补肾中药对体外培养成骨细胞增殖和功能的影响

见 1。 3 　讨论 　　子宫肌瘤育龄期妇女患病率高达 20 %～25 %。 我科根据子宫肌瘤“肝郁”、“脾虚”、“血瘀”的病机特 点 ,以疏肝健脾、益气养血、化瘀散结组方制成子胞康 胶囊 ,分别于月经前和月经后服用 ,不仅能够显著缩小 或消除子宫肌瘤瘤体 ,且能明显降低患者血清雌、孕激 素水平[3 ] 。子宫肌瘤的发生主要与长期、大量的雌、孕 激素刺激有关[4 ] ,本文结果显示 :雌激素能使大鼠子宫 肌层增厚 ,肌纤维肥大 ,结构紊乱 ;而子胞康胶囊鼠子 宫肌层细长 ,排列规则 ,肌层厚度亦显著低于模型组 , 表明其可拮抗雌激素的作用 ,使子宫肌层的改变全部 或部分恢复正常。同时 ,子胞康胶囊还能明显降低大 鼠血清 E2 、P 浓度 ,以上结果提示 ,调节雌、孕激素水平 为子胞康胶囊治疗子宫肌瘤的作用机理之一。另外 , 从组织学观察中可见 ,模型组部分大鼠子宫积水、淤 血 ,子宫内膜及卵巢有较明显的化脓性感染 ,并有大小 不一的脓肿形成。而子胞康胶囊大剂量组完全无此现 象 ,小剂量组偶尔可见脓肿形成 ,提示子胞康胶囊可能 同时具有抗炎、抗菌及改善微循环作用 ,具体情况有待 我们进一步研究。 参考文献 1 　香卫红. 消瘤丸对雌性激素负荷大鼠子宫肌层影响的实验研究. 中 医杂志 ,1998 ;39 (6)∶346 2 　盛一方. 40 例子宫肌瘤外周血和卵巢血的五项激素变化. 上海医科 大学学报 ,1995 ;22 (1)∶69～71 3 　王永林 ,苏旭春. 雌激素高峰期以中医药治疗子宫肌瘤 40 例临床观 察. 湖南中医药导报 ,2000 ;6 (3)∶23～24 4 　孙梅. 子宫肌瘤的病因学研究进展. 国外医学妇产科分册 ,1997 ;24 (3)∶160～163 补肾中药对体外培养成骨细胞增殖和功能的影响 Ξ 李冬华 ,朱飞鹏1 (首都医科大学中医药学院 ,北京 　100013 ;1国家食品药品监督管理局药品审评中心 ,北京 　100038) 　　摘 　要 　目的 :观察补肾中药活性成分对体外培养成骨细胞增殖和功能的影响。方法 :体外培养成骨细胞 ,观察补肾中药含药 血清对成骨细胞增殖率和 AL P 活性的影响。结果 :补肾中药含药血清对成骨细胞增殖能力和 AL P 活性有增强作用。结论 :补肾中 药活性成分对体外培养成骨细胞的增殖和功能有促进作用。 　　关键词 　成骨细胞 ;增殖和功能 ;补肾中药 　　由肾主骨理论指导下的补肾法在骨代谢疾病的治 疗中占有重要地位。现代医学的发展使得我们得以从 细胞、分子水平揭示肾在骨代谢中的重要地位。本文 通过体外培养成骨细胞 ,观察补肾中药活性成分对成 骨细胞增殖和功能的影响 ,为补肾中药治疗骨代谢疾 病提供实验依据。 1 　和方法 1. 1 　试验药物 　补肾中药由菟丝子、何首乌等提取的 活性部位组成 ,由复旦大学药学院提供。 1. 2 　试剂和仪器 　MEM 培养基干粉 (美国 GIBCO 公司产) ;新生小牛血清 (NCS ,美国 GIBCO 公司产) ; 胶原酶 Ⅱ(Collagenase Ⅱ,Sigma 公司产) ;胰蛋白酶 (华 美生物公司) 。二氧化碳培养箱 (德国产) ,倒置相差显 微镜 (日本 Olympus 公司产) ;光学显微镜 (日本 Nikon 公司产) ;酶标仪 (美国 Bio2Tek 公司产) 。 1. 3 　方法 1. 3. 1 　大鼠成骨细胞分离培养 　出生 24h 内小鼠 10 只雌雄兼用 ,自来水冲洗后放入 75 %酒精内 5 min ,无 菌剪开头部皮肤 ,手术刀切下颅盖骨 ,清除骨表面的结 缔组织 ,PBS 反复冲洗至骨组织发白 ,用剪刀将骨组织 剪碎至 1mm ×1mm 大小的骨片 ,0. 25 %胰蛋白酶 5ml 37 ℃预消化 20min ,弃消化液 ,0. 1 % Ⅱ型胶原酶 5ml 37 ℃消化 60 min ,移取消化液 ,离心 1000rpm ×10min , 弃上清 ,加入适量培养液 ;将骨片再次用 0. 1 % Ⅱ型胶 原酶 5ml 37 ℃消化 60min ,移取消化液 ,离心 1000rpm ×10 min ,弃上清 ,加入培养液适量 ;混匀二次消化的 细胞 ,接种于 25cm2 培养瓶 (3 ×105/ 瓶) ,在 5 % CO2 、 95 %空气、37 ℃条件下培养 24h 后换液一次 ,以后每 3 天换液一次 ,细胞汇合后 ,0. 25 %胰蛋白酶消化 ,3 × 105/ 瓶分瓶接种于 25cm2 培养瓶 (第一代细胞) ,继续 培养 ,汇合后用于测定成骨细胞的增殖及功能等。 1. 3. 2 　补肾中药含药血清制备 　3 月龄雄性 SD 大鼠 30 只分为 3 组 :中药组、空白组和 CMC 对照组。中药 23 中药药理与临床 2005 ;21 (2) Ξ 北京市优秀人才培养专项经费资助 组按照体型系数公式计算给药量的 5 倍 ,给予补肾中 药活性成分 1. 5g/ kg·d (21. 4g 生药/ kg·d) 用 1 %CMC 混悬给药 ,2 次/ d ,间隔 6h ,连续 2 天 ,第 3 天给药 2h 后再次给药。对照组给予同容积的 1 %CMC。空白对 照组不处理。末次给药 1h 后采血 ,离心 3000 rmp × 20 min ,吸取上清 ,56 ℃30 min 灭活 ,微孔滤膜过滤除 菌 ,分装后220 ℃保存备用。 1. 2. 3 　增殖率测定 ( M TT 法) 　成骨细胞 2 ×103 cell/ 200μl ×孔接种于 96 孔细胞培养板 ,培养 24h 后 换含补肾中药活性成分 1. 0g ×1026浓度培养液 ,对照 组加等量 PBS ,培养 72h ,弃上清液 ,每孔加无血清 MEM 培养液 100μl、M TT 10μl , 37 ℃孵育 4h ,加入 20 %的 SDS(十二烷基硫酸钠) 150μl , 37 ℃温育 2h ,酶 标仪 570 nm 波长检测吸光度值。另取接种于 96 孔细 胞培养板培养 24h 后的成骨细胞 ,中药组用含药血清 , 对照组用空白血清 ,CMC 组用给予 1 %CMC 的血清代 替 NCS 制备 MEM 培养液 ,继续培养 72h ,M TT 法测 定成骨细胞增殖率。 1. 3. 4 　碱性磷酸酶 (AL P) 活性测定 ( PNPP 法) 　成 骨细胞 2 ×103cell/ 200μl ×孔接种于 96 孔细胞培养 板 ,培养 24h 后 ,换含补肾中药活性成分 1. 0g ×1026浓 度培养液 ,对照组加等量 PBS ,培养 72h ,弃上清液 , PBS冲洗 ,每孔加 50mM 的 DEA (二乙醇胺) 100μl , PNPP(对硝基苯磷酸盐) 50μl ,37 ℃孵育 30 min ,加入 0. 2M 的 NaOH 50μl ,酶标仪 405 nm 波长检测吸光度 值 (OD) ,样品 OD 值在 AL P 标准曲线上读取活性值 (单位 :u/ L ,PNP 浓度梯度 5、10、20、40μmol/ L 相当于 AL P 20、40、80、160u/ L ) ,判断细胞 AL P 活性。另取 接种于 96 孔细胞培养板培养 24h 后的成骨细胞 ,中药 组用含药血清 ,对照组用空白血清 , CMC 组用给予 1 %CMC 大鼠的血清代替 NCS 制备 MEM 培养液继 续培养 72h ,PNPP 法测定成骨细胞 AL P 活性。 2 　结果 2. 1 　体外培养成骨细胞鉴定 2. 1. 1 　活体观察 　倒置相差显微镜下 ,刚接种的成骨 细胞呈球形 ,悬浮于培养液中并逐渐沉降贴壁生长 , 24h 后存活细胞完全贴壁展开。展开后的成骨细胞呈 三角形、多角形或不规则形 ,有较多长短不等的突起 , 细胞核呈椭圆形 ,含 1～3 个核仁 ,胞质丰富、清晰。生 长期细胞分裂相多见 ,细胞多突起互相联结。培养 10 天左右细胞汇合 ,呈铺石状 ,并有重叠生长。 2. 1. 2 　碱性磷酸酶 (AL P) 染色 　成骨细胞 AL P 染色 后活性部位呈紫色细颗粒状 ,分布于胞浆 ,细胞核染色 阴性。 2. 1. 3 　矿化结节形成 　成骨细胞体外培养 2 周以上 , 经含抗坏血酸、β2甘油磷酸钠矿化诱导液培养 ,形成不 透光的矿化结节 ,茜素红染色呈桔红色。 2. 2 　补肾中药对成骨细胞的作用 2. 2. 1 　成骨细胞增殖能力 　中药组成骨细胞增殖率 较 CMC 组、对照组显著提高 ( P < 0. 01) ,CMC 组与对 照组增殖率无明显差别。结果见表 1。 　　表 1 　成骨细胞增殖能力测定结果 ( …x ±s ) 组别 N MTT(OD570nm) 对照组 12 0. 296 ±0. 023 CMC 组 12 0. 287 ±0. 032 中药组 12 0. 464 ±0. 033 △△3 3 　　与对照组比较 △△P < 0. 01 ;与 CMC 组比较 3 3 P < 0. 01 (下同) 2. 2. 2 　成骨细胞 AL P 活性 　中药组成骨细胞 AL P 活性较 CMC 组、对照组显著提高 ( P < 0. 01) ,CMC 组 与对照组比较无明显差别 ,结果见表 2。 　　表 2 　成骨细胞 AL P 活性测定结果 ( …x ±s ) 组别 N AL P(u/ L) 对照组 12 0. 206 ±0. 014 CMC 组 12 0. 191 ±0. 013 中药组 12 0. 228 ±0. 020 △△3 3 3 　讨论 　　中医学认为 ,肾主骨生髓 ,一旦肾气衰微 ,肾精不 足 ,则会发生骨骼疾患 ,正如《素问·痿论》中所说“骨枯 髓减 ,发为骨痿”。肾中精气宜充不宜亏 ,治疗骨质疏 松症等骨代谢疾病应以补肾益精为主 ,代表方剂如肾 气丸、左归丸、右归丸等 ,药物有仙灵脾、熟地、骨碎补、 杜仲、枸杞、补骨脂、牛膝等[1 ] 。 　　体外培养成骨细胞属于贴壁生长的纤维母细胞型 细胞 ,鉴定主要根据形态观察、成骨细胞的特异性分泌 蛋白、因子、受体等 ,及体外矿化功能特征等进行检 测[2 ] ,本实验 24h 后培养的细胞呈典型成骨细胞特点。 实验结果提示 ,应用以菟丝子、何首乌等为主的补肾中 药经植化方法提取的活性部位直接作用于体外培养的 成骨细胞 ,对成骨细胞增殖和功能显示明显促进作用 , 表现在 : (1) 成骨细胞增殖率提高 ; (2) 成骨细胞 AL P 活性增加。上述结果表明 ,补肾中药可以提高成骨细 胞的增殖率、增加 AL P 活性 ,因而促进成骨细胞骨形 成功能。 参考文献 1 　朱飞鹏 ,王洪复. 中医药防治骨质疏松症研究进展. 中国自然医学杂 志 , 2002 ;4 (2)∶94～96 2 　王洪复 ,关本博 ,林光义. 由胎鼠头盖骨培养成骨细胞的实验技术和 细胞形态观察. 上海医科大学学报 ,1991 ;18 (6)∶475～477 33中药药理与临床 2005 ;21 (2) Effect on prol iferation and f unction of osteoblast cultured in vitro with Shen2nourishing Herbs (补肾中药) Li Donghua ,Zhu Feipeng1 (Department of Traditional Chinese Medicine ,Capital University of Medical Science ,Beijing 　100013 ; 1　Center for Drug Evaluation ,Beijing 　100038) 　　Objective : The aim of the study was to invest the effect on proliferation and function of osteoblast cultured in vitro with Shen2nourish2 ing herbs active components. Methods : The response to Shen2nourishing herbs in drug serum was studied in osteoblast cultured in vitro. Os2 teoblast proliferation ratio and AL P activity were assayed. Results : It was evident the enhancement of Shen2nourishing herbs in drug serum on proliferation ability and AL P activity in osteoblast cultured in vitro. Conclusions : Shen2nourishing herbs active components had the effect on enhancing proliferation and function in osteoblast cultured in vitro. Key words 　osteoblast ;proliferation and function ;Shen2nourishing herbs(补肾中药) 消积饮对肺癌移植瘤的抑制作用及机理研究 黎 　云 ,汪 　波1 ,贾 　军 ,李伟星1 ,肖 　焕1 (广州中医药大学第二临床学院药剂科 ,广州 　510120 ; 1　中山大学附属肿瘤防治中心肿瘤内科 ,广州 　510060) 　　摘 　要 　目的 :探讨消积饮的抗肿瘤作用及其分子机制。方法 :复制小鼠 lewis 肺癌模型 ,应用细胞凋亡原位末断标记法及免疫 组织化学法检测消积饮对小鼠 Lewis 肺癌细胞凋亡及 survivin 表达的影响。结果 :消积饮和替加氟组小鼠皮下肿瘤平均重量均比生 理盐水组小 ,生理盐水组 ISEL 阳性细胞率显著高于消积饮组和替加氟组 ;消积饮组 survivin 阳性表达率显著低于生理盐水组和替 加氟组 ( P < 0. 01) ,而后两者则差异无显著性。结论 :消积饮能下调小鼠 Lewis 肺癌细胞 survivin 表达 ,诱导细胞凋亡 ,从而起到抗癌 作用。 　　关键词 　消积饮 ;肺癌 ;细胞凋亡 　　中医药在肺癌临床治疗中的意义近年来倍受关 注 ,尤其对于部分中晚期肺癌患者 (如非小细胞肺癌的 Ⅲb 期、Ⅳ期) ,中医药在提高患者生存质量、延长生存 期等方面作出了积极贡献[1 ] 。我院根据扶正培本、祛 邪解毒治法研制出的中药组方在治疗肺癌的临床实践 中取得了一定成效。本文通过复制小鼠 Lewis 肺癌模 型 ,观察中药组方的抑制作用 ,并进一步检测其对肿瘤 细胞凋亡的影响 ,以及对凋亡相关基因 survivin 的调 控作用 ,以探讨中药组方抗癌的分子机制。 1 　材料与方法 1. 1 　试验药物 　中药组方主要成分为黄芪、补骨脂、 大黄、白花蛇舌草、莪术、全蝎和蜈蚣等 ,由广州中医药 大学第二临床学院药剂科提供 ,于 4 ℃冰箱中贮存备 用 ;替加氟 ,由上海华联制药有限公司生产 ,批号 : 990304 ,规格是 100mg/ 片。 1. 2 　动物及瘤株 　C57BL/ 6 小鼠 ,体重 20 ±2g ,由中 山大学实验动中心提供 ,按清洁级标准饲养。小鼠 Lewis 肺癌 ,中国医学科学院肿瘤研究所提供。 1. 3 　试剂及仪器 　免疫组化 L SAB Kit ( K0679) 、sur2 vivin 单克隆抗体 ( M0237) 及细胞凋亡原位检测试剂 盒 (S7100)均购自丹麦 Do Ko 公司。 1. 4 　方法 　将液氮冻存的小鼠 Lewis 肺癌细胞复苏 后 ,先接种于 3 只 C57BL/ 6 小鼠右腋皮下传代 ; 2 周 后 ,处死小鼠 ,取出肿瘤组织并制成小鼠 Lewis 肺癌无 菌单细胞悬液 ,调整细胞浓度至 1 ×107 台盼蓝拒染实 验示活细胞数大于 95 %。取 30 只实验小鼠 ,将上述 细胞悬液接种于小鼠右腋皮下 (2ml/ 只) ,并将小鼠随 机分为 3 组 :中药治疗组、替加氟组和生理盐水组 ,各 组间小鼠体重差异无显著性。接种后第二天开始灌 胃 ,中药治疗组每天一次灌注 0. 4ml 稀释液 (相当于生 药量 6g/ kg) ;替加氟组每天一次灌注 0. 4ml 稀释液 (相当于替加氟药量 78mg/ kg) ;生理盐水组每天一次 灌注 0. 4ml 生理盐水。连续灌胃给药 3 周后 ,脱颈椎 处死 ,完整剥取皮下肿瘤 ,电子天平称量瘤重 ,计算抑 瘤率 (公式 :抑瘤率 = (C - T) / C ×100 % ,C、T 分别为 对照组 ,实验组的瘤重) 。用 PBS 将其漂洗干净后 ,常 规病理取材、包理、4mm 厚连续切片 ,切片室温下保存 43 中药药理与临床 2005 ;21 (2)