组织工程神经移植入受损视神经的断端，结果表 明可促进视网膜神经节细胞的存活及轴突再生。后来 Hu 等又进一步研究应用慢病毒-脑源性神经营养因子 或慢病毒-胶质细胞源性神经营养因子感染许旺细胞， 再种入脱细胞支架，对视网膜神经节细胞轴突再生的促 进作用较差。 2.2.3 腺病毒载体转染 腺病毒易于转染许多细胞类 型，在视神经损伤治疗方面，有研究采用腺病毒编码睫 状神经营养因子、脑源性神经营养因子、胶质细胞源性 神经营养因子，并在巨细胞病毒启动子的协助下注射入 玻璃体内，对损伤的视网膜神经节细胞有保护作用[13]。 Weise 等[14]应用腺病毒-睫状神经营养因子在玻璃体内 单次注射，可见睫状神经营养因子基因稳定表达达 18 d 以上，14 d 以后检测表明治疗组相对于单纯损伤组，视 网膜神经节细胞存活提高了 155%。而用腺病毒编码脑 源性神经营养因子，注射入玻璃体内对视网膜神经节细 胞的保护作用较为短暂。Kügler 等[15]应用腺病毒编码抗 凋亡蛋白 P35，注射入视神经损伤处，可减少 14 d 内 的视网膜神经节细胞死亡，但 14 d 后 P35 mRNA 未被 检测到，表明腺病毒-P35可能只起到短期作用。后Kretz 等[16]应用腺病毒编码的Bcl-xl注射在视神经损伤处也可 短期减少视网膜神经节细胞的死亡，但腺病毒编码 Bcl-xl 不但未引导长距离的轴突再生，而且由于其在视 网膜内可能引发神经胶质增生反应从而阻止轴突再生。 另外腺病毒直接注射入眼部会导致细胞介导的免疫反 应和局部严重的炎症反应，从而会致病毒载体被清除使 基因表达的持续性较差。目前研究应用改良过的腺病毒 郭兵，等．视神经组织工程重建中基因治疗工具的作用 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 cn.zglckf.com 6228 www.CRTER.org 载体能尽量减轻这些免疫反应及炎症反应，为基因的持 续表达起到一个合适的媒介作用。 2.2.4 腺相关病毒载体转染 腺相关病毒是一种无胞 膜的单链 DNA 病毒，通常被认为是无致病性的，而腺 相关病毒首先要转变为激活的双链形式对被感染细胞 的基因表达的效果才好[17]，所以被感染细胞的基因表达 有延迟现象[18]。腺相关病毒有许多不同类型的血清型， 对于基因载体主要是要挑选出特异性和转染性较强的 血清型载体，从而能更有效、特异地转染细胞，目前常 用的是腺相关病毒 2 载体，其中腺相关病毒 2/2 和腺相 关病毒 2/6 显示了较高的转染效率，其次是腺相关病毒 2/3，2/5，2/8。另外需要说明的是腺相关病毒 2/6 转染 的特异性最高[19]。 对于腺相关病毒治疗视神经损伤的注射部位，主要 有视网膜下间隙注射、玻璃体内注射等，相对于视网膜 下间隙注射，玻璃体内注射的侵入性较小，且可以重复 注射，有时可合并药物治疗。用腺相关病毒 2 转染基因 注射入玻璃体内，合并应用巨细胞病毒或/和鸡 β-actin 启动子可促进其基因表达[20]。另外还有应用 bi-cistronic 载体[21]，目的基因可通过其内部的核糖体结合位点连接 上报告基因绿色荧光蛋白，然后用免疫细胞化学方法在 被转染的细胞上借助绿色荧光蛋白显色，来证明视网膜 神经节细胞被转染。在成体大鼠的玻璃体内注射腺相关 病毒，研究证实 60%~70%被转染的细胞在视网膜节细 胞层，而其中 10%~15%是由无长突细胞移位过来的[22]。 在取得的成果方面，Leaver 等[23]用腺相关病毒 2 编码睫状神经营养因子,转染到视网膜神经节细胞中促 进了视网膜神经节细胞的存活及再生，其效果在视神经 损伤 7 周后仍存在。在成年大鼠的玻璃体内注射腺相关 病毒-脑源性神经营养因子-绿色荧光蛋白也能增加视 网膜神经节细胞的存活，然而轴突再生只在视神经损伤 近端，在视神经损伤的远端未见轴突再生。而当腺相关 病毒-绿色荧光蛋白或者腺相关病毒-生长相关蛋白 43 注射入玻璃体内，未见视网膜神经节细胞存活及轴突再 生现象[24]。另外 Gorbatyuk 等[25]应用腺相关病毒携带沉 默基因，可使抑制因子 Rho 下调而促进视网膜神经节细 胞存活。 目前研究应用腺相关病毒携带睫状神经营养因子, 注射入可过度表达 bcl-2 的基因大鼠玻璃体内，结果发 现 bcl-2 表达本身可促进视网膜神经节细胞存活，而腺 相关病毒介导的睫状神经营养因子能有效增加视网膜 神经节细胞的存活及轴突再生[23]。然而，虽然 Bcl-2 和 腺相关病毒-睫状神经营养因子-绿色荧光蛋白对视网 膜神经节细胞的存活有协同作用，但存在腺相关病毒- 睫状神经营养因子-绿色荧光蛋白的视网膜神经节细胞 再生轴突的能力在普通大鼠和 bcl-2 基因鼠中是相似 的，说明了复合 Bcl-2 和腺相关病毒-睫状神经营养因子 -绿色荧光蛋白应用不能协同增加存活视网膜神经节细 胞的轴突再生能力。另外因为视神经损伤后自体神经移 植可作为桥梁作用增加视网膜神经节细胞轴突再生，以 重建视网膜与中枢的联系，所以有研究采用带血管周围 神经移植物和腺相关病毒基因联合治疗的方法，以观察 视网膜神经节细胞存活和轴突再生情况。Leaver 等[21] 证明大鼠玻璃体内注射腺相关病毒-睫状神经营养因子- 绿色荧光蛋白和带血管周围神经移植物联合应用可使 大约 25%的视网膜神经节细胞存活 7 周，其中有一半的 细胞再生轴突至带血管周围神经移植物内。另外因为对 氯苯硫基-cAMP 可增加眼内 cAMP 水平，从而提高玻 璃体内注射的腺相关病毒-睫状神经营养因子对视网膜 神经节细胞的转染效率，Park 等 [26]采用对氯苯硫基 -cAMP 和腺相关病毒-睫状神经营养因子联合，增 加了视网膜神经节细胞的存活及轴突再生。腺相关病毒 使用也有限制，它转染的外源基因相对较小，常规的包 装限制在 5.1~5.3 kb[27]。 3 讨论 近年来视神经损伤的治疗已取得很多成果，转染载 体主要采用病毒载体，但不可避免的存在免疫反应、炎 症反应、致病性等风险，目前要寻找一些转染效率高的 载体，并能尽量减少这些风险。另外目前有研究可 调控的基因载体，从而可按需要调控其转载基因表达的 开放或关闭[28-29]。 4 参考文献 [1] Isenmann S, Schmeer C, Kretz A. 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