造血干细胞移植预处理因素对小鼠肝脏作用的研究

四川 大 学学 报 ( 医 学 版 ) J Sichuan Univ (Med Sci Edi) 2010; 41(5) : 803 - 806 造血干细胞移植预处理因素对小鼠肝脏作用的研究* 贾 路1 , 闫志凌2 , 许世娟1 , 徐开林1, 2 , 曾令宇1, 2v 1.徐州医学院 移植免疫 (徐州 221002) ; 2.徐州医学院附属医院 血液科 (徐州 221002) =摘要> 目的 探讨造血干细胞移植各种常用预处理因素对小鼠肝脏的损伤作用。 8~ 10 周龄雌性 BALB/ c小鼠 40 只,随机分为正常对照组、非清髓全身照射组、清髓剂量全身照射组、白消安组和环磷酰胺组,每组 8 只。观察小鼠的一般情况, 计数外周血白细胞, 组织病理观察肝脏病理变化, 透射电镜观察肝脏细胞以及血管内 皮的超微结构变化。结果 移植预处理后各实验组白细胞减少(P < 0. 05) ,各预处理组肝脏组织光镜下有不同程 度的病理改变,电镜下肝细胞和肝脏血管内皮细胞亦有不同程度的损害。结论 造血干细胞移植预处理中全身照 射、白消安和环磷酰胺均可导致肝脏病变以及血管内皮损害,是发生肝静脉闭塞病的重要原因。 =关键词> 造血干细胞移植 肝静脉闭塞病 预处理 血管内皮 =中图分类号> R457. 7 Effects of P retreatment Regimen on Mice Liver Injury in Hematopoietic Stem Cell Transplantation J IA Lu1 , YAN Zhi2ling 2 , XU Shi2j uan 1, XU K ai2lin1, 2 , ZENG Ling2yu1,2 v . 1. Laboratory of T ransplant I mmunolog y, Xuzhou Medica l College, Xuzhou 221002, China; 2. Dep ar tment of H ema tology , Af f ilia ted H ospita l of Xuzhou Medical Colloege, Xuzhou 221002, China v Corresponding author, E2mail: zengly2000@163. com =Abstract> Objective T o investigate the effects of conditioning regimen on mice liver injury during hematopoietic stem cell tr ansplantation. Methods Forty healthy 8210 weeks old female BALB/ c m ice were randomly divided into control group, non2myeloablative tota l body ir radiation group, myeloablative total body irr adiation group, busulfan group and cyclophosphamide group with 8 mice each. The general condition of each mouse was cont inuously observed. Peripheral white blood cells were counted and pathological changes of liver were examined by hematoxylin and eosin stain under microscope. The ultrastr ucture changes of hepatocyte and liver vascular endothelium were detected under transmission electron microscope. Results Compared to cont rol group, each exper imenta l group showed that the count of whit e blood cells was decr eased significantly after conditioning pretreatments ( P< 0. 05) . T he conditioning regimen had injury effects on the mice liver in each exper imental group. There were var ious degrees of damage to t he hepatocyte and liver vascular endothelium. Conclusion T otal body irr adiation, Busulfan and Cyclophosphamide all led to the damage of liver vascular endothelium in hemat opoietic stem cell tr ansplantation, and may be the impor tant triggers of hepatic veno2occlusive disease. =Key words> H ematopoietic stem cell tr ansplantation H epatic veno2occlusive disease Pretreatment Vascular endothelium 肝静脉闭塞病 ( HVOD)是造血干细胞移植 (HSCT)的常见并发症之一, 严重影响了移植患者 的预后[ 1]。在 HSCT 过程中各种原因会导致血管 内皮损伤[ 2, 3] , 肝脏血管内皮损伤则会造成肝脏小 静脉及肝血窦流出不畅或闭塞, 导致诸如肝区肿大 疼痛、黄疸、腹水等一系列临床表现。因此, 肝脏血 管内皮细胞损伤是造成 HVOD的重要病因。本实 验中我们利用小鼠 HSCT 预处理模型, 观察各种常 用预处理方法对小鼠肝脏的影响, 从而探讨 HSCT 预处理因素中可以导致 HVOD的高危因素。 * 江苏省自然科学基金( BK2007504)资助 v 通讯作者, E2mail: zengly2000@163. com 1 材料与方法 1. 1 材料 实验动物:清洁级雌性 BALB/ c小鼠, 8~ 10周 龄,体质量 18~ 22 g, 购自扬州大学比较医学中心 [ SCXK(苏) 200720001]。饲养于恒温恒湿无菌屏 障系统内,给予自由采食灭菌饲料,饮用无菌水。主 要试剂:白消安注射液( PDL BioPharma 公司) , 环 磷酰胺(恒瑞医药股份有限公司)。主要仪器: IX71 型显微镜( Olympus 公司) , H2600 型透射电镜照相 系统(H it ichi公司)。 1. 2 实验分组与处理 BALB/ c小鼠共 40 只随机分为 5 组, 每组 8 四川大学学报 (医学版) 2010 年第 41 卷第 5 期 只,即:正常对照组、非清髓全身照射组、清髓剂量全 身照射组、白消安组和环磷酰胺组。非清髓和清髓 剂量全身照射组分别给予60Co C射线全身照射 5. 0 Gy和 81 5 Gy,剂量率为 0. 5 Gy/ min。白消安组小 鼠腹腔注射给药1 28. 8 mg/ ( kg # d)2, 连续给药 4 d,环磷酰胺组腹腔注射环磷酰胺注射液160 mg/ ( kg # d)2, 连续给药 2 d, 正常对照组腹腔注射生理 盐水。 1. 3 观察指标 1. 3. 1 外周血白细胞计数 移植预处理后隔天各 组小鼠剪尾取血 10 LL, 25 mL/ L醋酸稀释后,用血 细胞计数板在显微镜下计数白细胞。 1. 3. 2 HE 染色观察肝脏组织病理改变 预处理 后第 5 d和第 9 d分别取小鼠以乙醚麻醉后固定于 解剖板上,迅速暴露胸腔,左心室穿刺灌注含有肝素 钠的 1@PBS,然后灌注 40 g/ L多聚甲醛固定小鼠, 取材小鼠肝脏。肝脏病理标本放于 40g/ L 多聚甲 醛中固定。取固定好的肝脏组织, 逐级乙醇脱水, 浸 蜡后包埋, 行 4 Lm切片, 烤片, 行常规 HE 染色, 中 性树胶封片后在显微镜下观察组织改变。 1. 3. 3 透射电镜观察肝脏超微结构变化 移植预 处理后第 9 d, 灌注固定小鼠,透射电镜肝脏标本切 成 1 mm3 大小,固定于 25 g/ L 的戊二醛溶液中 12 h,取固定好的小鼠肝脏, 用 1@PBS 洗去组织中的 戊二醛, 1%四氧化锇固定 2 h, 4 e 漂洗 12 h,逐级 乙醇脱水、丙酮树脂置换渗透、包埋聚合后切片, 醋 酸铀染色 1 h,柠檬酸铅染色 15 min,双蒸水冲洗, 室温干燥后封片, 透射电镜观察肝脏超微结构变化。 1. 4 统计学方法 计量数据以 Šx ? s表示, 两样本的比较用 t 检 验, P< 0. 05为差异有统计学意义。 2 结果 2. 1 小鼠预处理后一般情况及外周血白细胞计数 预处理后各组小鼠体质量均显著下降, 活动明 显减少,摄食减少,并出现不同程度翘毛, 其中清髓 照射组最重,白消安组最轻。预处理后第 3 d非清 髓剂量全身照射组、清髓剂量全身照射组和环磷酰 胺组外周血白细胞计数下降,与预处理前比较差异 有统计学意义(P < 0. 05) ,其中清髓剂量全身照射 组细胞下降最明显, 而白消安组和预处理前比较差 异无统计学意义;预处理后第 11 d非清髓全身照射 组、清髓剂量全身照射组和白消安组外周血白细胞 数与预处理前比较差异有统计学意义(P < 0. 05) , 但环磷酰胺组白细胞数与预处理前比较差异无统计 学意义(附表)。 附表 移植预处理后各组小鼠外周血白细胞变化 Table The changes of whi te blood cel l in peripheral blood after HSCT condit ioning Time ( d) n WBC ( @109/ L) Normal group Non2myeloablative TBI group Myeloab lat ive TBI group Busulfan grou p Cyclophosphamide group 0 8 9. 33 ? 2. 79 9. 33 ? 2. 79 9. 33 ? 2. 79 9. 33 ? 2. 79 9. 33 ? 2. 79 1 8 8. 35 ? 0. 58 7. 93 ? 0. 67 6. 85 ? 0. 68* 10. 61 ? 2. 55 9. 97 ? 1. 81 3 8 9. 08 ? 2. 10 3. 03 ? 0. 95* 0. 49 ? 0. 10* 7. 77 ? 1. 76 2. 44 ? 0. 79* 5 8 8. 68 ? 1. 40 1. 28 ? 0. 29* 0. 27 ? 0. 16* 9. 77 ? 1. 20 2. 88 ? 1. 29* 7 8 8. 45 ? 1. 55 0. 61 ? 0. 20* 0. 22 ? 0. 08* 5. 40 ? 0. 69* 7. 40 ? 0. 70 9 8 9. 24 ? 1. 96 1. 15 ? 0. 18* 0. 13 ? 0. 12* 2. 88 ? 1. 29* 8. 02 ? 0. 53 11 8 8. 65 ? 1. 33 1. 30 ? 0. 23* 0. 12 ? 0. 03* 2. 53 ? 0. 03* 9. 41 ? 1. 33 * P < 0. 05, vs . n ormal group an d b efore HSCT condit ioning ( 0 d) 2. 2 预处理后肝脏组织病理变化 光镜下正常组小鼠肝脏细胞排列整齐, 汇管区 或中央静脉内皮完整, 肝血窦间隙正常。预处理后 第5 d,各实验组小鼠肝脏均出现了不同程度的病理 改变,非清髓全身照射组肝细胞排列整齐,胞浆疏松 (图 1A) ;清髓剂量全身照射组肝细胞排列整齐, 可 见轻度脂肪变性, 肝血窦大致正常(图 1B) ;白消安 组小鼠肝内静脉周围见少量炎性细胞浸润, 肝细胞 肿胀,肝血窦明显变窄(图 1C) ;环磷酰胺组肝脏结 构紊乱,可见肝脏水肿并小量细胞坏死, Kupffer 细 胞增生,肝血窦明显变窄(图 1D)。预处理后第 9 d, 各组肝脏病变均加重, 非清髓全身照射组肝细胞排 列整齐,可见双核肝细胞增多,肝血窦大致正常(图 2A) ;清髓剂量全身照射组肝细胞排列整齐, 但有重 度脂肪变性(图 2B) ;白消安组肝细胞排列不齐, 可 见明显水肿,细胞边界清楚并有点状坏死,肝血窦受 压明显变窄,肝内静脉内皮破损(图 2C) ;环磷酰胺 组肝脏结构破坏并大片嗜酸性坏死, 中央静脉内皮 破损(图 2D)。 2. 3 预处理后肝脏内皮细胞和肝细胞超微结构改 变 电镜下正常组小鼠肝细胞和肝脏血管内皮细胞 804 J Sichuan Univ (Med Sci Edi) Vol. 41 No. 5 2010 均正常,血管内皮完整, Disse间隙适中,各实验组肝 细胞、肝脏小静脉或肝血窦内皮细胞出现不同程度 的损伤改变,非清髓全身照射组可见内皮细胞边界 较完整, Disse 间隙较明显(图 3A) ,肝细胞可见线粒 体肿胀(图 4A) ;清髓剂量全身照射组可见内皮细胞 肿胀,内皮细胞边界清楚,线粒体轻微肿胀(图 3B) , 肝细胞核皱缩, 细胞质减少, 可见线粒体肿胀明显 (图 4B) ;白消安组可见肝脏内皮细胞凋亡剥落, 内 皮细胞核内染色质边集严重(图 3C) , 肝细胞内脂肪 滴明显增多(图 4C) ;环磷酰胺组内皮完整性遭到破 坏, Disse间隙增宽, 内皮细胞肿胀, 边界清楚,核膜 完整,染色质边集, 细胞质减少(图3D) ,肝细胞内线 805 四川大学学报 (医学版) 2010 年第 41 卷第 5 期 粒体减少,细胞严重水肿并脂滴增多(图 4D)。 3 讨论 HSCT 是临床上治疗一些恶性或难治性血液 病的有效手段, 但是移植后的一系列并发症却严重 影响了移植患者的预后。HVOD是 HSCT 后重要 并发症之一,多数研究表明移植后发病率约 10% ~ 60% ,死亡率也较高[ 4, 5]。因此, 探索 HVOD 的病 因和高危诱因将成为如何防治该移植并发症并改善 移植患者预后的切入点。全身照射、白消安和环磷 酰胺是 HSCT 最常用的预处理手段, 本研究在单用 这些预处理方法后利用组织病理和透射电镜观察发 现,除了肝细胞病变外小鼠肝脏小静脉和肝窦血管 内皮均出现了不同程度的损伤, 而这些损伤将是导 致肝脏病变的始动因素。 HVOD是在肝脏小静脉血管内皮损伤后, 血栓 形成血管内膜,致使血管腔狭窄或闭塞,并可引起窦 后性门脉高压、肝功减退、肝细胞坏死等改变的临床 疾病。以往研究发现[ 6] ,在 HSCT 中 HVOD的危险 因素有移植前的肝脏损伤、抗菌药的使用、移植前预 处理、异基因的移植、移植物抗宿主病的防治等。本 研究中使用常用的预处理方式后,发现肝脏组织出现 肝细胞出现肝细胞脂肪变性、水肿或坏死,肝血窦或 小叶中央静脉内皮连续性遭到破坏,肝脏细胞排列紊 乱,肝窦明显变窄等病变。其中清髓剂量全身照射组 肝脏脂肪病变最严重,间接说明大剂量的放射线损伤 导致肝细胞损伤更加严重,而白消安和环磷酰胺组肝 细胞浊肿并坏死更加严重,肝血窦狭窄,导致血流不 畅,可能是发生 HVOD的重要原因。 血管内皮是覆盖在血管内面的单层细胞, 为内 外环境的分界细胞, 在维持机体内环境稳定、防止血 小板黏附、血栓形成等方面起着重要作用[ 7]。在肝 脏中内皮细胞同样起着重要的屏障作用, 维持着肝 脏的正常生理功能, 当肝内血管内皮受损后, 导致肝 内血栓形成,另外内皮通透性增加使肝血窦内血细 胞渗出到 Disse间隙, 肝细胞坏死,流出道受阻导致 HVOD病的发生。已有研究提示[ 8] , 肝脏小静脉和 肝窦内皮细胞损伤以及肝细胞损伤是 HVOD 发生 的始动因素。本研究中 HSCT 预处理因素作用于 小鼠后,透射电镜下超微结构发现实验组肝脏内皮 细胞出现完整性破坏、细胞核边界完整、染色质边 集、线粒体肿胀、细胞质减少等内皮损伤改变, 直接 说明白消安、环磷酰胺和放射线均可造成小鼠肝脏 小静脉和肝血窦内皮细胞损伤, 也提示移植预处理 同样可以诱发 HVOD。 临床上 HSCT 最普遍预处理手段是应用全身 照射、白消安和环磷酰胺,本实验中分别给小鼠应用 上述干预因素,白细胞计数均有明显下降,提示小鼠 造血系统受到破坏,预处理有效。一项报道表明[ 9] , 白消安预处理的移植后 HVOD 累积发病率为 12%,而全身照射预处理的移植则只有 1%。本研 究结果亦表明无论是组织病理还是内皮超微结构, 虽然清髓剂量全身照射对肝脏损害很严重,但是烷 化剂对肝脏细胞以及血管内皮的损害更易导致血流 受阻,是诱导 HVOD发生的重要原因。 综上所述,非清髓照射、清髓照射、白消安和环 磷酰胺均可使小鼠肝脏血管内皮损伤, 导致可见的 肝脏病理损害, 并且成为移植后 HVOD 发生的重 要诱因。 参 考 文 献 1 Kumar S, DeLeve LD, Kamath PS, et al . H epat ic veno2 occlusive disease ( sinusoidal obs tru ct ion syndrome ) after hematopoietic stem cell t ransplantat ion. Mayo Clin Proc, 2003; 78( 5) : 5892598. 2 Zeng L, Yan Z, Wang L, et al . Irradiat ion is an early determinant of endothelial injury durin g hematopoiet ic stem cell t ran splantat ion. T ransplant Proc, 2008; 40( 8) : 266122664. 3 Zeng L, Yan Z, Ding S, et al . Endothel ial injury, an int riguin g effect of methot rexate and cy clophosphamide durin g hematopoietic stem cell transplan tat ion in mice. T ransplant Proc, 2008; 40( 8) : 267022673. 4 Carreras E, Bertz H , ArceseW, et al . Incidence and outcome of hepat ic veno2occlusive dis ease after blood or marrow tran splantat ion: a prospect ive cohort study of th e European Group for Blood and Marrow T ransplantat ion. Blood, 1998; 92 ( 10) : 359923604. 5 Bar ker CC, Butzner JD, Anderson RA, et al . Incidence, sur vival an d risk factors for th e development of ven o2occlusive diseas e in p ediatric hematopoiet ic stem cell t ransplant recipients . Bone Marrow T ransplant , 2003; 32( 1) : 79287. 6 Bearman SI. T he syndrome of h epatic veno2occlusive dis ease after marrow transplan tat ion. Blood, 1995; 85( 11) : 300523020. 7 Biedermann BC. Vascular endoth elial cell s: an interes tin g immunological barrier. Schweiz Med Wochensch r, 1999; 129 ( 45) : 171221716. 8 H o VT , Revta C, Richardson PG. H epat ic ven o2occlusive diseas e after hematopoiet ic s tem cell t ransplantation : u pdate on defibrot ide an d oth er cu rrent invest igat ional therapies. Bone Marrow T ransplant , 2008; 41( 3) : 2292237. 9 Rin gden O, Ruutu T, Remberger M, et al . A randomized t rial comparing busulfan with total body i rradiat ion as condit ioning in al logen eic marrow tran splant recipients with leukemia: a report from th e Nordic Bone Marrow Transplantat ion Group. Blood, 1994; 83( 9) : 272322730. ( 2010 - 03 - 03收稿, 2010 - 06 - 15修回) 编辑 余 琳 806