结核杆菌耐利福定与细菌RNA聚合酶变异关系的研究

《中国杭生素杂志》 结核杆菌耐利福定与细菌 聚合酶变异关系的研究 李显志 张欣凤 蒋天蓉 王浴生 华西 医科 大 学基础 医 学院 药理室 , 成都 摘要 选用结核杆菌 ” , 于体外诱导筛选获得耐利福定 。产 菌株 , 检 测 了利福 定抗结核杆菌活性及其与 种常用抗结核药物的交叉耐药性 , 以 ’ 一尿昔进行掺入实验 , 发 现利 福定明显抑制 一尿昔掺入敏感菌 , 而对掺入耐药菌则无抑制 提取及结核杆菌 聚合酶 , 发现敏感菌酶活性受利福定明显抑制 , 耐药菌酶活性则未见抑制 。 结果提示 结核杆菌耐利福定 与耐药菌 聚合酶 改变有关 。 关健词 利福定 , 结核杆菌 , 聚合酶 , 耐药性 利福定 , , 一 为我 国首先成功地用于临床的抗结核病和麻风病 药物 。 作为国产抗生素 , 我室曾选用普通细 菌 金色葡萄球菌和大肠杆菌 对 的抗菌 机制与耐药机制进行了研究〔‘一 〕。 本文选 用 的首要作用菌 —结核杆菌 , 在体 外诱 导筛选获得耐 厂 菌株 , 检测了 的抗结 核杆菌活性及其与临床常用抗结核药物的交 叉耐药性 , 并着重探讨了结核杆菌耐 与 细菌 聚合酶变异的关系 , 以期对 作全面评价 。 材料 与方法 药品及试剂 由四川长征制 药 厂提供 。 ” 一尿昔 ” 一 放化 纯 度 , 比度 ‘ “ , ” 一 放化纯度 , 比度 “ , 均由中国科学院上海原子核 研究 所 提 供 。 , , , 牛血清 白 蛋 白 均 为 馆 产品 。脱氧核糖核酸 小牛胸腺 为中国科学院生物物理试剂厂 出品 。 菌株 结核杆菌人型强毒 株 , , 北京生物制品 检定所提供 。 耐 菌株的筛选及 抗结核杆 菌活性及交叉耐药实验 以 菌株先后 依次在 含 、 、 、 、 、 、 “ 的改良罗 氏培养 基上传代生长 , 每 一 周传代一次 , 当形成高度耐 菌株 , 并能在含 拼 培 养基上生长良好时 保存菌 株 备 用 。 尺 抗结核杆菌活性与交叉耐药实验按常规 方法 分别在改良罗 氏培养基或 溶血半流 体 培 养基“ 〕中进行 。 对“ 一 掺入敏感与耐药结核 杆菌的影响 取改 良罗 氏培养基上 周菌龄菌 落 , 用生理盐水制成菌悬液 目 , 比浊 法 , 转种 于 培养基中摇床 恒 温 ℃ 培养 天 , 紫外分光光度计调节敏 感菌与耐药菌菌浓 度至 值 为 。 波 长 。 敏感菌与耐药菌各分为用药 组 与 对照组 , 每组取标化菌 液 , 各 加 入 或二甲基甲酞胺 对照 , 各组均 国家 自然科学基金 及华 西医科大学青年科学 毯 金 资助项 目 。 本文摘要 曾在 年 月北京第 届 东 南 亚 匀 西太平洋地 区药理 学家 会 议 上宜读 加入 , 一 川 终放射性浓度为 护 , 充分混匀后分装于试管中 , 每 管 、 ℃继续培养 , 于则定时间取样 , 各 取双管 , 加入 三氯乙酸 终 止 反 应 , 以玻纤滤膜 孔径小于 拼 负压下抽 滤集菌 , 分别用生理盐水 、 及无水 乙醇冲洗 、 固定及脱水脱色 , 烘干滤膜 , 于 型液体闪烁 计数 仪 计 数 入具有相同蛋白含量的敏感菌 或 耐 药 菌的 聚合酶提取物 。 反应 液于 ℃水浴中 孵育 分钟后 , 置冰浴 中 , 并加入 , 用微孔建膜 孔径 拼 收集 反应液 , 以 人冲洗 次后 , 烘千滤膜 , 测 定其 放 射性 。 酶活性表示 以敏感菌未用药组酶活 性为 , 比较耐药菌或用药前后酶活性改 变 。 对敏感与耐药结核杆菌 聚 合酶活性的影响 结核杆菌 聚合酶的提取 按文 献 〔 “方法略加修改进行 。 敏感与耐药结核杆 菌于 培养基中 培 养 周 , 低 温 离 心 集菌 , 以 洗涤菌 沉 淀 次 , 并以 同种缓冲液制成菌悬液 , 超 声 波粉碎仪 型 , 英国 破碎细菌 。 破 碎条件 冰浴下 , , 破碎 分钟 , 间隙 分钟 , 共破碎 分钟 。 破 碎 后 低温离心 , 分钟 , 上清 液 再次低 温离心 。。。 , 分钟 , 离心后 上清 液 存于 一 ℃冰箱中供分析 测定 聚合酶 活性用 。 对 聚合酶的影响 按文献〔” , 。, 方法略加改进进行 , 反应总体积为 , 其中含 一 , 乙酸镁 , , 二硫苏搪醇 , 牛血清 白 蛋 白 , 、 、 各 , 一 产 , 小牛胸 腺 拜 , 待 加入 厂 或二甲基 甲 酞 胺 对照 后 , 再加 结 果 耐药株筛选 、抗菌活性及交叉耐药实 验 体外诱导筛选获得了高度耐 结 核 杆菌 , 改 良罗氏培养基中 对 该 耐药株 的最低抑菌浓度 为大于 。拼 。 在改良罗 氏培养基和 溶血半流 体培 养基中对结核杆菌 的 分别为 。 召 和。 拼 。 交叉耐药实验表明耐 结核杆 菌 对 同 类 药 物 利 福 平 具有交叉耐药性 , 而对其他常用抗结 核药物如异烟阱 、链霉素 、对 氨 基水杨酸 、 乙胺丁醇 及 卡 那霉 素 无交叉耐药性 , 如 。 对敏感与耐药结核杆菌 合 成的影响 拼 能明显抑 制细 菌 生物大分子 合成的前体物 质 一 掺 入敏感结核杆菌 。 , 即明显抑制了敏 感菌的 合成 , 而在相同条件下 , ” 一 掺入耐药结核杆菌 则不 受 抑 制 。 对 聚合酶活性的影响 无 细胞状态下 , 药物可直接作用于 聚 合 。 一 , 一 仁二 拼 公 二勺 一 一 , , 一 主 一 · 攻必了 乙 哎 三 县 尹 妙 ‘ 对 名 夕 ﹃乙 ︸勺。﹂匡仍 众 ’ 心 ‘ , 刀 一 “ “ ‘ 『 一 。 二 , 滋 亡 卜 , 口 嘴 比。臼 班 呈滋 吐 , 于 七 卜 , 于 酶 。 结果发现敏感菌酶活性为 拼 明显抑制 , 抑制率大于 。同样条件下 , 耐药菌酶活性未受抑制 。 旧 岁 乡一吕。价﹄￡熟哎止 。‘ , 一 滋 , , 扰 比 件 滋 资 , , 件 皿 讨 论 利福霉素类抗生素为重要的抗结核病药 物 , 但结核杆菌易对利福霉素产生耐药性 , 其 原始敏感菌株对利福霉素 的 自然突 变率 为 一 一“ , 加之结核病的临床治疗特点 系长期用药 , 故结核杆菌的耐药性尤其值得 重视 。 尽管结核杆菌生长缓慢 , 结构特殊 , 研究难度较大 , 却更具有实际意义 。 国外学者对细菌耐 的机制进行了较 多研究 。 〔”,发现耐 的大肠 杆 菌 聚合酶发生了改变 , ‘即 报 道了耐 的枯 草杆菌 聚合酶的刀亚基在 电泳 时泳动度增快 〔‘“ 〕则发现人型结核 杆菌耐 株的 聚合酶也发生了改 变 。 我们的交叉耐药实验发现结核杆菌耐 后 对 也呈现耐药性 , 而对其他类别的抗结 核药物仍然敏感 , 这提示结核杆菌耐 可 能同 耐 一样 也与 聚合酶的变异 有 关 。进一步的掺入实验和 聚合酶分 析观 察到高浓度 卯 对 ” 一 掺 入 耐药菌无抑制作用 , 而且 对耐药结 核杆 菌中提取的 聚合酶也无抑制作用 , 从而 进一步提示 与 在耐药机制 方面 具 有共同之处 , 其原因可能是 与 具 有 共同的基本化学结构 , 仅在侧链基团上略有 不同 , 使两药的作用靶位均为 聚合酶 , 细菌耐药后 都因 聚合酶变异 , 药物与 酶不能结合 , 因而失去了抗菌作用 〔‘ , 〕。作 者 曾研究了耐 的大肠杆菌 、 变形杆 菌等 , 也发现耐药菌的 聚合酶发生了改变 待 发表资料 。此外歹 · 国外学者〔“ 〕及作者 〔‘幻对 耐 或 的结核杆菌 、 耻垢分支杆菌 、 胞内分支杆菌及大肠杆菌等的耐药机制进行 了研究 , 还发现细菌耐药性的发生与耐药菌 包膜屏障通透性降低药物透入细胞明显减少 有关 。 综上讨论说明结核杆菌耐 的机翻 包括两方面 , 即 聚 合酶 的变 异与包膜 屏障通透性的降低 。 一 参 考 文 献 〔 〕朱才荣等 《抗生素 》 , 〔幻 朱才荣等 《抗生素 》 , 〔 〕 明 伞 , 。 五 , 了 。 皿 , 住 认 , 〔 〕郑翼宗等 《中华结核和 呼 吸 系疾 病 杂志 》 , 〕 , 。 了 , , 连 〔 〕 。 〔 〕 , , 〔 〕 纽 , 。 , 〔 〕 , 碑 。 , 〔 〕 , 扭 五 , 一 〔幻 李显志等 《华西医科大学 学 报》 , 年 月 日收稿 下 一 , 一 , 一 卜 五 说 , , , 一 一 夕 “ “ 盆 一 鱿 牡 。 一 主 ‘ “ 一 王 五 且 一 · 丫 五 呈 。 】 了 , 五 , 。 “ “ ‘ 。 几 二 比 ‘ 垃传 , 岭 · ·