DGGE技术在动物胃肠道微生态研究中的应用

DGGE技术在动物胃肠道微生态研究中的应用 1 DGGE技术的基本原理 变性梯度凝胶电泳(DGGE)是一种电泳系统，利用序列不同的DNA片段在聚丙烯酰胺凝胶中解链温度不同的原理(Muyzer和Smalla，1998)，通过梯度变性胶将DNA片段分开。当双链DNA分子在变性凝胶中进行电泳时，其解链的速度和程度与其序列组成密切相关，相同长度的双链DNA分子由于碱基对组成的不同，解链所需要的变性剂浓度也不同，当某一双链DNA序列迁移到变性凝胶的一定位置，并达到其解链温度时，即开始部分解链，部分解链的DNA片段在胶中的迁移速度急剧降低。因此具有不同序列的DNA片段则停留于凝胶的不同位置，形成相互分开的条带图谱。理论上只要选择的电泳条件足够精细，最低可检测到只有一个碱基差异的DNA片段。 当用DGGE技术研究微生物群落结构时，要结合PCR扩增技术，用PCR扩增的16S rRNA产物来反映微生物群落结构组成。通常，根据16S rRNA基因中比较保守的碱基序列设计通用引物，通常选择可变区(如V3或V6～V8区)，其中一个引物的5’端含有一段GC夹子，用来扩增微生物群落基因组总DNA，扩增产物用于DGGE分析。GC夹子通常为30～50碱基，富含GC核苷酸序列，其作用是调节目的序列的解链行为，防止DNA片段完全解链，从而使有一个碱基差别的DNA片段都可被分开。根据DGGE变性梯度的方向与电泳方向是否一致，可将DGGE分为垂直DGGE和平行DGGE。垂直DGGE的变性梯度方向与电泳方向垂直，可用于优化样品的分离条件，也可用于分析PCR产物的组成；平行DGGE的变性梯度方向与电泳方向一致，可用于同时分析多个样品，是平时最常用的DGGE形式。 2 DGGE技术的工作 DGGE技术分析微生物群落的主要工作流程见图1，通常包括4个主要步骤：一是样品核酸(总DNA或RNA)的提取；二是16S rRNA片段的PCR扩增；三是PCR产物的DGGE分析；最后是DGGE图谱的分析。电泳条带的数目、位置和强度可反映样品中微生物的种类及细菌的相对构成比例，反映样本的微生物结构及组成。DGGE图谱的分析指标通常包括条带数目、多样性指数和相似性指数。对DGGE图谱上的特殊条带测序、16S rRNA序列分析和序列对比是DGGE方法的必要补充。另外，荧光原位杂交(FISH)和实时荧光定量PCR是其他研究微生态学的黄金方法，与DGGE结合使用，能更好地分析微生物区系组成。 3 DGGE技术在动物胃肠道微生态研究中的应用 3.1 研究胃肠道微生物区系的多样性 DGGE通常用于确定微生态总的细菌群落或独特种群的遗传多样。Simpson等(1999)分析了DGGE技术在研究猪肠道微生物区系上的应用条件，并研究猪的年龄、饲粮发生改变时不同个体肠道和粪样细菌群体组成结构变化。结果明，猪断奶前、断奶后及育肥期肠道内的微生态系统中既有相同菌种，也有不同菌种，断奶使肠道微生态发生较大变化。该研究也证明了DGGE技术在研究仔猪粪样微生物区系变化规律上是一种非常有效的技术。 3.1.1 用于研究日粮改变后动物胃肠道微生物区系的组成 Kocherginskaya等(2001)研究去势公牛在干草和玉米两种日粮条件下瘤胃细菌群体结构的情况，结果表明，玉米日粮的动物瘤胃中细菌群体相对更多样，数量更大。Konstantinov等(2003)运用DGGE技术研究了可发酵碳水化合物(甜菜渣和果寡糖)对仔猪粪样菌群组成的影响，发现饲喂可发酵碳水化合物的仔猪粪样菌群多样性增加，细菌区系较快趋于稳定，DGGE图谱出现了Ruminococcus类似菌。DGGE图谱上13条优势条带与Clostridium coccoides和Clostridium leptum的相似度达到91%～97%，说明这些细菌可能在仔猪利用日粮纤维上起作用。姚文等(2004)研究了大豆黄酮对本地山羊瘤胃微生物区系结构的影响，DGGE图谱显示日粮改变后原有的优势条带变弱或消失，而出现了新的优势条带，说明大豆黄酮可选择性地促进瘤胃中某些细菌的生长。Wang等(2007)运用DGGE技术研究了给猪饲喂全株水稻后结肠物和粪样中菌群的组成，发现饲喂全株水稻日粮的猪粪样样品的DGGE图谱条带数和Shannon多样性指数显著增加，相反，结肠内容物样品的条带数和多样性指数随着日粮中全株水稻的比例的增加而下降。Mao等(2007)用DGGE结合16S rRNA序列分析研究了日粮中添加富马酸二钠对山羊瘤胃微生物区系的影响，结果表明，日粮中添加富马酸二钠后瘤胃菌群多样性显著增加，溶糊精琥珀酸弧菌(Succinivibrio dextrinosolvens)在大部分富马酸二钠添加组的DGGE图谱上均有出现。 3.1.2 用于研究体外发酵体系中的菌群组成 Zhu等(2003)利用DGGE分析了断奶仔猪粪样体外培养甜菜渣时细菌区系的变化情况，发现体外培养后，DGGE图谱的电泳条带会出现3条优势条带，通过16S rDNA的序列分析，这3种菌中2种分别与挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)和裂果胶毛螺菌(Lachnospira ectinoschiza)具有92%和96%的同源性，另外1种与L.pectinoschiza具有95%的同源性。 3.2 研究胃肠道微生物群落的动态性变化 运用DGGE技术可同时分析多个样品，不同来源的样品可以方便地在同一块DGGE胶上进行分析。通过传统的培养法连续取样监测虽然能了解到主要的微生物变化(如大肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌等)，但是不能研究微生态的完整动态变化，而且工作量很大。DGGE则能有效地监测整个系统的微生物区系变化。 3.2.1 用于监测不同时间点的变化 Van der Wielen等(2002)对不同日龄肉鸡肠道样品的DGGE分析发现，DGGE图谱条带数随着日龄的增加而增加，说明日龄增长使肠道优势菌群区系趋于复杂。朱伟云等(2003)分析了仔猪断奶后2周内其粪样的DGGE图谱，表明各组仔猪在断奶当天的一些优势条带在断奶后第6天时消失，多数条带在第13天时消失，而新的条带在第6、7天或第13天陆续出现。从总体上看，随着断奶时间的推移，每头仔猪的DGGE图谱带逐渐增多，变得复杂和多样。姚文等(2006)用DGGE跟踪一窝5头新生腹泻仔猪自然康复、补饲、断奶过程中粪样细菌区系的演变。结果表明，DGGE图谱由简单(2日龄)到复杂(10日龄)，再回复简单(16日龄)到复杂(断奶)，最后趋于稳定。 3.2.2 用于监测不同空间上的变化 Simpson等(1999)对一头5月龄猪不同肠道内容物及黏膜样本进行DGGE分析，发现除盲肠外，同一结构部位的内容物与黏膜处的条带图谱近似，但肠道不同部位则表现出明显不同，取样部位相距越远，相似性指数越小，结果说明不同年龄猪粪便中既有共同菌群分布，也具有独特菌群，且不同部位肠道菌群分布有差异，解剖结构相距越远，菌群相似性越小。Van der Wielen等(2002)用DGGE评价了肉鸡不同肠段菌群组成变化。依据相似性指数，发现来自相同个体的不同肠段样品的DGGE图谱有显著差别，每个肠段都有自己独特的微生物区系组成。Sadet等(2007)采用DGGE研究了黏附于5月龄羔羊瘤胃上皮5个部位及瘤胃液相和固相内容物上的菌群结构，结果发现相同个体瘤胃上皮5个取样部位的细菌组成无显著变化。瘤胃上皮上黏附的菌群和瘤胃内容物的菌群组成有显著差别。 3.3 研究特定种属微生物组成 将DGGE与种属特异性引物相结合，可从种属水平上监测微生物区系组成，是研究动物肠道微生物体系中含量较少的菌群的有力手段(Satokari等，2001)。例如，乳酸杆菌占整个人粪样微生物区系不到1%(104～108CFU/g)(Sghir等，2000)。随着益生素在开发能改善动物肠道菌群组成的功能性产品上的应用日益增多，乳酸杆菌由于其对肠道的健康作用在人和动物上都深得研究。Simpson等(2000)利用Lactobacillus reuteri的特异性引物进行DGGE分析，研究断奶仔猪饲喂外源乳酸菌后粪样细菌群体的多样性和稳定性，发现与对照组相比，试验组的DGGE图谱条带亮度明显增加。苏勇和朱伟云(2006)采用巢式PCR扩增乳酸杆菌16S rRNA的特异片段，再用DGGE分析7～35日龄(断奶后两周)新生仔猪胃中乳酸杆菌的菌群变化，分析发现，7、14、21日龄和24日龄仔猪胃食糜乳酸杆菌DGGE图谱有较多相同的优势条带，而至35日龄一些优势条带消失。这说明仔猪断奶前后胃中乳酸杆菌数量变化较小。Janczyk等(2007)用DGGE技术分析了仔猪回肠食糜样品的乳酸杆菌16S rRNAV2～V3区扩增产物，发现唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)所对应的DGGE条带在断奶后1～2d出现，而卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)所对应的条带只在断奶第1天和11天出现。所有动物的DGGE图谱中最优势条带的相似菌为actobacillus sobrius。 4 DGGE技术的优缺点 DGGE技术的最大优点是无需进行微生物培养。据报道，自然环境中尚不可纯培养的微生物高达85%～99%(Amannri等，1995)。一些微生物的生长需要厌氧环境。厌氧培养对于观察菌群的多态性及动态变化非常有限。而直接从胃肠食糜样品中抽提总DNA，然后对16S rRNA的可变区进行PCR扩增，通过DGGE分析，可检测到难以或不能培养的微生物，更能反映肠道微生态群落结构的动态变化。DGGE技术可以与其他许多方法如传统培养技术、克隆测序技术、杂交技术、实时荧光定量PCR技术等结合，从而更全面认识动物胃肠道微生物区系组成和优势菌群，将更实际地揭示胃肠道微生物群落的结构和功能，更可以减少各种技术的偏差和局限性。此外，DGGE技术还具有可靠、可重复、快速和容易操作等优点。 然而同其他分子生物学方法一样，DGGE技术也存在一定的局限性。其一是只能分离较小的片段(最长只达1000bp)。这些序列只能提供有限的信息，限制了用于系统发育分析和探针的序列信息量。其二是分辨率有限。DGGE通常显示群落中优势种类的DNA片段，只有占整个群落细菌数量约1%或以上的类群能够通过DGGE检测到。含量较低的细菌种群只能通过设计属、种或株特异性引物来实现DGGE检测。其三是由于某些种类细菌16S rDNA存在多拷贝或者异源双链，从而使DGGE图谱上单一菌出现多个条带，导致自然群落中微生物数量的过多估计。 5 小结 动物肠道微生物的菌群结构和组成受到多种生理因素、饲料组成、环境因素等的影响，正常菌群能够提高生长速度，改善产品质量，并有助于减少疾病发生。传统的培养法只能对有限的几种已知微生物进行评估，无法认清样本的全貌。DGGE技术是随着现代分子生物学发展起来的一种新型且实用的动物肠道微生态学研究分析手段。虽然该技术还存在一些不足，但可在引物设计、PCR扩增目的靶标的选择及图谱分析等关键环节上进行系统改进和优化，从而不断提高分析微生物生态学的研究水平。总之，由于DGGE法无需培养计数，通过对DGGE图谱进行多样性分析，就能监测到样品中的菌种组成和优势菌种，操作简单快捷，是研究微生态系统的重要方法。在动物胃肠道这个复杂微生态系统的研究上，DGGE技术必将得到更广泛的应用。