ELISA在牛病毒性腹泻病检测中的应用

ELISA在牛病毒性腹泻病检测中的应用 2010-08-19 22:17:44 来源：动物医学进展 浏览：349次 邓 宇1，2，王新华2* （1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003；2.新疆农垦科学院绵羊繁育生物技术重点实验室，新疆石河子 832000） 摘 要：牛病毒性腹泻病呈世界性分布，在许多养牛业发达国家尤其严重，造成该病广泛流行的主要传染源是牛群中存在持续性感染牛，因此建立起特异、敏感、简便且快速的诊断来检疫、淘汰持续性感染牛是防制该病的关键之一。ELISA因其特异性强，敏感性高，重复性好，方法快速、简便，设备简单等优点，而得到日益广泛的应用,愈来愈受到人们的重视。目前，应用ELISA检测牛病毒性腹泻病毒已有不少研究，主要包括抗原捕获ELISA、间接ELISA、ABS-ELISA、双抗体夹心ELISA、单抗夹心ELISA、竞争ELISA以及M-ELISA等。文章就这几种检测方法的研究进展进行了概述，为进一步控制牛病毒性腹泻病毒提供参考。 关键词：牛病毒性腹泻病毒；ELISA；检测 牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）又称为牛病毒性腹泻-黏膜病病毒（Bovine viral diarrheamucosal disease virus,BVD-MDV）,或黏膜病病毒（Mucosal disease virus,MDV）,在分类学上属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）［1］，与猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）在血清学上发生交叉反应［2］，并能够突破宿主的特异性发生交叉感染，因此该病毒感染牛的同时还能够感染绵羊、山羊、猪、鹿及其他反刍动物。BVDV感染牛可引起多种临床症状——高热，白细胞减少，沉郁，下痢，大量流涎，减奶以至停奶，反刍停止，结膜炎，口腔黏膜充血并出现溃疡斑，孕牛可能流产、产死胎和畸形胎等,还可以引起牛的免疫耐受与持续性感染、免疫抑制［1］。长期以来，该病一直严重影响畜牧业的发展。同时BVDV还是牛源生物制品（血清、冻精、冷冻胚胎及疫苗等）的常在污染源，给畜牧业和相关商业领域造成了巨大的经济损失。因此，建立一种准确、快速检测该病的方法显得极为重要。目前用于诊断BVDV的方法很多，如琼脂扩散试验、病毒分离、荧光抗体试验、ELISA、PCR技术等。而ELISA具有独特的优点，该方法能检测大批样品，其所需设备简单，容易操作，而且具有特异、敏感、快速等特点，在控制和根除BVDV方面发挥着越来越重要的作用。 1 抗原捕获ELISA Graham D A等［3］应用商品化的BVDV抗原捕获ELISA试剂盒检测214份牛血清来作为一种常规的监测，同时将其中的208份血清通过病毒分离法（VI）进行病毒的分离作对比。结果表明，抗原捕获ELISA和VI的灵敏度分别为45.8%, 47.8%；相应的特异性分别为95.3%,95.1%；用单克隆抗体从24份阳性全血样品中检出22份BVDV疑似血样。Vilek R W等［4］为了弥补捕获ELISA的不足，通过更改白细胞标本制作方法和调整阴性零界值来改进商品化的BVDV抗原捕获ELISA技术，以满足更加有效地检疫持续性感染（persistently infected,PI）牛的需求。采用RT-PCR对6 110份样品进行检测作为参比，其中的786份样品应用改良前的抗原捕获ELISA方法检测；剩余的样品用改良的抗原捕获ELISA进行检测，结果，与RT-PCR检出样品中BVDV阳性率相比，改良前的抗原捕获ELISA检出的阳性率为4.71%，改良抗原捕获ELISA为0.82%（阳性率由从4.71%降至0.82%），这一结果表明，改良后的抗原捕获ELISA方法的准确性有了进一步提高，更适合检测BVDV。 2 间接ELISA 孙泉云等［5］采用该方法以纯化BVDV包被酶标板检测奶牛血清和猪血清中BVDV抗体，结果表明，在24个奶牛场的720份牛血清中阳性率为0.57%(4/720)；猪群中阳性率可以高达92.7%（139/150）。Beaudeau F等［6］采用间接ELISA和血清中和试验两种方法同时对1 113份散装奶进行BVDV检测，结果ELISA的敏感性和特异性分别达到了95%和97%。 3 ABS-ELISA ABS为亲和素生物素（avidinbiotin）。把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。亲和素-生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素-生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素-酶结合物，以放大反应信号。Thür B等（1997）应用ABS-ELISA对具有腹泻临床症状的284头牛进行BVDV检测，检出65头为阳性，经试验证实，该方法适用于未固定组织冰冻切片中的BVDV；可采取活牛的皮肤或死牛的甲状腺、口腔黏膜、食道黏膜、真胃黏膜进行ABS-ELISA检测。 4 双抗体夹心ELISA 王新平等［7-8］以双抗体夹心ELISA对长春地区293头奶牛和262头黄牛血清进行了检测，结果奶牛和黄牛的阳性率分别为54.9%和43.5%。经敏感性、特异性和重复性试验证实，该方法是一种敏感、特异、快速、操作较简便、适用于基层的检测方法。并在此基础上研制成了诊断试剂盒。Saliki J T等［9］采用病毒分离(VI)和双抗体夹心ELISA（S-ELISA）两种方法对408份牛血清样品进行了检测，已经被VI法判定为阳性的172份血清和被判为阴性的236份血清重新用S-ELISA进行了检测，最后两种方法判定的结果完全一致，敏感性和特异性的吻合率均为100%。 5 单抗夹心ELISA 随着单克隆抗体技术的发展，以特异性单抗做包被抗体的ELISA方法得到广泛的应用。Mignon B等［10］应用单克隆抗体去捕获血样中BVDV，通过对761份已知状况的样品进行检测，结果，其特异性、敏感性都达到了100%，高于经典的病毒分离法（virus isolation，VI）,而且二者的相关性超过90%。钟发刚等［11］采用酶标的BVDV单克隆抗体作为包被抗体，研制出捕获抗原ELISA检测试剂盒，经试验证实，比传统试剂盒相比，该试剂盒敏感性高，特异性强，重复性好（批间的变异系数为7.46%,批内变异系数为6.58%），而且可以直接进行抗原检测。 6 竞争ELISA Beaudeau F等［12］对从42个奶牛场采集的1 189份血清及奶样用竞争ELISA进行检测，结果检测血清的敏感性和特异性分别为96.9%，97.8%；检测奶样敏感性和特异性为96.9%，97.3%，这一结果表明，竞争ELISA适合大批样检测，并可用于BVDV消灭。Katz等应用同样的方法对147份已知状况的胎牛血清进行试验，同时用血清中和试验（SNT）作对比，经过试验，稀释过的犊牛抗BVDV血清与未稀释的胎牛血清两种样品检测的结果刚好相反。该方法不需要纯度很高的抗原，洗涤时不需去污剂。Kramps J A等［13］建立了针对瘟病毒非结构蛋白NS3的不同高度保守表位的两株单抗WB112和WB103，以这两株单抗作包被抗体，采用竞争ELISA对 1 000份血清进行检测，并用病毒中和试验作对照，结果ELISA的敏感性和特异性分别为98%和99%，该方法能够检测出疫苗接种和病毒感染12 d以后的动物血清中的特异性。 抗体。因为该优点，丹麦把竞争ELISA作为根除BVDV的一个重要的方法。Vanderheijden N等［14］将BVDV Oslossp80基因插入杆状病毒载体中进行表达，制备出重组抗原，用于竞争ELISA中来检测牛血清中BVDV抗体水平。经试验证实，该方法与病毒中和试验所得到的结果高度相关。 7 M-ELISA 当检测非致细胞病变型BVDV时，可以采用此方法。Saliki J T等［15］以单层细胞ELISA(monolayer-cell enzyme-linked immunosorbent assay,M-ELISA)检测BVDV持续性感染牛的血清样品，并与免疫组化法做比较。结果两种方法敏感性的相关性为85%，特异性的相关性为100%，经过试验比较，M-ELISA更适合整群牛中PI牛的检测。以血清作为诊断样品，使此方法具有采样方便、能以较低的费用快速检测大批样品等优点。 8 结语 鉴于该病对畜牧业严重的危害，有必要加强BVDV的检测。ELISA因其操作简便、敏感性强、重复性好、适合大批量样品的检测等优点，已被应用于各种畜禽疾病的诊断，成为了一种常规的检测方法。当前在国外已有BVDV检测ELISA商业试剂盒，其准确度高、敏感性强、重复性好。国内由于对BVDV的危害性缺乏足够重视，因此在这方面的工作大多处于实验室研究阶段，今后继续致力于提高ELISA方法的重复性、稳定性、特异性及敏感性等，并以此建立起化的检测BVDV的ELISA试剂盒仍是广大兽医工作者研究的重点之一。