日本血吸虫尾蚴经人工方法转变的童虫体外培养的研究

第 卷 第 期 年 月 动 物 学 报 , 汀 , 丁 日本血吸虫尾勤经人工方法 转变的童虫体外培养的研究’ 王 薇 周述龙 〔湖北医学院寄生虫学教研室、血吸虫病研究室 , 武汉 内 容 提 要 木文介绍了日本血吸虫体外告养系统。 建立了较适于童虫生长发育的吕 培养基。 尾拗经人工方法转 变的童虫在体外可发育至雌谁合泡 , 雌雄生殖器宫形成。 雌虫可达产卵阶段 , 但未具备正常的产卵机能。培 养的血吸虫在体外至少可存活 天。 体外培养技术已成为现代实验寄生虫研究重要的方法学之一 。 血吸虫体外培养的建 立将为血吸虫病免疫学及药物等方面的研究开辟新的领域。 关于血吸虫童虫培养多为曼 氏血吸虫的资料 , 而日本血吸虫的资料较少 , , , , 了 , , , 林建银等, 。 本文报道用含 外兔血清的 培养基培养日本血吸虫尾蝴经人工方法转变的童 虫 , 童虫在体外发育至产卵阶段。 虽然虫卵是不正常的 , 但经重复实验明 , 日本血吸虫 自尾蝴后在终末宿主体内的生活史阶段可在体外培养条件下基本完成。 材 料 和 方 法 一 、 尾姗的收集与洗涤 人工感染日本血吸虫的阳性钉螺置 。川 烧杯内, 按常规方法逸尾黝。 用 二。 的盖玻片贴水 面尾拗。 将带有尾蜘的玻片放入装有洗涤液的 毫升离心管内。 洗涤液成份为 水解乳蛋白的 儿 。 液、青霉素 拌 。 、链霉素 拌 、 庆大霉素一 ” 。 离心管冰浴 分钟后 , 。转 分离心 分钟, 尾勤沉人管底。取出玻片 , 将尾蜘重复离心洗涤 一 次。 以上步骤在无菌条件下进行。 二 、 童虫的制备 血清转变法 根据 , 〔 方法。 机械转变法 根据 夕 方法。 三 、 培养条件 培养瓶中置 一 , 毫升培养液 , 每瓶加人约 , 一 。。条童虫。 在 ℃、 的二 氧化碳培养箱内进行培养。 培养 小时左右 , 每瓶加人兔红细胞。 培养的后期 , 每瓶中约培养 一 条虫体。 将瓶斜放 , 使虫体相对集中。 每周换培养液两次。 将新鲜培养液置 , 培养箱内预温半小 时 , 调节 值至 。 为了减少培养液的燕发 , 培养箱内放置装有无菌水的磁盘。 囚 、 培养甚的成分及配制 本文于 , 年 月收到。 本项研究得到中国科学院基金支持。 期 王 薇等 日本血吸虫尾勤经人工方法转变的童虫体外培养的研究 血清 健康家兔心脏穿刺取血 , 无菌制备兔血清。 小牛血清购于武汉市牛奶公司。 兔红细胞 新鲜兔血置 摊厂司 肝素的 、 液中 , 离心洗涤三次。 用 丘 、 液保存红细 胞。 置 碑 ℃冰箱内 , 供使用 周。 商品培养基 卫 “ 日本 、 代 日本 。 其它成份 氢化可的松 国产 、胰岛素 国产 、次黄嗦吟 国产 、 ,一经色胺 瑞典 、水解乳蛋白 英国 。 某些成份是根据 。 的 夕培养基。 兔红细胞及抗菌素均在配制新鲜培养液时加 人。 五 、 观案方法 用倒置显微镜观察童虫生长情况。 部分实验在培养 天时计数童虫发育率或固定 测景其大小 部分实验进行童虫长期培养。 用干涉相差进行显微摄影。 部分虫体置 几 一 , 型扫描电 镜观察。 结 果 一 、 培养甚的建立 培养基是体外培养关键性的问题。 为了选择较适宜的培养基 , 我们对几种主要营养 成份对童虫发育的影响进行了比较。 童虫培养时间为 夭。 评价为 童虫摄食 红细胞率 肠管会合率 童虫死亡率。 一 ‘ 。与 ” 培养基对童虫发育的作用 将童虫分别培养于 务 兔血清或 十 并 兔血清的培养基 中。 培养 天后 , 童虫在 斗 培养基中的肠管会合率为 并, 而在 培养基中则为 嘴 务, 有非常显著性差异 表 。 根据实验结果 , 童虫在 。培养基中, 其消化道的发育比在 培养基中快。 二 不同浓度的兔血清对童虫发育的影响 将童虫分别培养于含三种不同浓度兔血清的 斗 培养基中。 在含 兔血清培养 基中的童虫摄食红细胞率及肠管会合率均高于含 , 多和 界兔血清的培养基中 表 而 外血清组的童虫肠管会合率又高于知 血清组。 此外 , 童虫在含 务血清培养基 中死亡率较低。 结果表明 , 童虫在含 外兔血清的培养基中发育较好。 三 不同动物血清对童虫发育的影响 将童虫分别培养于含 。外兔血清或 多小牛血清的培养基中。 在兔血清组 , 童虫 摄食红细胞率及肠管会合率均明显高于小牛血清组 , 二者有非常显著性差异 月 。 且兔血清中童虫的死亡率较低 表 。 结果表明 , 兔血清较适于童虫生长。 四 激素及 一经色胺对童虫发育的影响 将童虫培养于加有激素 胰岛素、氢化可的松 及 一轻色胺的培养基中 , 与另一组未 加激素及 一轻色胺的培养基中的童虫进行比较。 结果见 表的。 在加有激素等培养基 中 , 童虫摄食红细胞率及肠管会合率均高于未加激素组。 二者有非常显著性差异 。 根据以上实验结果 , 我们选择了培养效果较好的成份, 制定了 表约所示的 培养 基。 二 、 两种方法转变的童虫在体外发育的比较 为了选择较理想的培养材料, 将血清及机械方法转变的童虫分别培养于 培养基 朽 动 物 字 狠 仓 一 一 动 物 学 报 卷 工协。巴 卜。工引甘。卜廿。引访甲 承︶ 八、曰司︺卜。苍 哥但椒 工。付节协。 仍卜。啥入 泊今宙 ︵合泪工枪︺﹄乏︶ 并侧撇 甲的洲 。 工 呼。寸。场呼 寸。工的。。工 产东︶ 暇。侧‘︺。斧如胡担自 ︵‘的引。衬归勺︵口口﹃日洲禹︺如。月︸李。﹄钾。月祠吕,﹄。,日叫二脚口‘﹄‘︸制叫 ︵然粥始︸节锌︶俘扮名担洲斌侧友液周潭材坦玲 一一一 , 叫 护 甲 , 叫叫 一一一 口 白白白 尹尹尹叭 、 尸 、 户产 、、 卜卜卜 自 洲、、 、、、产 、训 、尸尸 尸尸尸、 产 尸、、 ,,, 叫 , 叫叫 兄兄兄尸 、洲 、夕夕 认认认 暴石石哥哥逆。。 , , 州州但但县求求 ⋯‘ 戴 城城眠眠李岁岁 声声声声 、、曰曰曰 一一一 ‘ 巴 口口 产产产、 尹内 尹,, 伙伙伙 仍 州州 、、、夕 、 洲 、 厂厂厂、 厂、、 产户、、 州 , 同同 、、、“ 、 尸 、、 哥哥育育 寸寸塑塑·会。。 心 】乙 阶阶 吸吸凤 尽尽 叫 , , 叫叫取取兰,, 荆 毗毗毗 廿 口匀 气 叭叭叭 叫 , 川川 呼呼呼 、 户司司 一一一 勺八 】户 仍仍 肖肖 一一一一一 产产产、 ,声、 产、、 价 们们 、、、 户 、 、‘洲洲 产产产、 产、 ,产产 ,,, 叫 囚 卜州州 、、、护 、‘ 户 、曰曰 哥哥吕吕 吧 囚囚 盈盈舀舀 仍 今今 最最葵葵 叫 叫叫 那那 已已 刹 叫 引引 蟾蟾耳耳 仍 卜劝劝劝劝 余 次次 吕吕吕 卜 囚 曰曰 级级呈呈 犷 , 哈 识识识 阶 劝 心心 逻逻逻逻 擎擎擎 州 帕 叭叭 彭彭遥遥遥 城城里里 咨言王官咨言言 株株书书 日 日 日日 脚脚逻逻 现 留 澳 韶 艇昌昌 彩彩彩鬓鬓鬓 岑岑岑出 岑日 岑出出 八式‘扫璐‘︶︺日。仍。︺,喇禹︺︺‘李。﹄切。︹祠 ︹醚碧辑书哥︶髻淞公恤洲拼侧友察日斌侧悦皿岭 。工洲。工峭闪寸 术︶ 口。叫曰哥妞明枷自 工竹 口。任甸目间﹄ 二 ⋯ 一 创尸留﹄︵︻‘动。︺仍晌禹︺”︺州,‘切。洲工利 ‘公﹄ 勺已 叭引阶 拿 吕维 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消化爪统发育及口吸盘形成 刚转变的童虫体形细长 , 头器明显 , 无口吸盘 , 肠管透明。 童虫最早在第 天开始摄 食红细胞 , 肠管中出现深褐色色素。 第 一 天时 , 童虫肠管呈马蹄形。 至 一 天时 , 肠管开始会合 图 , 虫体前端出现口吸盘的轮廓 图 。 一巧 天时 , 会合的肠管向体 后延伸。 头器已分化成明显的口吸盘 图 。 此时完整的消化道已形成 , 生长较快。 童 虫在体外的发育是不同步的〔图劝。 二 雌雄合抱与产卵 在培养的早期 , 雄虫生长较雌虫快。 一 天时 , 雄虫抱雌沟明显。 雌雄合抱于第 引 天时出现 图 。 雌虫在雄虫抱雌沟内非常活跃。 合抱的雌雄虫有分离后再合抱或 倒位合抱的现象。 观察中经常发现合抱的雌雄虫自口中吐出深褐色的色素物质, 肠内容 逐渐排空 , 同时 , 虫体迅速吞食红细胞。 而未合抱的雌雄虫吐出色素的速度较慢 , 其肠管 内充盈黑色的色素。 合抱的雄虫明显大于未合抱的雄虫。 雄虫有 一 个呈串状排列的球形皋丸 图 。 雌虫体中部有一卵巢 图 。 合抱后的雌虫约第 天开始产卵。 虫卵数量少。 有宽椭 圆形及长椭圆形两种。 部分虫卵有一小的侧刺。 卵壳发育情况不一致 , 或有卵壳 , 或卵壳 不完整 , 或无卵壳。 卵内容物模糊不清。 所产出的虫卵均为不正常虫卵 图卜 。 体外培养血吸虫童虫的形态及消化系统的发育与宿主体内血吸虫相似 , 但生殖系统 的发育迟缓 , 虽雌虫达产卵阶段 , 但尚未具有正常的产卵机能。 血吸虫在体外至少可存活 天。 讨 论 一 、 血清浓度对体外培养童曳的形响 血清是提供体外培养血吸虫的蛋白质及其它营养成份的重要来源。 本实验结果表 明 , 。外 兔血清的培养效果优于高浓度的兔血清。 在培养中发现 , 使用高浓度血清培养 时 , 培养物被污染的机率高于低浓度血清的培养基。 而且 , 血清中病毒及支原体也不能过 滤消除。 由于考虑到灭活血清是否破坏了血清中某些营养成份 , 因而采用了新鲜血清进 行培养。 然而 , 等 。证实新鲜血清中的补体对体外培养的童虫有杀伤作用。 而 低浓度新鲜血清培养基中补体的含量可能相对较低。 二 、 体外培养血吸虫的生殖生理 雌雄合抱是血吸虫发育重要的生理条件。 雌雄合抱主要可能是通过以下方式促进血 吸虫的发育 一 营养物质的传递。 营养物质包括糖、 氨基酸、多肤及蛋白质可通过雌雄合抱的 期 王 薇等 日本血吸虫尾拗经人工方法转变的童虫体外培养的研究 方式传递 , 主要由雄虫传递给雌虫 助 , · , 二 促进雌虫生殖系统的发育 , , 。 三 增加对红细胞的摄取与消化。 , 用同位素标记法证实小鼠体 内合抱的雌雄虫约 一 小时排空其肠内容物。 体外培养的合抱雌雄虫亦具有此生理现 象 , 然而 , 未合抱虫体排出现象不明显。 因此 , 推测雌雄合抱可刺激和增加血吸虫对红细 胞的摄取与消化的转换率 , 以适应合抱的雌雄虫生殖系统发育的营养需要。 将小鼠体内性成熟雌雄虫分离移植至另一宿主体内后 , 雌虫生殖系统逐渐退化 , , 。 由此可见雄虫对雌虫的持续刺激对维持雌虫生殖系统的正常状况是 必需的。 在体外培养中, 有时因更换培养液时的温度变化或培养液的 声 值的改变均可 造成合抱的雌雄虫分离。 这可能是导致血吸虫生殖系统发育迟缓的原因之一 。 因此 , 保 持培养条件的恒定对于血吸虫生殖系统的发育是重要的。 何毅勋 证实在两性血吸虫生殖腺含有丰富的核酸、蛋白质。 在性将成熟及完 全成熟的雄虫实质组织及雌虫卵黄细胞中沉积相当量的脂类。 上述结果说明血吸虫生殖 系统发育的过程中伴有核酸、 蛋白质及脂类的大量合成。 培养基中的营养物质是否能满 足血吸虫生殖系统发育的营养需要 , 尚有待探讨。 目前有关血吸虫生殖的生理生化研究 资料较缺乏 , 有必要加强研究 , 为进一步改善培养基及培养条件提供理论依据。 今 考 文 献 何毅勋、 杨惠中 ,即 。 日本血吸虫发育的组织化学研究。 动物学报 〔 ”一 。 林建银、 李 瑛、 周述龙 日本血吸虫肺型童虫体外培养的研究。寄生虫学与寄生虫病杂志 灭 卫‘斗一 ‘ 飞 吕 , 一 , ‘ 的 女盖动‘‘ 二 叨 泥‘ 丹 已 一 , 占‘左玄‘ , 功 附 。‘ 盆月 , 宕 田 。 。比 , 雌 ‘ 犷 · 一 五, , 甲 人犷‘ ‘ 胡 用 , 介百。称 月 介 矛 夕 , , 于 , 几 一 卜 正 协 习。血 “东云君 , , 苦, 口 越 。 人 , 。‘。二 , , 石 , 。万, ‘ 肠 一 一 闭 孟 亡 仿 ‘,一 呱 户 儿 口了几 夕 介 了子。‘ 仍 一 加 招车。称玄 认 厉 代 。, 。, , 五了‘勿 , 。二 。 。 。‘。。‘ 介 , 一 , , 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