GP73是一个新的肝癌标志物

GP73，一种resident高尔基糖蛋白，是肝细胞癌的一种新的血清标志物 Journal of Hepatology 43 (2005) 1007–1012 发现新的肝细胞癌血清标志物：GP73，一种高尔基体滞留糖蛋白 Jorge A. Marrero1,*, Patrick R. Romano2, Olga Nikolaeva2, Laura Steel2, Anand Mehta2, Claus J. Fimmel3, Mary Ann Comunale2, Anthony D’Amelio4, Anna S. Lok1, Timothy M. Block2 1Division of Gastroenterology, University of Michigan Medical Center, 3912 Taubman Center, Ann Arbor, MI 48109-0362, USA 2Department of Microbiology and Immunology, Drexel Institute for Biotechnology and Virus Research, Drexel University College of Medicine, Doylestown, PA 18901, USA 3Division of Gastroenterology and Hepatology, Saint Louis VA Medical Center, Saint Louis University School of Medicine, St Louis, MO 631110-0250, USA 4Hepatitis B Foundation/Institute for Hepatitis and Virus Research, Doylestown, PA 18901, USA 背景：肝细胞癌（HCC）患者的血清中，高尔基蛋白73（GP73）出现上调。本研究的目的，是研究能否在血清中检测出GP73，并且确定血清GP73在诊断HCC时的灵敏度与特异度。 方法：通过免疫印迹方法检测血清GP73，并通过密度分析进行定量。 结果：受试者总共为352位。HCC患者的血清GP73含量显著地高于肝硬化患者（P<0.001）。。在诊断早期HCC时（P<0.0001），与AFP的敏感度（25%）相比，GP73水平的敏感度明显更高（62%）。而且，血清AFP浓度低于20ng/ml的HCC患者中，有57%（32/56）的患者血清GP73浓度是高于临界值的。 结论：与非HCC患者相比，HCC患者的血清中GP73浓度明显更高。用于诊断早期HCC时，GP73比AFP更好。为了确认GP73在HCC的早期诊断中的作用，还需更多的研究工作进行验证。 关键词：肝细胞癌（HCC）；早期诊断；甲胎蛋白（AFP）；高尔基蛋白73（GP73）；肝硬化 1、介绍 目前，HCC是世界上第五种最常见的癌症。2001年，全世界HCC的标化发病率为21/100,000，标化死亡率为20.2/100,000[1]。我们可以看出，HCC的发病率和死亡率几乎是一样的，表明了这一肿瘤的预后是极差的。在最近2001年美国癌症状况国家年度报告中，HCC是过去十年中发病率增长最快的癌症[2]。肝硬化是发展成为HCC的最重要的因素；因此肝硬化患者就成为了高危人群。人们预测，在美国接下来20年中，丙型肝炎（HCV）相关的HCC的发病率将会持续上升[3]。考虑到美国肝硬化患者总体生存率的提高[4]，和HCC患病率的持续增加，医学界就迫切需要一种早期HCC诊断的有效方法。开发出一种敏感度和特异度更高的血清标志物，用于危险人群的HCC早期诊断，就可能会提高这一致命癌症患者的生存率。 目前，甲胎蛋白（AFP）是唯一的推荐用于肝硬化患者HCC监测的血清标志物[5]。回顾性分析认为，AFP作为早期HCC监测工具，敏感度为39-64%，特异度为76-91%，阳性预测值为9-32%[6-8]。另外，据报道，肝脏超声用于临床研究中早期HCC诊断时，具有78%的敏感度，91%的特异度，和73%的阳性预测值。然而，肝脏超声的准确性是操作者依赖性的，这就限制了它的价值，从而不能作为一种监测性检验方法。这说明，我们需要一种更好的用于HCC监测的标志物。 高尔基蛋白-73（GP73），最初被认为是一种滞留性的高尔基体II型跨膜蛋白，主要在许多人体组织的上皮细胞中表达[11]。在正常的人体肝脏中，GP73只在胆上皮细胞中表达，而肝细胞中则几乎检测不到表达。然而，临床发现，在患有病毒性或非病毒性肝病的患者的肝细胞中，GP73的表达出现显著的上调[12]。一项最近的研究发现，可在人体血清中检测到GP73，而且，与非肿瘤肝脏相比，在HCC旱獭模型中，血清和组织中的GP73浓度都上升了[13]。因此，GP73有可能作为HCC早期诊断的标志物。 未了建立一个形式化的框架用于指导癌症生物标志物的评估和开发过程，美国国家癌症研究院的早期诊断研究网络采用了一个5期[14]。1期生物标志物开发研究的目的是（a）确定能否在肝病或非肝病患者血清中检测到GP73，（b）确定HCC患者血清中GP73浓度是否比肝硬化患者的更高，（c）比较GP73和AFP的在区分HCC与非肿瘤慢性肝病时所表现的性能特征。 2、与方法 2.1.受试者 本研究获得了密歇根大学审查委员会（Institutional Review Board）的批准，并得到了每位受试者的书面知情同意书。收集每位受试者的人口统计学和临床信息，并采集血样。从2001年9月至2004年8月，从密歇根大学医学中心门诊召募到两组受试者。从综合性内科门诊招募了一组无肝病史，每周酒精摄入量低于40g，无病毒性肝炎危险因素的受试者。这一对照组中的所有受试者，均被证明肝脏生化功能正常。在这一期间，还从肝科门诊召募了另一组受试者，这些受试者一部分为HCC患者，另一部分为在年龄、性别和种族方面均与HCC患者相匹配的肝硬化患者。HCC的诊断主要通过组织病理学方法（n=107，包括所有的T期病变）；如果组织病理学方法不能进行，则通过两种影像方法（超声[US]，核磁共振成像，或CT）诊断，发现>2cm的血管性增强型肿块（n=37）。肝硬化的诊断是根据组织学方法（n=121）或是根据临床、试验室和成像证据来判断肝脏失代偿或门静脉高压症（n=31）[15]。各位肝硬化受试者US诊断均正常，如果受试者AFP过高，则在召募前三个月内和招募后6个月内各进行一次MRI检测，结果均未发现肝脏肿块。这些肝硬化对照者在招募后进行中值时间为12个月（范围为7-18个月）的跟踪观察，结果均未发展成为HCC。肿瘤分期是通过United Network of Organ Sharing-modified TNM的HCC分期系统确定的[16]。早期HCC被分为T1期（单个病变直径<2cm）和T2期（单个病变直径在2cm和5cm之间；或<3个病变，每一病变直径<3cm）病变，这与美国肝脏移植标准相符。 每一受试者抽取20ml血样，将血样旋转、等分，血清检测前一直保存于-80℃。血样都是在HCC患者接受相应治疗前抽取的。AFP检测是在密歇根大学医院临床诊断试验室进行的，使用的是商品化的、应用增强化学发光手段的免疫分析方法。正常值的上限为8ng/ml。 2.2．GP73的免疫印迹分析 GP73的检测是以编号的形式在Drexel研究院生物技术和病毒研究实验室进行。以上受试者的等量血清（o.5μl/泳道）通过4-20%的聚丙烯酰胺梯度凝胶SDS-PAGE电泳分离。为了标准化，每一块胶都留有一个泳道，用于0.5μl取自HCV和HBV阴性的公共血源的血清（Sigma，Inc，St Louis，MO）的分离。通过免疫印迹，蛋白被转移到PVDF膜上。将膜置于封闭液（1×TBS即50mM Tris-HCl，pH7.6，150mM氯化钠，5%脱脂奶粉，0.1%Tween20）中室温温育1h。将膜置于兔抗-GP73多克隆抗体溶液（1：1000封闭液）中4℃轻摇温育过夜。用封闭液室温下洗膜两次，接着将膜置于辣根过氧化物酶-鼠抗兔第二抗体溶液（1：4000 v/v）中室温温育2h，再用1×TBS-T（含0.1%Tween20的TBS）室温下洗膜两次。将膜用ECL Plus化学发光检测系统(Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL)处理。接着，通过免疫印迹的密度测定分析对GP73蛋白的含量进行定量测定。使用具AlphaEase点密度测定软件的AlphaInnotech FluorChem CCD照相机，GP73 表1、三组受试者的特征 NA，不适用；NS，组间无差别；P>0.05 a HCC vs. 肝硬化 NS；HCC vs. 健康对照者P=<0.05 b 结果以“中值（范围）”表示。除非特别说明，数据均以“平均值±标准差”表示。 c HCC vs. 肝硬化 P=0.001；HCC vs. 健康对照者P<0.0001。 d MELD（终末期肝病得分模型） e 肝损伤数量和肿瘤直径。（Number of lesions and tumor diameter includes the mean±SD for all cases as well as by UNOS TNM stages 1–4.） 特殊的信号通过X线片被定量，而且表达为相对于Sigma血清对照标准物的GP73信号完整强度单位。为了检测的重现性，每一血清样本都测定三次。批间变异系数为8%，批内变异系数为10%。 2.3．统计分析 AFP和GP73的统计描述是通过盒形图比较的，包括异常值。除非另外说明，所有数值都表示成平均数±标准差的形式。由于AFP和GP73的非参数分布特性，各组中值差异通过Mann-Whitney非参数检验方法比较。对于二元变量，则运用卡方检验对各组进行比较。通过McNemar检验方法，确定AFP和GP73浓度在临界值之上或之下的HCC受试者比例。在绘制受试者工作特征（ROC）曲线之前，对AFP和GP73的值进行对数转换。为了确定HCC诊断时AFP和GP73最佳临界值，每次分析时，采用所有可能的临界点构建ROC曲线。构建ROC曲线下面积（AUROC），并像以前报道的那样进行比较[17，18]。使用<0.05的双尾P值来确定统计学意义。所有分析均使用软件SAS8.2（Cary，NC，USA）进行。 3．结果 共招募352位受试者。56位健康对照，152位非HCC肝硬化患者，144位HCC患者。受试者的人口统计学、临床和实验室信息列于表1。HCC和肝硬化两组患者的人口统计学特征是相似的。HCV是肝硬化患者组和HCC患者组肝病的潜在病因，分别占58%和56%。144位HCC患者的肿瘤分期：17位（12%）为T1期，52位（36%）为T2期，其余的75位（52%）为T3/T4期。 3.1．血清GP73的检测，比较肝硬化患者和HCC患者的血清GP73含量 免疫印迹分析显示，所有受试者血清均可检出GP73。但与无肝病的健康对照者相比，HCC患者和肝硬化患者血清中GP73的浓度更高（图1）。对GP73的特殊信号进行密度定量后，可以对各组受试者进行比较，尤其是在肝硬化和HCC两组受试者之间。各组GP73血清含量中值：无肝病的对照者为1.4个相对单位（范围，0.6-13.9），肝硬化受试者为4.6（范围，0.6-27.6）个相对单位，HCC受试者为13.2（范围，1-53）个相对单位（P<0.0001,HCC受试者vs.肝硬化受试者及无肝病受试者）。各组AFP血清含量中值：无肝病对照者为2.5ng/ml（范围，1.2-7.8），肝硬化患者5.9 ng/ml（范围，0.3-613），HCC患者为15.6 ng/ml（范围，0.9-347,000）（P<0.0001,HCC受试者vs.肝硬化受试者和无肝病对照者）。 肝硬化患者与早期HCC患者（UNOS modified stage1和stage2）相比，血清GP73含量中值，早期HCC患者显著高于肝硬化患者：12.8（范围，1-50）个相对 图.1.健康对照者、肝硬化患者和肝细胞癌患者血清GP73水平的免疫印迹分析。顶部为无肝病的对照者的血清免疫印迹分析，中部和底部则分别为肝硬化患者和HCC患者的。 图.2.通过免疫印迹分析的量化，表示肝硬化患者和HCC患者血清AFP和GP73含量水平的散点图。A图显示的是AFP的水平，B图显示的是GP73的水平，黑线表示的是中值，数值标在散点图的底部。比较肝硬化患者和HCC患者的GP73水平，P<0.0001；比较两者AFP水平，P=0.03。比较无肝病对照者和HCC患者的GP73水平和AFP水平，均呈P<0.0001。 图.3.比较肝硬化患者和早期HCC患者GP73和AFP水平的散点图。A图显示的是AFP的水平，B图显示的是GP73的水平。比较肝硬化患者和早期HCC患者GP73和AFP水平，GP73呈P<0.0001，而AFP呈P=0.001。 单位vs.4.6（范围，0.6-27.6）个相对单位（P<0.0001）；血清AFP含量中值，早期HCC患者也明显高于肝硬化患者：10.9 ng/ml（范围，1.4-134000）vs.5.9 ng/ml（范围，0.3-613）(P=0.001)，但是，与GP73的含量水平相比，两组患者AFP含量水平间有很大的重叠（见图3）。 我们早期的研究发现，病毒性肝炎患者GP73含量水平表现上调，于是我们将HCV相关的HCC患者（n=80）与非病毒性HCC患者(n=64)的GP73含量水平进行比较。发现非病毒性HCC患者血清GP73含量中值为14.9(范围，1.0-33.1)个相对单位，HCV相关HCC患者血清GP73含量中值则为19.4(范围，2.3-53)个相对单位，两者没有区别（P=0.09）。于是，我们就只对慢性HCV感染患者（肝硬化患者n=88，HCC患者n=80）的血清GP73含量水平中值进行了评估，发现，HCV-肝硬化患者的血清GP73含量水平中值为5.1（范围，1.2-23.1）个相对单位，而HCV-HCC患者的血清GP73含量水平中值则上升到了19.4（范围，1.0-33.1）个相对单位（P<0.0001）。至于血清AFP含量，HCV-HCC患者也明显高于HCV-肝硬化患者（P=0.01）,但差异不如GP73那样显著。 3.2．区分HCC与肝硬化时，GP73和AFP的敏感度和特异度 绘制ROC曲线，确定最佳临界值，并鉴定GP73和AFP在区分HCC患者和肝硬化患者时的敏感度和特异度。GP73的ROC曲线下面积（AUROC）为0.79（95%CI：0.72-0.82），敏感度为69%，特异度为86%，最佳临界点为10个相对 图.4. 比较GP73（虚线）和AFP（黑线）的ROC曲线。A图：HCC患者vs.肝硬化患者；B图：早期HCC患者vs.肝硬化患者。AFP和GP73在两条曲线上的临界值以粗体数字表示，最佳临界值数字表示在方框内。P值为比较AFP vs. GP73的AUROC所得到的。 表2、AFP和GP73水平在最佳临界值之上和之下的HCC患者，最佳临界值是通过AUROC确定的 临界值是通过ROC曲线确定的。*AFP水平的单位为ng/ml。当AFP临界值值取20时，GP73 vs. AFP的McNemar’s P=0.007；当AFP临界值值取100时，两者比较的P<0.0001。a GP73的含量水平以相对单位表示。 单位；而AFP的AUROC为0.61（95%CI，0.59-0.71），敏感度为30%，特异度为96%，最佳临界值为99ng/ml（图4）。比较之下，GP73的AUROC指标优于AFP（P=0.001）。通过ROC曲线确定的最佳临界值，发现，在56位AFP<20ng/ml（AFP推荐临界值）的患者中，有32位的GP73水平高于临界值，而在108位AFP<100ng/ml（本研究通过ROC曲线确定的临界值；表2）的患者中，有77位的GP73水平超过了临界值。 接着鉴定GP73和AFP在区分早期HCC患者（T1和T2期）和肝硬化患者时的敏感度和特异度。GP73的AUROC为0.77（95%CI：0.704-0.826），临界值为10个相对单位时，敏感度为62%，特异度为88%。而AFP的AUROC为0.62（95%CI：0.55-0.69），临界值为112ng/ml时，敏感度为25%，特异度为97%。通过比较两者的ROC曲线，发现GP73明显优于AFP（P<0.0001）(图4)。 4、讨论 我们的研究发现，GP73，一种高尔基体滞留糖蛋白，能在包括无肝病对照者在内所有受试者的血清中检测到，而肝硬化患者和HCC患者的血清GP73含量明显更高。在慢性肝病患者中，HCC患者的血清GP73水平显著地高于肝硬化患者。这一结果证实了我们曾观察到的，HCC患者肝细胞GP73出现上调的现象[13]。我们的发现也表明，GP73可以作为HCC的血清标志物。比较所有HCC患者与肝硬化患者的ROC曲线，发现在诊断HCC时，GP73优于AFP，GP73的AUROC为0.79（95%CI：0.72-0.82），敏感度为69%，特异度为75%。另外发现，在血清AFP水平低于20和100ng/ml的HCC患者中，分别有62%和71%的患者血清GP73超过了最佳临界值，这表明，对于AFP处于正常水平，或是AFP轻微升高的HCC患者，用GP73进行诊断是很有用的。更重要的是，早期HCC（T1/T2）患者的血清GP73水平显著的高于肝硬化患者（不考虑病因），而且，由AUROC也确定，GP73的性能优于AFP。我们的发现表明，作为HCC早期诊断的血清标志物，GP73优于AFP。 在血清中发现GP73多少令人感到惊奇，因为它是一种滞留的高尔基体膜蛋白。然而，最近发现GP73可以循环到细胞膜，并通过一种独特的内吞体途径回收[19]。这些体外研究表明，GP73能短暂的到达质膜，说明它能通过一种潜在的途径释放到循环系统中。HCC出现GP73上调现象的机制还不清楚。正在进行更多的研究来确定其他实体肿瘤患者的血清GP73水平是否发生变化。本研究组已经鉴定了GP73的不同亚型，它们的糖基化形式、水平互不相同[20]。GP73的特定亚型很可能与肝脏疾病，特别是HCC相关，这与AFP类似。目前，通过等电聚焦，已经鉴定了几种AFP的疾病特异性亚型：亚型I与良性肝病有关，亚型II与HCC有关，亚型III与非精原细胞瘤的生殖细胞瘤有关[21]。据报道，对于HCC，HCC特异性AFP亚型的阳性预测值为75%，而整体AFP的阳性预测值仅为41%[22]。 我们发现，虽然GP73是比AFP更好的HCC诊断标志物，但它仍有一些不足之处需要说明。第一，这仅是该生物标志物的第一期研究，因此，在它应用于临床之前，仍有几期的验证研究工作需要进行。第二，由于样本数量的限制，我们无法确定GP73的表现与潜在的肝病病因之间的联系。第三，GP73的检测，是通过免疫印迹方法进行半定量分析，劳动量太大，不适于大样本量验证研究所需的高通量分析。 总之，我们发现，GP73是HCC新的血清标志物。我们的数据显示，GP73的总体表现优于AFP。在早期HCC患者的诊断方面，GP73也表现得更好。这些数据还需要在更大队列的患者中进行验证工作，这包括：确定GP73是否是早期HCC可靠的血清标志物；比较GP73与AFP在不同性别、种族及肝病病因的患者中的准确性；确定GP73在HCC监测中的作用。未来的研究工作将会阐明细胞GP73释放的机理，并建立高通量定量血清含量测定的方法，也将会鉴定出HCC-特异性GP73亚型。 Acknowledgements We thank Mr Michael Trotter for excellent technical support at Thomas Jefferson University. This research was supported by CA 864000 Great Lakes New England Clinical Epidemiology Center of the Early Detection Research Network (JAM), DK64909 (JAM); CA84951 of the Early Detection Research Network (TMB), an appropriation from the Commonwealth of Pennsylvania (TMB), and the Hepatitis B Foundation (TMB); and a VA merit review (CJF). References [1] Llovet JM, Burroughs AK, Bruix J. Hepatocellular carcinoma. Lancet 2003;362:1907–1917. [2] Howe HL, Wingo PA, Thun MJ, Ries LAG, Rosenberg HM, Feigal E G, et al. Annual report to the nation on the status of cancer (1973 through 1998), featuring cancers with recent increasing trends. J Natl Cancer Inst 2001;93:824–842. [3] Tanaka Y, Hanada K, Mizokami M, Yeo AE, Shih JW, Gojobori T, et al. A comparison of the molecular clock of hepatitis C virus in the United States and Japan predicts that hepatocellular carcinoma incidence in the United States will increase over the next two decades. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:15584–15591. 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