叶绿体色素的提取分离和理化性质

系别：航院 班号：力9 姓名：奚柏立 学号：2009011642 （同组姓名：王励旸） 实验日期：2009年10月11日 叶绿体色素的提取分离和理化性质 A 提取与分离 1、​ 实验原理 叶绿体中的叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素不溶于水，但可溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。提取液可用薄层层析色谱法加以分离和鉴别。 薄层层析色谱法是将吸附剂均匀涂在玻璃板上成一薄层。把待分离的样品溶液点在薄层板的下端并把薄层板下端浸入展开剂中后，展开剂通过毛细管作用由下而上逐渐浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品在吸附剂和展开剂之间不断地吸附脱附。由于吸附剂对样品中不同成分的吸附能力不同，从而使各成分有不同的移动速度而彼此分离。 二、实验材料和仪器 1.新鲜的菠菜切片 2.体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂（石油醚：丙酮：苯=7：5：1，体积比） 3.天平，研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸 三、实验步骤 1.叶绿体色素的提取 2.叶绿体色素的分离 （1）.取硅胶预制板一个，用点样毛细管吸取上述提取液，平行于硅胶板的短边，距下边缘1cm处用毛细管划线，风干后再划第二次，重复操作3~4次 （2）.在干洁的层析缸中加入适量的展开剂，高度约0.5cm，将硅胶预制板带有色素的一端放入，使其下端浸入展开剂中（勿使待测样品浸入展开剂中）。迅速盖好层析缸盖。 （3）.观察。当看到各种色素得到较好分离，展开剂前沿接近硅胶预制板上端近边缘处时，取出硅胶预制板，并迅速用铅笔标出展开剂前沿和各色素带的位置。 四、实验结果 经过薄层色谱分离后，叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色、胡萝卜素为橙黄色和叶黄素为鲜黄色。各色素条带在薄层中的位置可用相对比移值Rf来示，即 Rf=斑点中心到原点的距离/溶剂前沿至原点的距离 名称 上升高度/cm Rf 展开剂 9.00 - 胡萝卜素 8.50 0.944 叶绿素a 7.30 0.811 叶绿素b 6.95 0.772 叶黄素 6.35 0.706 B 理化性质 一、实验原理 叶绿素是一种由叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成甲醇和叶绿醇及叶绿酸盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分离。叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜则成为很稳定的铜代叶绿素，其在光下不易被破坏。 2、​ 实验材料与试剂 1.​ 新鲜菠菜叶片、叶绿体色素乙醇提取液 2.​ 刻度试管，小试管若干，试管架，水浴锅，10ml移液管，锡箔纸 3.​ 体积分数为95%的乙醇，苯，醋酸铜粉末，质量分数为5%的稀盐酸，醋酸-醋酸铜溶液，氢氧化钾-甲醇溶液 3、​ 实验步骤 1.​ 荧光现象的观察 （1）​ 取一支小试管加入3ml浓的叶绿体色素乙醇提取液 （2）​ 将试管在直射光下照射，比较溶液的透射光与反射光的颜色不同 2.​ 皂化作用（绿色素与黄色素的分离） （1）​ 取一支小试管加入3ml浓的叶绿体色素乙醇提取液 （2）​ 向试管内加入1ml氢氧化钾-甲醇溶液并充分摇匀 （3）​ 片刻后加入3ml苯并摇匀 （4）​ 再沿试管壁慢慢加入1ml左右蒸馏水并轻轻混匀 （5）​ 然后将试管置于试管架上静置分层（若不分层，则用滴管吸取蒸馏水沿管壁滴加，边滴边摇直到分层时静置） （6）​ 观察 3.​ H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用 【1】 （1）​ 取两支试管，第一支试管加叶绿体色素乙醇提取液5ml，作为对照 （2）​ 第二支试管加叶绿体色素乙醇提取液5ml后，再加入质量分数为5%的HCl数滴，并摇匀 （3）​ 观察溶液颜色变化 （4）​ 当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末 （5）​ 用60℃水浴加热，观察溶液颜色变化情况 （6）​ 与对照试管相比较 【2】 （1）​ 取新鲜植物叶两片放入试管中，加醋酸-醋酸铜溶液使之没过叶片 （2）​ 用90℃水浴加热，随时观察叶片颜色的变化直至颜色不再变化为止 4、​ 实验结果 1.荧光现象的观察 溶液的透射光为绿色，反射光为暗红色。因为叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。（右图） 2. 皂化作用（绿色素与黄色素的分离） 溶液分为两层，下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的绿色的叶绿素a和叶绿素b（以及少量叶黄素），上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。 3. H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用 【1】经水浴加热后的溶液颜色变为深绿色，比对照试管中的溶液颜色更深。 【2】经水浴加热后的溶液颜色先略微变黄，然后变为深绿色 因为叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜则成为很稳定的铜代叶绿素，其在光下不易被破坏。 5、​ 实验讨论 1.研磨提取叶绿素时加入CaCO3有什么作用？ 答：加入CaCO3 能使叶绿素中的一些成分在研磨时不受破坏。 2.叶绿素与光 光对叶绿素的作用有双重性：光是影响叶绿素形成的主要条件。从原叶绿素酸酯转变为叶绿酸酯需要光，而光过强，叶绿素又会受光氧化而破坏。叶绿素分子含有一个卟啉环的"头部"和一个叶绿醇(植醇，phytol)的"尾巴"。卟啉环由四个吡咯环以四个甲烯基(－CH＝)连接而成，它是各种叶绿素的共同基本结构。吡咯环的中央络合着一个镁原子，镁偏向带正电荷，而与其相联的氮原子则带负电荷，因而"头部"有极性，是亲水的。另外还有一个含羰基的同素环（含相同元素的环），其上一个羧基以酯键与甲醇相结合。环D上有一个丙酸侧链以酯键与叶绿醇相结合，叶绿醇是由四个异戊二烯单位所组成的双萜，是亲脂的，能伸入类囊体的拟脂层，故叶绿体能定向排列。卟环上的共轭双键和中央镁原子容易被光激发而引起电子的得失，这决定了叶绿素具有特殊的光化学性质。如（荧光现象） 3.在含量测定中，由于操作不熟（点样时未能点成直线，且点样斑点偏大，导致各色素带最终不呈直线），产生了一定的实验误差 6、​ 实验心得 通过这次试验，我了解到了叶子中的各种主要色素，并学会了一种新的方法——薄层层析色谱法，并了解到了叶绿素的不稳定性，并从中提升了对生物的兴趣，薄层层析色谱法相对于我们中学学的纸层析法，结果更为准确，现象更为明显，也更能说明叶子汇总的各种色素。我还了解到了光对叶绿素的作用有双重性，即光是影响叶绿素形成的主要条件。从原叶绿素酸酯转变为叶绿酸酯需要光，而光过强，叶绿素又会受光氧化而破坏。 从这次试验中，也发现了自己的一些不足，即做实验不够细心，要在以后严格按照每一步不步骤来完成实验，要有耐心，有信心，这样才能出色的做完一个实验。