禽流感疫苗

第21卷　第5期　　　　　　　　　　中　国　预　防　兽　医　学　报 V o l. 21, 　N o. 5 1 9 9 9 年 9 月　　　　　　　Ch inese Jou rna l of P reven t ive V eterinary M edicine　 Sep 1　1999 禽　流　感　疫　苗 马文军, 于康震 (中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室, 哈尔滨　150001) 　　中图分类号　S858131　　　　　文献标识码　A 　　　　文章编号　100820589 (1999) 0520398203 　　禽流感 (A vian Influenza, A I) 是正粘病毒科A 型流感病 毒引起的一种鸟类病毒性疾病, 被国际兽疫局确定为 I 类烈 性传染病。1878 年在意大利的鸡群首次发现本病暴发, 目前 在美洲、欧洲、亚洲、非洲、澳大利亚等世界上许多国家和地区 都发生过本病。由于禽流感病毒 (A IV ) 变异性强, 血清型众 多, 给疫苗的研究带来极大困难。目前世界上研制出的禽流感 疫苗主要有灭活全病毒疫苗、亚单位疫苗、重组活载体疫苗和 核酸疫苗等。高效、安全、实用的禽流感疫苗的研制一直是世 界养禽业关注的焦点。本文将对世界上现有的几种主要禽流 感疫苗的研究现状及优缺点作以简要综述。 1　灭活全病毒疫苗 灭活全病毒疫苗一般是用甲醛灭活禽流感病毒鸡胚尿囊 增殖液, 辅以佐剂, 实验证明有良好的免疫保护作用。灭活全 病毒疫苗安全性好, 不会出现毒力返强和变异现象。禽流感灭 活疫苗便于储备, 一旦确定暴发的病毒亚型, 便可立即配制成 完全的油佐剂疫苗用于免疫, 还可很方便地制备针对几种不 同亚型病毒的多价疫苗, 而且亚型抗原之间不产生免疫干扰。 B rugh 等[1 ]证明 1 种灭活油苗可以至少包括 4 种A IV 亚型, 同只含单一亚型的疫苗比, 并没有减弱对同一种血凝素 (HA ) 亚型病毒攻击的有效保护。由于灭活疫苗的抗原量是由注射 剂量决定, 为此必须注射比活疫苗高出许多倍的毒量, 此外还 必须添加佐剂, 这都增加了灭活疫苗的成本。灭活疫苗免疫必 须逐个动物接种, 需大量人力, 并且在抓鸡和注苗过程中产生 应激反应, 造成禽的生产力下降。同时免疫注射过程中, 防疫 人员在禽舍之间的流动和对禽的直接接触, 容易造成疫病扩 散。灭活全病毒油佐剂苗的另一缺点是接种动物血清学检测 呈阳性, 因此不能与自然感染相区分, 影响疫病的监测。 佐剂的使用, 大大提高了A I 灭活全病毒疫苗的免疫效 果。现在使用的佐剂主要有: 矿物油、动植物油、脂质体、A vri2 dine 等。A vridine 是一种巨噬细胞激活因子, 具有诱导干扰素 生成和增强淋巴细胞毒的作用。当它和脂质体相连时作用会 更强。Fatunm bi等[2 ]将A vridine 应用于禽流感疫苗研究。他 们用H 4N 8、H 5N 2、H 7N 3 分别制成 5 种疫苗: 病毒的水溶液, A vridine 佐剂疫苗, 带正电荷的A vridine 脂质体疫苗, 将病毒 抗原共价结合到脂质体中A vridine 的表面上做成的疫苗, 一 　收稿日期: 1999- 01- 14 般的油乳剂疫苗。将这些疫苗分别免疫 4 周龄的火鸡, 并于 4 周后进行加强免疫。最后以鸡群中产生的H I抗体、局部免疫 效果、鸡群的增重、攻毒后排毒持续的天数等作为评价上述 5 种疫苗的指标。结果表明, 佐剂疫苗免疫鸡群的H I抗体比不 加佐剂的要高, 二者差异显著。5 种疫苗中带电荷的A vridine 脂质体佐剂疫苗效果最佳, 它能刺激鸡体产生良好的局部免 疫, 与其它疫苗相比增重效果最好, 攻毒 2 周后排毒减少, 这 表明A vridine 具有刺激体液和粘膜免疫的功能。美国规定用 矿物油作为佐剂的疫苗注射肉鸡, 42 天后方可出售。Fatunm 2 b i 等[3 ]曾用动植物油代替矿物油作为佐剂制成疫苗, 结果组 织反应性大为减少, 抗体滴度超过矿物油佐剂疫苗。因此, 已 经广泛用于人类消费的动植物油如花生油、豆油等可以作为 佐剂制成疫苗从而避免使用矿物油所受到的限制。 2　亚单位疫苗 亚单位疫苗是提取A IV 具有免疫原性的 HA 蛋白, 辅以 佐剂而成。这种疫苗具有很好的安全性, 也能刺激机体产生足 够的免疫力, 但持续时间短, 且制作的成本高。由于重组DNA 及分子克隆技术的发展, 可以将 HA 基因连接到载体质粒 , 然后导入表达系统中进行扩增和表达, 可以获得大量的 HA 蛋白。用这种方式生产的HA 蛋白, 不仅产量高, 而且成本低。 台湾谢快乐等[4 ]用台湾分离株H 8N 4 的外膜蛋白 (血凝素HA 和神经胺酸酶NA ) 制作了免疫复合物亚单位疫苗, 同时制作 了H 8N 4 的灭活油佐剂苗, 用血凝抑制实验作为评估 2 种疫 苗的标准, 结果表明差别不明显, 只是在加强免疫时亚单位疫 苗抗体升高比灭活油佐剂苗明显。Kodihalli 等[5 ]研制了火鸡 H 5N 2 病毒 HA 和核蛋白N P 复合亚单位疫苗免疫火鸡, 在 21 天有高的抗体滴度, 表明针对H 5N 2 亚型的 T、B 淋巴细胞 被激活, 可以对同源和异源 (H 6N 1) 亚型病毒攻击产生保护作 用。在免疫后期肺和气管内的病毒减少并被清除, 且引起 T 细胞增加和迟缓型超敏反应, 研究表明该疫苗能引起型特异 性反应, 作为火鸡疫苗有潜在应用价值。美国蛋白质科学有限 公司Bethan ie 和W ick inson 等利用杆状病毒表达系统生产 H 5、H 7 的重组HA 佐剂疫苗, 免疫 1 日龄仔鸡, 对重组佐剂疫 苗接种组攻击致死性禽流感强毒, 结果所有的鸡都不发病, 而 未免疫组攻毒后全部死亡。不加佐剂或低剂量重组HA 佐剂 疫苗起部分保护作用。实验还证明, H 5 的重组HA 佐剂疫苗 免疫的禽攻毒后泄殖腔不排毒。由于该种疫苗易于规模化生 产 , 而且经济方便。因此, 用杆状病毒生产重组HA 佐剂疫苗 来防制禽流感, 前景很是乐观。 © 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 3　重组活载体疫苗 HA 是A IV 中的保护性抗原, 它不仅诱导机体产生针对 HA 1 和HA 2 的抗体, 而且诱导CTL 反应。表达人流感病毒 H 1、H 2、或H 3 亚型HA 的重组痘苗病毒能够诱导血凝素特异 性CTL 反应[6, 7, 8, 9 ]。利用对禽类致病性很弱的痘苗病毒或禽 痘病毒作载体, 构建表达HA 的重组病毒, 用此重组病毒作为 疫苗, 它可在动物体内复制, 并不断地表达出 HA 蛋白, 从而 诱导禽人类产生针对A IV 的免疫保护力, 这是一种很有希望 的禽流感疫苗研制战略。 Barun 等[10 ]用牛痘病毒作载体构建含H 5 亚型血凝素基 因的重组病毒, 重组病毒在培养的细胞上增殖, 然后将细胞裂 解, 制成油乳剂苗。免疫鸡后, 能产生中和抗体和抵抗强毒的 攻击。 同年 T hom asm 等[11 ]将A ö T y ö Ire ö 1370 ö 83 (H 5N 6) 株的 HA 基因插入含有痘苗病毒W R 株 T K 基因的质粒 pSC11 中, 通过同源重组获得V ac- H 5 重组病毒。用此重组病毒免 疫 1 日龄和 5 日龄的仔鸡, 结果可对不同H 5 亚型的强毒株攻 击产生近 100% 的保护。Cham ber 等[12 ]也用痘苗病毒作为载 体, 构建了含有A IV A ö T y ö Ire ö 1378 ö 83 (H 5N 8) HA 基因的 重组病毒。在体外培养的动物细胞上, 该重组病毒可以表达完 整的HA 蛋白, 且HA 可以裂解成HA 1、HA 2 两部分。这表明 HA 的裂解并不依赖病毒的其它成分。HA 1、HA 2 被转运到细 胞表面, 形成融膜蛋白。用该株重组病毒翅下刺种实验鸡, 鸡 体内可产生效价很低的H I抗体和中和抗体。然而它们可以保 护免疫鸡抵抗强毒的攻击。但当法氏囊切除后, 该重组病毒不 能对免疫鸡群起保护作用。T aylo r 等[13 ]报道, 表达高致病力 A IV HA 基因的重组禽痘病毒免疫仔鸡和火鸡, 可以对致死 性同源 (H 5N 2)和异源 (H 5N 8)攻毒产生 100% 的保护。 1990 年D eok i 等[14 ]通过基因工程的方法, 获得了 2 株重 组禽痘病毒, 它们包含了细菌 B2半乳糖苷酶和H 5 亚型的HA 基因。Beard 等评估了它们对鸡的保护作用。分别用这 2 株重 组病毒V 402 ö HA 10 和V 403 ö HA 17 对鸡作翅下刺种, 对另 2 群鸡作鸡冠划种。4 周后用高致病性毒株H 5N 2 攻击, 结果表 明, 通过翅膀刺种的免疫鸡群都获得了 100% 的保护。鸡冠划 种V 402 ö HA 10 的鸡群发生了 50% 的死亡, 鸡冠划种V 403 ö HA 17 的鸡群死亡率为 70%。2 个对照组只接种禽痘病毒或 不接种任何病毒鸡群, 攻毒后死亡率分别为 90%、100%。血 清学检测表明, 在攻毒前, 接种各重组疫苗的鸡群H I 抗体效 价很低, 琼脂免疫沉淀 (A GP)抗体阴性, 攻毒后 2 种抗体滴度 都明显上升。说明该重组病毒疫苗的保护效果是比较理想的。 W ebster 等[15 ]用禽痘病毒作载体分别构建含HA 基因、N P 基 因及N P 和 HA 基因的重组病毒, 免疫结果是含 HA 基因获 得 100% 的保护; 而含N P 基因的重组病毒, 甚至在加强免疫 条件下也不能提供免疫保护; 而含N P 和 HA 基因的重组病 毒同含单个HA 基因的重组病毒相比, 免疫效果反而降低。 1995 年、1997 年W ebster[16 ]和 Sw ayne [17 ]等先后构建了 含A ö T y ö Ire ö 1378 ö 83 (H 5N 8)HA 基因的禽痘病毒重组疫苗, 用该苗免疫仔鸡, 然后用墨西哥分离的致死性强毒 H 5N 2 攻 击, 证明该苗可对H 5N 2 提供 90%～ 100% 的保护, 减少从呼 吸道和肠道的排毒, 并且有效地降低了攻毒后接触鸡之间的 传染。 总之, 禽痘病毒为活载体的重组病毒翅膀刺种免疫比鸡 冠划线免疫效果好。血清学检测表明, 该种疫苗免疫鸡群的 H I 抗体和中和抗体很低, 攻毒后 2 种抗体滴度都明显上升, 可以保护强毒的攻击。由于HA 基因在机体内随着载体的复 制而表达, 所以同灭活苗相比疫苗用量少, 又不需要添加佐 剂, 成本大大降低; 而且免疫保护持续时间长, 效果好。其最大 优点是不影响该病监测和流行病学调查。 4　核酸疫苗 核酸疫苗是近几年新兴的一种疫苗, 是将可表达保护性 免疫原基因的质粒DNA 直接导入机体细胞, 使抗原蛋白经过 内源性表达并提呈给免疫系统, 诱发机体产生特异性的免疫 作用。用于注射的质粒DNA 即核酸疫苗。含HA 基因的禽流 感核酸疫苗可对致死性A IV 的攻击产生有效的保护作用。 1993 年Rob inson 等[18 ]用禽白血病病毒长末端重复序列 (L TR ) 启动A IV HA 基因表达质粒DNA , 通过皮下、腹膜内 及静脉内三种途径导入鸡体内。首免 100Lg ö 羽, 一个月后加 强免疫 100Lg ö 羽, 2～ 3 周后用致死性强毒 CK ö V IC ö 85 (H 7N 7) 100 个 E ID 攻击, 结果在首免和加强免疫后 H I 抗体 和中和抗体都很低, 攻毒后抗体滴度明显上升, 可以 100% 保 护H 7N 7 的攻击。 1997 年哈尔滨兽医研究所陈化兰等[19 ]报道了用 SV 40 启动子构建了H 7N 1 (A ö A fri. Star ö Eng- Q ö 983 ö 79)亚型HA 基因表达质粒。分别以 100Lg ö 羽、10Lg ö 羽和 1Lg ö 羽三个剂量 肌肉注射免疫, 并用 H 7N 1 (A ö A fri. Star ö Eng- Q 983 ö 79) 做 攻毒实验。以测保护率、H I抗体和泄殖腔拭子进行病毒分离 作为评价指标。结果 100Lg ö 羽获得完全保护, 分离病毒为阴 性; 10Lg ö 羽和 1Lg ö 羽获得部分保护, 有部分分离出病毒; 抗 体情况同Rob inson 实验结果相似。美国 R. G. W ebster 等最 近用核酸疫苗免疫鸡, 防制H 5、H 7 禽流感。实验表明, 在H 5 亚型流感病毒之间,DNA 交叉保护性好, 免疫后检不出抗体, 而攻毒后出现高滴度的抗体, 表明活化的 T 细胞是DNA 介 导免疫保护的主要机制。实验证明骨骼肌注射是核酸疫苗的 最佳免疫途径[20 ], 核酸疫苗安全可靠, 不会诱发激活癌基因。 核酸疫苗同其它疫苗相比有以下优点: 第一, 核酸疫苗的抗原合成和提呈过程与病原的自然感 染相似, 抗原蛋白经内源性合成后转运到细胞表面, 通过 M HC- É 类和˚ 类分子直接递呈给免疫系统。特别是特异性 CD 8+ 细胞毒淋巴细胞 (CTL ) 的免疫反应[21, 22 ] , 这是灭活疫苗 和一般亚单位疫苗不能比拟的。 第二, 核酸疫苗突出优点是免疫原的单一性[23 ] , 只有编 码所需抗原的血凝素基因被导入细胞得到表达, 载体本身没 有抗原性。而重组病毒活载体疫苗除了目的基因表达外, 还有 庞大而复杂的免疫原蛋白。 第三,A I的核酸疫苗易于构建和制备, 稳定性好, 贮存和 运输相对方便, 抗体持续时间长且免疫效果好, 成本较低廉。 993第 5 期　　　　　　　　　　　马文军等: 禽流感疫苗　　　　　　　　　　　　　 © 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 5　小结和讨论 随着养禽业的迅猛发展, 预防禽流感尤为关键。因此研制 出高效、安全、生产工艺简单、价格低廉、适用的禽流感疫苗有 重要意义。从上文来看由于灭活全病毒疫苗的自身缺点, 尤其影响对疫病的监控, 只能用于禽流感暴发时的应急免疫, 来减少经济损失, 不能用于常规免疫。亚单位疫苗制作成本较 高, 免疫期短不能成为解决禽流感危害的理想疫苗。重组活载 体疫苗从多个角度分析较为理想, 它不但解决灭活全病毒疫 苗存在的一些问题, 而且有自己的优点, 有广阔的市场前景。 禽流感核酸疫苗有望成为人们心目中最为理想的疫苗, 因为 它具有更多的优点。 无论是灭活疫苗还是活疫苗都存在以下问题: 第一,A IV 的 15 种HA 亚型均可造成禽流感暴发。尽管 历史上造成严重损失的绝大多数都是H 5 或H 7 亚型, 但是每 一次暴发至少有 15 种可能性需考虑, 所以预防免疫包括那种 亚型抗原很难确定。 第二, 由于疫苗的使用, 新的免疫程序代替传统的封锁、 捕杀、净化、控制和扑灭禽流感。有关人士认为随着疫苗使用 而来的是没有症状的病禽或感染的禽肉将进入商业贸易, 将 对地区与地区之间和国家与国家之间禽类贸易产生反面影 响。 第三, 使用疫苗可能的潜在危险是如 H inshaw 等[24 ]实验 报道的那样有助于高致病力禽流感变异株的出现。虽然这种 现象在疫苗应用过程中尚未发生, 但作为一种不良后果应予 以重视。 防制禽流感的第一道防线仍是禽类避免暴露于病原之 下, 采取迅速而有效的隔离和控制。尽管各种疫苗在防制 禽流感中各有优缺点, 但已经证明它们能有效地阻止感染禽 流感鸟类死亡和产蛋量下降。禽流感疫苗必将对防制这种灾 难性的疾病起着重要作用。 参考文献 [ 1 ]B rugh M C: Am. J. V et. Res. , 1979, 40: 165～ 1691 [ 2 ]Fatunm bi O O , N ewm an J A , Sivanandan V et a l: A vian. Patho l, 1992, 21 (2) : 225～ 227. 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