流式细胞仪入门手册

流式细胞仪入门 -----导航篇 二 OOO年四月 目 录 前言 第 1章 综述 第 2章 液流系统 第 3章 散射光信号及荧光信号 3.1 散射光信号 3.2 荧光信号 第 4章 光电系统 4.1 光平台 4.2 光学滤片 4.3 信号探测器 4.4 阀值 第 5章 数据分析 5.1 数据采集及显示 5.2 设门 5.3 细胞亚群的数据分析 5.4 流式细胞仪其它应用的数据分析 第 6章 分选 6.1 分选 第 7章 激光器及光路校正 7.1 激光器的工作原理 7.2 光路校正 第 8章 序 论 学习仪器的最好方法是操作仪器，然而在理解原理的基础 上进行仪器操作无疑会起到事半功倍的作用。 本书介绍了流式细胞仪的基本知识，并从不同角度详尽阐 述了各种台式机（FACScanTM，FACSortTM，FACSCaliburTM，和 BD LSR）与大型机（FACS VantageTM，FACSVantageTM SE， 和 FACStarPLUSTM）之间的不同。阅读本书有助于增强读者操作仪器 的动手能力和经验。 第一章 综述 流式细胞术是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的高 技术，通常指细胞通过激光束时在液流中的特性，即粒子的大小， 密度或是内部结构，以及相对的荧光强度。通过光电系统细 胞的散射光信号和荧光信号可得知细胞特性。 流式细胞仪主要由三部分组成：流动室和液流系统；光路 系统以及电系统。其作用如下： z 液流系统：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。 z 光路系统：细胞由激光激发，通过光学滤片产生光信号，并 传送到相应的探测器。 z 电系统：把光信号转换为电信号。对于有分选装置的仪器， 电系统可初始化分选条件。 在流式细胞仪中，细胞被传送到液流中的激光照射区。任 何存在于悬液中的直径为 0.2-150 微米的粒子或细胞都适用于流 式分析。在实际工作中，用实体组织进行流式细胞分析往往是不 可能的，分析之前必须对其进行分解。被液滴包绕的粒子称为细 胞液柱，当粒子经过激光照射区时，通过激光激发产生散射光。 含有荧光的粒子就会表现出其荧光特性。散射光和荧光由光路系 统（相应的透镜，滤片和探测器）收集。分光器和滤光片引导散 射光和荧光至相应的探测器，把光信号转换为电信号。 单个粒子通过其表现出的光散射和荧光属性，通过列表模 式（List mode）完成数据采集，并对样本中的细胞亚群进行分析。 图 1-1 散射光和激发光信号转换成为计算机可处理的充电脉冲 习题：综述 1 流式细胞仪可测量细胞或粒子的哪些属性？ 2 大多数流式细胞仪使用何种光源？ 3 流式细胞仪的三大系统是什么？ 4 哪种类型的生物样本最适于做流式细胞分析？ 5 液流包绕细胞形成 ？ 6 带有荧光的细胞通过激光束时，会产生哪两种光信号？ 7 由粒子激发的光由 收集。 8 所有流式细胞测量是在单个细胞上同时进行吗？（对 错） 9 在进行流式分析之前粒子必须是单个细胞悬液吗？（对 错） 第二章 液流系统 液流系统的作用是依次传送待测样本中的细胞到激光照射 区，其理想状态是把细胞传送到激光束的中心。而且在特定时间 内，应该只有一个细胞或粒子通过激光束。 因此，必须在流动室内把细胞注入鞘液流。流动室是液流 系统的核心部件，台式机中流动室称为样品槽，大型机称之为喷 嘴。在流动室内细胞液柱聚焦于鞘液中心，细胞在此与激光相交。 流动室内充满鞘液，根据层流原理，在鞘液的约束下，细 胞排成单列出流动室喷嘴口，并被鞘液包绕形成细胞液柱。这种 同轴流动的，使得样品流和鞘液流形成的流束始终保持着一 种分层鞘流的状态，这个过程称为流体聚焦。该原理适用于所有 流动室，如图 2-1和 2-2所示： 图 2-1 细胞液柱通过样品槽产生流体聚焦 图 2-2 细胞液柱通过喷嘴产生流体聚焦 样本压力和鞘液压力是不同的，且样本压力总是大于鞘液 压力。样本压力调节器通过改变样本压力的方法控制样本流速。 z 台式机：单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出，粒 子或细胞在流动室内与激光相交（图 2-1）。除 BD LSR型台 式机有样本压力细调旋钮外，大多数台式机都采用固定的样 本压力（分低，中，高速）。 z 大型机：单个细胞悬液从喷嘴喷出后，粒子或细胞在流动室 外与激光相交（图 2-2）。且样本压力连续可调。 增加样本压力就是通过加宽液柱的方法增加样本流速。换 言之，在特定时间内，允许更多细胞通过液流。当液柱变宽时， 一些流经激光束的细胞会偏离中心，光斑也会偏离理想角度，这 在一定程度下是允许的。 z 高流速适用于定性测量，如免疫表型。样本流变宽，细胞间 距离缩短，这样在单位时间内流经激光照射区的细胞数量增 加，可以快速获取数据。 z 低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次通过，这样大多 数细胞可流经激光束的中心，细胞受激光照射的能量比较均 一，因而低流速适用于检测分辨率高的实验，如 DNA分 析。 为确保粒子和细胞完全通过激光束，正确调节样本压力对 实验操作是至关重要的。 习题：液流系统 1 流式细胞仪中液流系统的作用是什么？ 2 细胞流经激光束时影响激光照射细胞的两个因素是什么？ 3 在特定时间内，应该有多少细胞流过激光束？ 4 单个细胞悬液在 内注入 。 5 鞘液环包样品并使之居中的过程称为 效应。 6 什么调节器可以控制细胞液柱的宽窄？ 7 对于台式机，样本的固定压力是多少。 8 增加样本压力，也就是 样本流速和液柱 。 9 DNA研究对检测分辨率要求较高，推荐流速为多少。 10 加大流速会降低检测分辨率。（对 错） 11 定性检测时可使用高流速。（对 错） 第三章 散射光信号和荧光信号的检测 上一章我们了解到粒子或细胞是如何依次通过液柱的，本 节我们首先学习激光如何照射在单个细胞上的。 3.1 散射光信号 粒子折射激光产生散射光信号。散射光不依赖任何细胞样 品的制备技术（如染色），因此被称为细胞的物理特性，即细胞的 大小和内部结构。散射光与细胞膜，核膜以及细胞结构的折射性、 颗粒性密切相关，细胞形状和表面形貌也对其产生影响。 前向角散射：前向角散射（FSC）光与被测细胞的大小和面 积有关，检测的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增 管轴向方向的散射光信号（见图 3-1）。FSC不受细胞荧光染色的 影响，常用于免疫表型分析的信号处理。 侧向角散射：侧向角散射（SSC）光与被测细胞的颗粒密度 和内部结构有关，对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感（见 图 3-1）。SSC收集与激光束正交 90度方向的散射光信号。 图 3-1 细胞的光散射特性 上述两种信号都是来自于激光原光束，目前采用这两个参 数组合，可区分不同种类的细胞亚群，同时可获得细胞相关的重 要信息，下图（图 3-2）为 FSC和 SSC组成的二维散点图，从图 中可以很容易把全血样本中淋巴细胞、单核细胞及粒细胞区分开。 图 3-2 FSC、SSC二维散点图 习题：散射光信号 1 什么时候会发生光散射现象。 2 光散射信号与细胞的哪些特性有关。 3 与激光束方向相同的光散射称为 散射。 4 FSC与细胞的哪些特性相关？ 5 与激光束方向呈 90度角的光散射称为 散射。 6 SSC与细胞的 和 相关。 7 和 双参数的组合可区分不同种类的细胞亚群。 3.2 荧光信号 荧光物质吸收符合其波长范围的光能量，内部电子受激上 升到高能级。然后受激电子迅速衰落回基态，释放过剩能量成为 光子。这种能量的转换称为荧光。 能够激发荧光物质的波长范围称为激发光谱。因为更多的 能量消耗在吸收转换而不是荧光转换中，所以发射光波长要高于 激发光波长。荧光物质的发射波长范围叫做发射光谱。 目前的流式细胞仪大多采用氩离子激光器，因为 488nm 的 激光器能够激发一种以上的荧光（详见第 7章）。光源的谱线愈接 近被激发物质的激发光谱的峰值，所产生的荧光信号愈强。FITC 的激发光谱如图 3-3所示， 488nm非常接近 FITC的激发光谱的 峰值，所以 FITC被激发时会表现出最强荧光信号，而当 FITC被 其波谱范围内的其它波长激发时，也会检测到荧光，但信号强度 不会这么高。 图 3-3 FITC、PE、PerCP、APC染料的激发光谱 如果激发光波长都是 488nm，而发射光波长又不是极其接 近的话，我们可以同时检测两种以上的荧光。如 FITC和 PE双染 就符合这种条件。这两种荧光素的发射光谱如图 3-4 所示。虽然 PE的激发光谱的峰值不是 488nm，但也足以检测到荧光。更重要 的是，FITC的发射光波长是 530nm，PE的发射光波长是 570nm。 他们的发射光波长足够远，可以使用不同的检测器。被检测到的 荧光信号数量与粒子中标记上的分子数量成正比。 图 3-4 FITC、PE、PerCP、APC染料的发射光谱 图 3-5 荧光标记抗体对细胞表面抗原的特异性结合 对单克隆抗体进行荧光染色，通过分析细胞表面抗原标记 确认细胞类型（见图 3-5）。在细胞的混合群体中，我们使用不同 的荧光染料区分细胞亚群。每个亚群的染色模式与 FSC 和 SSC 数据相结合，用于识别样本中的细胞种类，并可以得到各细胞亚 群的百分含量。而且，还可以对感兴趣的细胞进行再分选。 习题：荧光信号 1 当荧光物质吸收激光能量，并释放过剩能量时，会发射 。 2 荧光物质能被激光激发出荧光的波长范围称为 。 3 由荧光染料发射的波长称为 。 4 在流式细胞仪中通常采用什么激光器。 5 能够激发 FITC和 PE的波长是多少。 6 流式细胞仪最常用的两种荧光素是 和 。 7 荧光素标记抗体用于检测 。 第四章 光学系统 光学系统由光学激发器和光学收集器组成。光学激发器包 括激光和透镜，透镜用于形成激光束，并使之聚焦。光学收集器 则由若干透镜组成，用于收集粒子发射的光束---激光束相互作 用，透镜组和滤片发送激光束至相应的光学探测器。光平台的设 计可实现以上功能。 4.1 光平台 流式细胞仪的光平台提供了一个固定平面，将激光源、光 学激发器和收集器控制在一个固定的位置。因而台式机的流动室 和光路是固定的，能够保证光斑和样本流自始至终保持恒定。图 4-1和图4-2分别为台式机 FACS Calibur 和 BD LSR 的光平台系 统。 图4-1 台式机 FACS Calibur 光平台系统 图4-2 台式机 BD LSR光平台系统 在大型机中，当液流流过喷嘴时，激光束通过消色差透镜 组以最佳角度和位置截取液流。由于光斑和液流位置会发生变化， 所以大型机的光路没有台式机稳定，需要每日优化。光路不正有 可能导致粒子受激光照射的能量不均一，从而被激发出的荧光强 度也不相同，造成测量误差。大型机的光平台系统见图4-3。 图4-3 大型机 FACS Vantage SE 光平台系统 习题：光平台 1 光平台为 的激光器提供了一个固定平面。 2 保证所有细胞受到均一的光照强度的两个必要条件是什么。 3 每次使用大型机时都需要进行光路校正（对 错）。 4 在台式机中，固定的 能够保证激光截取 的位置 是不变的。 4.2 光学滤片 当细胞或粒子流过激光照射区时，SSC 和荧光信号很弱， 需要使用光电倍增管（PMTs）收集，而 FSC 信号很强，由光电 二极管收集即可。所有信号经由透镜组和滤片组到达相应的检测 器。光电倍增管（PMTs）检测到的荧光信号常常是很微弱的。在 光电倍增管（PMTs）前设置滤片可以使相当窄的一波长范围内光 通过，提高了荧光信号的纯度和强度，因而每个检测器只有一种 指定波长的荧光信号进入而被检测，使光谱带宽接近荧光染料的 发射峰值。这种滤片称为带通（BP）滤片。如：FITC 检测器前 的滤片标志为 530/30，其含义是光谱发射波长：530±15nm，或者 说允许通过的波长范围在 515nm和 545nm之间。BP 500/50则表 示其允许通过波长范围为 475nm-525nm。 流式细胞仪中常用的滤片还有长通滤片（LP）和短通滤片 （SP），长通滤片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不 通过。如 LP500 滤片，将允许 500nm 以上的光通过，而 500nm 以下的光吸收或返回。短通滤片与长通滤片相反，特定波长以下 的光通过，特定波长以上的光吸收或返回。（见图 4-4）。 分光器的主要作用是完成光的收发。二色性反射镜就是其 中一种。560短通二色性反射镜如图 4-1所示发射 560nm或小于 560nm的波长（如图 4-1所示）。大于 560nm的波长被反射。 图 4-4 光线通过长通滤片、短通滤片及带通滤片的波长范围 习题 ：光学滤片 1 检测器前放置滤片作用是什么。 2 带通滤片 530/30发射的波长范围是 到 。 3 用于光的收发。 4 滤片允许特定波长及以下的光通过，而 滤片 允许特定波长及以上的光通过。 4.3 光电探测器 处在液流中的粒子通过激光束时产生光信号，这些光信号 通过光电探测器转换成电信号（电压），然后到相应的通道。BD 流式细胞仪有两种类型的光电探测器：光电二极管和光电倍增管 （PMTs）。光电倍增管（PMTs）对光信号比光电二极管敏感，所 以前者用于检测较弱的 SSC信号和荧光信号；后者用于检测较强 的 FSC信号。 粒子进入照射区开始散射光或荧光时产生充电脉冲，首先 光信号或光子由光电倍增管（PMTs）或光电二极管转换成相应的 电信号，产生电流，电流经由放大器，转换成充电脉冲。当粒子 位于激光束正中时，脉冲最大，荧光最强。当粒子偏离激光束时， 脉冲回到基线（如图 4-5所示）。 图 4-5 充电脉冲的产生 充电脉冲的大小取决于光电倍增管前置放大器获得的光子 数量，放大器可设置为线性放大或者对数放大（Lin或 Log）。对 数放大（Log）常常用于把阴性信号从微弱的阳性信号中分离出 来；而线性放大（Lin）通常用于放大散射光信号和荧光信号。 充电脉冲通过模数转换器把 0-1000mV 的脉冲转换成为代 表 0-1,000mV通道的数值。通道数值经由输入输出（GPIO）数据 线传送到计算机进行处理显示（见图 4-6）。 图 4-6 模拟信号到数字信号的转换过程 习题：光电探测器 1 收集 FSC光信号。 2 敏感度高的 收集 SSC光信号和荧光信号。 3 探测器产生电流，经由放大器转换成电压。（对 错） 4 模数转换器（ADC）的作用。 4.4 阀值 阀值用于设置低于该道值的信号不被处理，只有高于等于 阀值道数的信号才会被送入计算机进行处理。每次只能有一个设 阀参数。如：对免疫表型实验，阀值应设为 FSC，以消除低于阀 值道数的碎片。用户可根据实验要求设置其它参数的阀值。 第二个阀值适用于配有两个激光器的台式机。如果设置了 两个阀值，那么粒子必须同时满足两个阀值的要求才会被当作信 号细胞处理。 习题：阀值 1 FSC阀值用于消除 信号。 2 如果设置两个阀值，细胞必须符合其中一个阀值的要求才会被 当作信号细胞处理。（对 错） 第五章 数据分析 5.1 数据采集及显示 光信号转换成电压脉冲后，再通过模数转换器转换成为计 算机能够储存处理的数字信号。 流式细胞仪的数据以 FSC格式存储，该标准由“分析 细胞学协会”制定。根据 FSC标准，数据存储格式应包括三个文 件：样本获取文件，数据设置文件和数据分析结果。 4参数（FSC，SSC，FITC和 PE）的单细胞分析会生成 8 位数据。当单个样品累计收集到 10000个细胞时，FCS数据文件 为 80kB。 数据采集存储完毕后，细胞亚群可以几种不同格式显示。 单参数如 FSC或 FITC（FL1）可使用直方图，横轴表示荧光通道。 纵轴表示在该通道内收集到的细胞数量（如图 5-1）。处在同一 通道的每一细胞均符合该通道的信号值，而且具有相同的信号密 度。通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧，越靠右侧荧光亮度 越强。 图 5-1 流式数据分析图 双参数可在二维散点图中同时显示，X轴显示通道1（FL1）， Y轴显示通道 2（FL2）。3维图通过 X，Y，Z三个轴分别显示 每个通道的细胞量（如图 5-1）。 习题：数据采集及显示 1 在直方图中横轴和纵轴分别表示 。 2 二维点图用于显示 参数。 3 在 CellQuest软件中 3维图中 Z轴代表 。 5.2 设门 通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。如：血样本是 混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据 FSC或细胞大 小，在 FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞 亚群的荧光特性。 图 5-2 全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图 习题：设门 1 设门的方法通常用于分析样本内的指定细胞。（对 错） 5.3 细胞亚群的数据分析 数据分析包括从点图中的 list-mode文件中显示数据,然后统 计点图中的细胞分布情况。如前所述，分别有几种形式的点图用 于显示数据，而且可通过设门的方法区分指定的细胞亚群。 如图 5-3所示，在淋巴细胞亚群周围设门，以单独分析或分 选该亚群细胞。 图 5-3 选定淋巴细胞亚群设门 门内细胞的数据结果可在随后的图中显示。在下面的实例 中，我们将详尽阐述细胞亚群百分含量的不同分析方法。 我们可以通过单参数直方图，二维点图和三维图来分析结 果。单参数直方图可定位边界，二维点图可设置象限标志。如果 需要，还可以建立数据统计表以输出结果。 直方图可直观单个参数的细胞数量。阴性对照用于决定直 方图中单参数的左右边界（见图 5-4）。左图中M1为阴性对照峰。 右图中M2为 CD3 FITC阳性峰。 图 5-4 阴性对照峰M1（NORM001）和 CD3 FITC阳性峰M2（NORM002） 图 5-5的统计结果表明，整个事件共记录了 6000个细胞， 门内淋巴细胞 2891个。其中M1（阴性）细胞 619个，M2（CD3 阳性）细胞 2272个细胞。淋巴细胞亚群 CD3阳性百分含量的统 计结果为：M2：2272/2891=78.59%。 图 5-5 直方图统计结果 二维点图以双参数显示结果，每个点表示一个或多个细胞。 图 5-6 为阴性对照图，用于设定阴性对照边界，全图划分为四个 象限，以区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞。左下象限 （LL）为双阴性细胞，左上象限（UL）为 Y轴阳性细胞（CD19 PE），左下象限（LR）为 X轴阳性细胞（CD3 FITC），右上象限 （UR）为双阳性细胞（CD19+/CD3+）。 图 5-6 阴性对照组(NORM001)和CD3 FITC/CD19 PE双染样本(NORM002) 如图 5-7 所示，淋巴细胞亚群双阳性细胞（CD19+/CD3+） 的百分含量为：296/2839=10.43%。 图 5-7 散点图统计结果 另一个分析方法是划定区域，也就是设门。我们可以用不 同形状的绘图工具定义所选区域（如图 5-8所示）；然后统计该区 域内指定细胞亚群的百分含量。在图 5-9 中，R4 门内为 CD4 阳 性，CD3阴性的淋巴细胞亚群，其结果为：40/2866=1.40%。 图 5-8 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本分析图 图 5-9 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本数据统计结果 这种方法在分析不同的供体细胞时存在一个缺陷，因为如 果事先定义好细胞亚群的区域或边界，在随后的文件中，下一个 样本的细胞亚群位置会发生变化，这就需要操作者重新调整区域 或边界位置。 为避免这种情况的发生，我们采用一种称为集群分析 （ cluster analysis）的新方法。BD 公司的 MultiSETTM 和 AttractorsTM软件就属于集群分析软件。该软件的特点是会随着整 个细胞亚群的移动而移动，自动变换区域或边界到相应的细胞亚 群位置（见图 5-10）。 图 5-10 使用 Attractors分析软件时二维点图的前后变化对比 5.4 流式细胞仪的其它应用以及数据分析 这些分析方法通常适用于计算离散细胞群的百分含量，对 于分析单克隆细胞株分子是否呈阳性并不适用。因为单克隆细胞 株是单个细胞群，在大多数情况下，既不是 100%阴性，也不是 100%阳性，所以我们通过几何均值法和中位法统计细胞荧光密度 和阳性率。如果样本的统计结果远远大于阴性对照组，那么我们 认为其结果是阳性的，两者间的差异越大，说明细胞的表达越高， 阳性率越高。 如图 5-11所示，左图为单细胞群的散射光信号，右图为阴 性对照组和两种不同抗体染色样本的峰叠加图。每个峰的几何均 值分别为 2，5和 20（从左至右）。 图 5-11 单细胞株分析图 除检测阳性率，几何均值法和中位法还用于分子（接合子） 定量分析。QuantiCALCTM 软件就是使用中值法计算每个细胞的 抗体结合位点数。如图 5-12所示，Y轴上的圆圈代表从标准曲线 获取的信息，用于计算每个细胞的接合点位数。 图 5-12 使用 QuantiCALC软件计算每个细胞的抗体结合位点数 我们使用ModFit LTTM软件进行 DNA定量分析。因为 DNA 峰（G0/G1期，S期和 G2M期）不是离散的，所以我们对曲线以 下的面积进行积分，以得到每个细胞亚群的百分含量结果。 图 5-13 细胞周期的 DNA直方图 习题：数据分析 1二维点图和一维直方图的作用分别是什么？ 2 见图 5-4和图 5-5，CD3阴性和阳性的百分含量分别是多少。 3 LL象限代表双阳性细胞亚群。（对 错） 4 见图 5-6 和图 5-7，淋巴细胞（CD3+/CD19-）的百分含量是多 少。 5 只能使用矩形设定细胞区域范围。（对 错） 6 使用区域设定法分析样本有哪些不足。 7 避免细胞亚群移动的分析方法是什么。 8 在定量分析中我们使用哪些分析方法检测阳性率。 第六章 分 选 6.1 分选 在大多数应用中，粒子处理完毕都被送往废液缸，分选功 能的实现使我们可以获取收集感兴趣的细胞以进行再分析。除了 大型机，部分台式机也有此功能。要分选细胞，首先要识别待分 选的细胞亚群。我们需要在该亚群周围设定一逻辑门，也就是所 谓的分选门。 不同的流式细胞仪分选方法不同。比如台式机 FACSCalibur 使用机械装置捕集管分选细胞。捕集管位于流动的细胞上部，通 过出入样本流的方法收集感兴趣的细胞亚群，分选速度为每秒 300个细胞。当细胞流过激光束时，FACSCalibur电系统通过设置 好的分选门，快速确定分选目标。因为激光光路和液流速度是固 定的，细胞从光斑流向捕集管的时间也是恒定的。当到达延迟时 间时，捕集管转时样本流捕获细胞。如图 6-1 所示，左图为捕集 器位于鞘液流，右图为捕集器位于样本流，正在捕获目标细胞。 大型机 FACSVantage SE 通过振动整个液流的方法分离细 胞。由喷嘴射出的液柱沿轴线振动，断裂成距离相等的液滴。当 鞘液速率和喷嘴振动速度恒定时，液滴间的距离是固定的。 FACSVantage SE通过精确地计算液滴间的距离来实现细胞分选。 细胞的性质是在进入液滴以前已经被测定了的。如果其特 性与被选定要进行分选的细胞特性相符，则仪器在这个被选定的 细胞刚形成液滴时给整个液柱充以指定的电荷。这样，当被选定 的细胞形成液滴时就带有特定的电荷，未被选定的细胞形成的细 图 6-1 （左）捕集器位于鞘液流；（右）捕集器位于样本流 图 6-2 FACSVantage SE分选元件图 胞液滴及不包含细胞的空白液滴不被充电，也不带电荷。带有电 荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时，依所带电荷的极性向 左偏转或向右偏转，落入指定的收集器内，从而完成了细胞分选。 习题：分选 1 2 FACSVantage SE的每个分选液滴包含多少个细胞。 3 FACSCalibur用于捕获分选细胞的装置称为什么 。 4 FACSVantage SE用什么吸引或排斥注入的细胞 。 第七章 激光器及光路校正 LASER 是 light amplification by stimulated emission of radiation.的缩写。意为“受激发射的辐射光放大”。1964 年按照 我国著名科学家钱学森的建议将“光受激发射”改称“激光”。 流式细胞仪中通常使用的氩离子激光器是一种气体激光 器。这种激光器由气缸或等离子管组成，其频率稳定性高，相干 性好，寿命长。激光是这样产生的：当高压放电激发电子，电子 吸收能量跃迁到高能级，然后在短时间内释放光子，回到基态。 等离子管末端的光学系统来回反射光子。这些光子与其它受激电 子相互作用，释放出更多与其波长、相位、方向相同的光子，随 着光子数量的增加，光信号得到放大产生激光，并通过放电管尾 部的布鲁斯特窗产生偏振，以最小损耗率传送。我们在等离子管 周围加一磁场，对带电粒子起约束作用，以提高放电区中心的电 子密度和离子密度，从而提高了输出功率。 图 7-1 激光的产生原理（气体激光器） 台式机通常配有两根激光器：第一根激光器波长为 488nm （见图 7-1）。第二根为波长 635nm的红二极管固态激光器。大型 机则通过调整平面镜和调节波长棱镜来调节激光束。 7.2 激光器光路校正 激光光束在到达流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成 短轴稍大于细胞直径的光斑。这种椭圆形光斑激光能量分布属正 态分布；为保证样品中细胞是一个一个分别受到光照并且受照强 度十分一致，须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰 值处。台式机的光路调节对用户是封闭的，即安装时由工程师调 试完毕后，无需用户作任何调节，所以用户操作十分方便。大型 机使用的是可调激光器和可调光学系统，用户可以根据需要自行 调节。 习题：激光器及光路调整 1 发射波长为 488nm的激光器是 激光器。 2 激光束在聚焦后形成椭圆形光斑。（对 错） 3 台式机红色二极管激光器的波长是多少。 4 大型机可通过调节位于激光器尾端的 选择波长。 答 案 第 1章：综述 1 粒子的大小，密度或是内部结构，以及相对的荧光强度。 2 激光。 3 液流系统，光学系统以及电系统。 4 单细胞悬液。 5 细胞液柱。 6 散射光信号和荧光信号。 7 透镜。 8 对。 9 对。 第 2章：液流系统 1 使细胞液柱位于激光束的中心。 2 液流宽度和位置。 3 一个细胞。 4 鞘液；流动室。 5 流体聚焦。 6 样本压力调节器。 7 低，中，高速。 8 增加；宽度。 9 低流速。 10 对。 11 对。 第 3章：光散射信号和荧光信号 3.1 光散射信号 1 当粒子折射激光的时候。 2 散射光与细胞膜，核膜以及细胞结构。 3 前向角信号（FSC）。 4 细胞面积和大小。 5 侧向角信号（SSC）。 6 细胞颗粒度和内部结构。 7 FSC和 SSC。 3.2 荧光信号 1 光子。 2 激发谱。 3 发射谱。 4 氩离子激光器。 5 488nm。 6 FITC和 PE。 7 抗原表面标记。 第 4章：光学系统 4.1 光平台 1 光学激发器和光学收集器。 2 激光束和样本流。 3 对。 4 流动室；样本流。 4.2 光学滤片 1 限制到达探测器的波长范围。 2 515和 545。 3 分光器。 4 短通；长通。 4.3 信号探测器 1 光电二极管。 2 光电倍增管。 3 对。 4 转换充电脉冲为通道值。 4.4 阀值 1 碎片及噪声。 2 错。 第 5章：数据分析 5.1 数据的采集及显示 1 通道信号值。 2 双参数。 3 每个通道的细胞数量。 5.2 设门 1 对。 5.4 数据分析 1 散点图显示双参数；直方图显示单参数。 2 21.41%；78.59。 3 错。 4 79.57%。 5 错。 6 当读下一个散点图文件时，设定好的细胞亚群区域会发生变化。 7 集群分析。 8 几何均值法或中位法。 第 6章：分选 1 振动。 2 一个细胞。 3 捕集器。 4 偏转板。 第 7章：激光器及光路校正 1 氩。 2 对。 3 635 nm。 4 平面镜。