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小白鼠肝线粒体的超活染色与观察 一．实 验 目 的 1．观察小白鼠肝细胞内线粒体的形态和结构。 2．学习和掌握细胞的超活染色技术。 二．实 验 原 理 活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞舶死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。 根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。 活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学，，特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B（Janus green B）和中性红（neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。 线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。 詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一地堆线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原成为无色的色基（即无色状态）。 三．实 验 器 材 1．仪器：显微镜、 恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀、载玻片、凹面载玻片、表、面皿、吸管、牙签、吸水纸。  2．试剂： （1）．Ringer溶液 氯化钠                    0.85g(变温动物用0.65g) 氯化钾                    0.25g 氯化钙                    0.03g 蒸馏水                    100ml （2）.10％、1／3 000中性红溶液 称取0.5g中性红溶于50 ml Ringer液，稍加热(30~40'C)使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。 临用前，取已配制的1％中性红溶液l ml，加入29 ml Ringer溶液混匀，装入棕色瓶备用。 （3）．1％、1/5000詹纳斯绿B溶液 称取50mg詹纳斯绿B溶于5ml Ringer溶液中，稍加微热(30～40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1％原液。取1％原液l ml加入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液装入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。 3．材料 ：小白鼠肝细胞。  四．实 验 步 骤 1. 用断头法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝边缘较薄的肝组织一小块，放入表面皿内。用吸管吸取Ringer液，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。 2. 在干净的凹面载玻片的凹穴中，滴加]／5 000詹纳绿B溶液，再将肝组织块移人染液，注意不可将组织块完全淹没，要使组织块上面部分半露在染液外，这样细胞内的线粒体酶系可充分得到氧化，易被染色。当组织块边缘被染成蓝绿色即成(一般需染20~30min)。 3. 吸去染液，滴加0.5mlRinger溶液，用眼科剪将组织块着色部分剪碎，使细胞或细胞群散出。然后，用吸管吸取分离出的细胞悬液，滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片进行观察。 4. 在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜或油镜下观察，可见具有1～2个核的肝细胞质中，有许多被染成蓝绿色的线粒体，注意其形态和分布状况。 五．实验结果 1．实验图片 图二 小白鼠肝细胞线粒体超活染色局部放大图 图一 小白鼠肝细胞线粒体超活染色（10x40） 2. 实验结果 可以看见肝细胞中的线粒体呈蓝绿色（略未黄绿色），且可以看见肝细胞内线粒体数量较多，说明肝细胞代谢旺盛，能量需求大。 六．实验分析及注意事项 1. 在取肝脏时要注意大小，大概为指甲盖的1/3左右为宜，且不宜太厚，太厚，太厚里面的线粒体不易被染色，则无法观察到最后的实验现象。 2. 在染色过程中要注意不可把肝脏小块全部浸没在染色液下，这样会使肝脏小块进行有氧呼吸，则无法詹纳绿B被细胞色素氧化酶充分氧化，使实验不能成功，我们开始的制片没有观察到线粒体，就是这个原因。 3. 染色过程中要注意贴加染液，使肝脏小块充分染色，我们其中的一个制片虽然观察到了肝细胞，但未能观察到线粒体（染色很淡），原因是在我们在染色过程中一直未贴加染色液，没注意到染色液已经干了。 4．在观察肝细胞线粒体过程中，我们看到了很多小细胞，一度以为是肝细胞，实际上是红细胞，原因是我们在用断头法处死小白鼠时未将血液放干净，从而使肝细胞中残留有红细胞。但是区分红细胞、肝细胞很简单，肝细胞体积明显大于红细胞。