基因工程II-外源基因的表达(ppt62)(1)

生物技术概论基因II外源基因的达生物技术学院王萍概念基因表达：生物在代谢活动和生长发育过程中将蕴藏在DNA的遗传信息传递到RNA分子，然后再转移到蛋白质分子的过程，即基因表达。（一）外源基因在大肠杆菌中的表达（二）外源基因在酵母菌中的表达授课内容（三）外源基因在哺乳动物细胞中的表达参考1、分子克隆实验指南J．萨姆布鲁克，主编．金冬雁，黎孟枫，译．科学出版社.2、基因工程楼士林，杨盛昌，龙敏南，等，主编.科学出版社.3、基因工程原理吴耐虎，主编.科学出版社.（一）外源基因在大肠杆菌中的表达1    大肠杆菌受体细胞的特征2    外源基因高效表达的原理3    工程菌的构建策略4    遗传不稳定性及其对策（一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达表达外源基因的优势繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定全基因组测序基因克隆表达系统成熟完善被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物（一）外源基因在大肠杆菌中的表达劣势缺乏蛋白质的复性功能缺乏蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解异源蛋白胞内含多种内毒素（一）外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因高效表达的原理启动子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数（一）外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因高效表达的原理◆启动子定义：位于结构基因上游的一段与DNA依赖的RNA聚合酶相结合的DNA序列，用P代表。大小：为20－300bp。功能：转录目标基因的mRNA分类：组成型、调控型意义：在转录水平控制基因表达。启动子启动子-35区序列-10区序列 PλLTTGACAGATACT PrecATTGATATATAAT PtraATAGACATAATGT PtrpTTGACATTAACT PlacTTTACATATAAT PtacTTGACATATAAT乳糖启动子Plac的可控性：（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆终止子转录过头对外源基因表达的影响耗时耗能干扰复制，导致质粒的不稳定性不能形成理想的二级结构（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆核糖体结合位点定义：位于启动子下游，从转录起始点开始延伸几十个碱基长度的一段序列。（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆核糖体结合位点结构：SD序列（Shine-Dalgarno序列）翻译起始密码子SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成基因编码区5´端若干密码子的碱基序列（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆核糖体结合位点●SD序列（Shine-Dalgarno序列）：指位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5´UAAGGAGG3´。它通过与rRNA16S亚基3´AUUCCUCC5´端互补，并专一性结将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译。对外源基因表达的影响：（一）外源基因在大肠杆菌中的表达●SD序列与起始密码子之间的序列：◆核糖体结合位点对外源基因表达的影响：●SD序列与起始密码子之间的距离：（一）外源基因在大肠杆菌中的表达●翻译起始密码子：位于核糖体结合位点的中心位置。大肠杆菌翻译起始密码子：AUG、GUG或UUG。◆核糖体结合位点对外源基因表达的影响：（一）外源基因在大肠杆菌中的表达密码子偏爱性对外源基因表达的影响：◆密码子密码子偏爱性：外源基因全合成同步表达相关tRNA编码基因（一）外源基因在大肠杆菌中的表达包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达外源基因在大肠杆菌中的表达形式（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆包涵体型表达外源基因在大肠杆菌中的表达形式定义：大肠杆菌在表达一些异源基因时，在某些生长条件下，能将这些生物大分子致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹或无膜裸露结构，而不溶于水，这种结构称为包涵体（InclusionBodies，IB）。（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆包涵体型表达组成：外源基因表达产物、外膜蛋白、载体蛋白及少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。重组蛋白的性质：具有正确的氨基酸序列，但构象错误。（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆包涵体型表达优点：●简化表达产物的分离操作●保持表达产物的结构稳定缺点：●重组蛋白丧失了原有的生物活性（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆包涵体型表达●主要任务：拆开错配的二硫键和次级键包涵体的溶解与变性：（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆包涵体型表达●试剂和条件：溶解与变性：清洗剂SDS、正十二醇肌氨酸促溶剂盐酸胍、尿素混合溶剂极端pH（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆包涵体型表达●主要任务：通过次级键的形成使蛋白质复性将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠复性与重折叠：（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆包涵体型表达●复性：复性与重折叠：分段稀释法一步稀释法试剂添加法蛋白修饰法产物隔离法分子伴侣法（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆包涵体型表达●二硫键形成复性与重折叠：化学氧化法二硫键交换法（一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆分泌型表达外源基因的表达形式定义：外源基因的表达产物通过运输或分泌的方式穿过细胞外膜进入培养基中。（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆分泌型表达优点：●目的蛋白稳定性高●目的蛋白易于分离●目的蛋白末端完整●有利于目的蛋白形成正确的空间构象缺点：●表达量低（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆分泌型表达系统的构建：在目的基因N端加入大肠杆菌信号肽序列，转化完全分泌型受体细胞。（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆融合型表达外源基因的表达形式定义：将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因阅读框，以目的蛋白和受体菌蛋白融合形式表达目的蛋白。（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆融合型表达优点：●目的蛋白稳定性高●目的蛋白易于分离●目的蛋白表达率高●目的蛋白溶解性好缺点：●裂解和进一步分离（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆融合型表达构建原则：●高效表达●外源基因的位置●两个结构基因拼接位点处序列的设计●保持一致的翻译阅读框架（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆融合型表达受体蛋白：●谷胱甘肽转移酶（GST）●硫氧化还原蛋白（TrxA）●麦芽糖结合蛋白（MBP）●金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA）●外膜蛋白（OmpF）●泛素蛋白（Ubi）●半乳糖苷酶（LacZ）（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆融合型表达蛋白质回收：融合蛋白的位点专一性断裂方法化学断裂法单残基位点多残基位点酶促裂解法目的蛋白载体蛋白多克隆酶切位点切割位点（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆寡聚型表达外源基因的表达形式定义：将多拷贝的外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，以获得目的蛋白的高效表达。（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆寡聚型表达优点：●目的蛋白高效表达●稳定表达小分子短肽缺点：●目的产物回收困难（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆不稳定性形式基因工程菌的遗传不稳定性及其对策●结构不稳定性●分配不稳定性（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆机制基因工程菌的遗传不稳定性及其对策●限制修饰●应急反应●重组质粒的不均匀分配●受体细胞内源性的转座元件的作用（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆改进策略基因工程菌的遗传不稳定性及其对策●改进载体受体系统●施加选择压力●控制目的基因的过量表达●改进培养工艺（二）外源基因在酵母菌中的表达1、受体菌的特征2、酵母菌的宿主系统3、酵母菌的转化系统4、酵母菌的表达系统（二）外源基因在酵母菌中的表达酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，共由56个属和500多个种。酵母菌的分类学特征酵母菌是最成熟的真核生物表达系统（二）外源基因在酵母菌中的表达全基因组测序，遗传操作简便优势可分泌表达产物至培养基中翻译后加工系统大规模发酵不含有特异性的病毒、不产内毒素（二）外源基因在酵母菌中的表达提高表达产率的突变宿主菌酵母菌的宿主系统抑制超糖基化作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌（二）外源基因在酵母菌中的表达酿酒酵母（Sacchaoomycescerevisiae）已用于外源基因表达和研究的酵母菌巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）乳酸克鲁维酵母（Kluyveroyceslactis）非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharoycespombe）多态汉逊酵母（Hansenulapolymorpha）酵母菌的转化方法（二）外源基因在酵母菌中的表达原生质体转化法碱金属离子介导的完整细胞的转化法电击转化法外源基因表达的限制因素（二）外源基因在酵母菌中的表达外源基因稳态mRNA的浓度外源基因mRNA的翻译活性酵母菌对密码子的偏爱性（二）外源基因在酵母菌中的表达应用成果乙肝病毒疫苗的批量生产●酿酒酵母表达重组HBsAg●巴斯德毕赤酵母表达重组HBsAg（三）外源基因在哺乳动物细胞内的表达1、基本概念2、受体系统3、载体系统4、基因转移高等哺乳动物基因工程基因表达技术转基因技术转基因动物个体动物工程细胞哺乳动物遗传性状改良药物筛选研究评价模型人体基因治疗蛋白多肽物质大规模生产药物筛选研究评价模型高等哺乳动物细胞的生长特性（三）外源基因在哺乳动物细胞内的表达锚地依赖性血清依赖性接触抑制性形态依赖性作为受体细胞的条件（三）外源基因在哺乳动物细胞内的表达细胞系便于大规模培养遗传稳定性合适的标记生长快且齐安全性能好常用的细胞系（三）外源基因在哺乳动物细胞内的表达中国仓鼠卵巢细胞（CHO）载体系统（三）外源基因在哺乳动物细胞内的表达◆质粒型载体如pTK2◆质粒表达载体：●SV40衍生物的表达载体●牛乳头瘤病毒（BPV）衍生载体●人疱疹病毒（EBV）衍生载体 ●人腺病毒（adenovirus）衍生载体●反转录病毒（retrovirus）衍生载体转化与转染（三）外源基因在哺乳动物细胞内的表达电击转化法脂质体介导法显微注射法血影细胞介导法病毒转染法应用成果（三）外源基因在哺乳动物细胞内的表达干扰素（β、γ）凝血因子（VIII、IX）促红细胞生成素（EPO）生长因子（hGH）白介素2（IL-2）乙型肝炎表面抗原单克隆抗体CD4受体组织型纤溶酶原激活剂（tPA）复习1、外源基因在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达的优点是什么？2、什么是包涵体？以包涵体形式表达外源基因的优缺点是什么？包涵体变性、溶解和复性的主要方法是什么？复习题3、已知一条基因其5´和3´端分别含EcoRI和BamHI位点，请简述其氨苄抗性大肠杆菌表达系统构建的主要步骤。复习题4、外源基因在酵母菌中表达的优点是什么？你知道哪些重组蛋白质已在酵母中批量生产？5、高等哺乳动物基因工程的主要研究内容是什么？