逆转录病毒包装常见问题

逆转录病毒包装常见问题 问：大家好，请问有人做过逆转录病毒包装吗，我最近在用PT67包装病毒，按照说明书上的要求，在细胞长到70%左右汇合时加入质粒和脂质体和无血清培养液培养4小时后更换为完全培养基继续培养24小时后加300ug/MLG418筛选，现在加药已经36个小时了，可是看细胞长的密密麻麻的大概有100%了吧，还不见细胞往下掉，我真是急死了，300ug/ml的筛选浓度是我在预实验里确定的应该错不了，可是为什么加药以后细胞还不死呢，说明书上说70%汇合时转染后还要继续培养24-36小时再加药，我知道这是要让抗性基因表达，但是24小时的时间细胞都可以长满了啊，会不会把已经转上的细胞淹没了？ 答：我原来做过逆转录病毒，有一些经验，大家多多交流。 通常，当细胞长到70-80%的时候，转染，再过24-48小时后，细胞已经长满（PT-67生长很快）。我采用的方法是：将细胞1：3——1：8传代后，待细胞贴壁或不贴壁（这两个情况我都试过，都能产生克隆），加入筛选浓度的G418（我选的浓度一般是在一周内几乎能把所有野生型细胞杀光）。 通过以上操作，过上一周到两周的时间，都能产生一个一个的细胞克隆团，如果你要求很高，可以挑单细胞做单克隆，如果不太高，可以用滤纸将挑几个克隆团出来，分别培养，然后再维持筛选，最后选用产毒量高的克隆细胞做为逆转录病毒的包装细胞。 答：想筛选稳定产生病毒PT67细胞吗?筛选抗性克隆仅有G418的最适浓度是不够的,还要有合适的细胞密度.您应该在筛选最适密度的基础上,在转染后按此密度将PT67细胞铺板,进行筛选.否则转染后直接筛选的细胞密度太高了，G418压不住的. 答：PT67细胞是拿来包装病毒的，你需要先收集病毒再感染细胞，然后再筛选的！貌似是不可以这样做的吧！要不然怎么能收集到包装好的病毒呢？楼主可以先再pt67上包装病毒，收集病毒后再感染nih3t3，再加药筛选，最好亲自实验一下药物浓度，文献里的浓度并不一定适合你的细胞！ 答：G418筛选需要1周左右的时间才能看到细胞开始死，另外转染完后需要把细胞传到大皿里开始加压，你的细胞密度太大了，很难杀死。 问：我是实验新手，请各位高手指点， ！我打算将目的基因连接到逆转录病毒载体pLXSN上，然后转染包装细胞。关于逆转录病毒的包装细胞，文献上提及好几种，如PA317细胞、293细胞、PT67细胞等，请问哪种包装细胞的包装效果较好，请各位赐教？另外，当病毒颗粒从包装细胞中分泌出来之后，如何检测证明这些颗粒是已包装好的呢？ 答：各种细胞均可包装出病毒，于我的经验293比较好。证明病毒是否包装好可以直接拿病毒 区感染细胞，加抗生素筛选不死即可证明病毒是制备成功的，或者感染后WB检测效果。 问：请问那位有GFP绿色荧光蛋白的逆转录病毒包装体系 答：博川生物、invitrogen等有售。 问：用PT67包装逆转录病毒，在用脂质体转染逆转录病毒载体到PT67后，用G418筛选后14天，并没有出现单克隆细胞团啊，而且细胞看起来都状态不好，这是什么原因啊？对照组，也就是没转染的PT67也没全死啊。求大家帮帮忙，这是什么原因啊？ 答：你用的筛选浓度是多少，我的筛选浓度是800，一个礼拜对照组细胞就全死了，现在刚好14天，单克隆已经形成。我转染24h后1：6传的代，传代的同时就用800的条件培养基培养， 一个礼拜后我把筛选浓度由800降为300，效果不错。 问：腺病毒载体可以浓缩或稀释吗？方法如何？ 答：可以浓缩：对于一般实验室用户，腺病毒载体可以用300K以下的浓缩离心管（PALL 公司产品）进行浓缩。一般来说浓缩后的滴度以不超过3×1012v.p/ml为宜，过浓可能导致病毒聚集而产生沉淀。
可以稀释：在实验过程中稀释病毒产品的等渗溶液没有其他特殊要求，常规的动物试验用等渗溶液即可，如PBS、生理盐水等。稀释后的样品尽量一次用完，在没有保护剂的情况下，腺病毒在2～8℃保存时间越短越好。 问：腺病毒载体产品如何保存和运输？ 答：避免反复冻融，请酌情分装后于-70℃保存，建议不要在-20℃下长期保存。在我们提供的 保存液中，腺病毒产品-70℃保存期为1年。
腺病毒产品解冻后最好保持在冰浴中，并尽快使用。如果解冻后的病毒一时用不完，滴度足够高时（比如1011~12VP/ml），4℃可保存1~2周。
腺病毒产品一般采取冰袋运输（4℃）。在邮寄病毒时，建议不要以干冰方式运输，因为干冰所造成的CO2气体环境会大大降低缓冲液的pH值，从而极大影响腺病毒在缓冲液中的稳定性。但如果使用封口严密的西林瓶或安培瓶包装腺病毒，则可以用干冰运输。 问：用于体内试验的腺病毒，是否要求纯化？ 答：是的，病毒纯化是很必要的。因为细胞裂解液包含有缺损颗粒、大量的腺病毒fiber和penton蛋白（细胞毒素）、培养基、血清以及细胞碎片。这些杂质如果被注入动物体内，会引起宿主强烈的免疫反应。另外，纯化的作用还包括可以将病毒浓缩至一定浓度便于注射、使病毒悬浮于适于体内注射的缓冲液中等。 问：小鼠体内注射腺病毒，一只小鼠肌注大概多少量？体内表达时间和表达高峰如何 答：我们建议的腺病毒用量范围在108-10IU/只小鼠。根据我们的经验，小鼠肌注腺病毒后，3~4天目的蛋白的表达达到高峰，一周后逐渐下降，持续表达时间在两周左右。 问：腺病毒载体对小鼠的半致死剂量（LD50）大概是多少 答：据我们的经验，静脉注射小鼠（昆明鼠），半致死剂量LD50大约为1×1011v.p./只；裸鼠和SCID鼠可能更敏感一些。肌注方式的LD50未测到：1×1012v.p./只给药，未发现小鼠死亡