蓖麻毒素的分离与提纯

蓖麻毒素的分离与提纯 近年来,从蓖麻中提取分离蓖麻毒素又是一个新的研究热点。首先,是因为蓖麻毒素有很好的药用价值,如用于医药、农药,特别是用于抗肿瘤的靶向药物。其次,在检测中制备标准样品是必备的。 郑成在“蓖麻碱的提取、纯化、改性及其杀虫活性研究”一文中也是用微波辅助的方法进行提取蓖麻碱。 赵丹在“蓖麻毒蛋白的提纯及杀虫效果研究”一文中提出用Nicolson等的方法提纯毒蛋白。称取40.0g脱壳蓖麻籽，120ml0.lmol/LpH7.2磷酸缓冲液匀浆，4?冰箱中抽提24小时，4000rm/min离心20min，小心去除表面脂肪层取上清液，上清液中加入固体(NH4)2SO4至30%饱和度，4oC冰箱过夜。4O00rm/min离心20min，取上清。上清液中加入固体(NH4)2SO4饱和度50%，4oC冰箱保存8h，4000rm/min离心20min，弃上清液。将沉淀用适量001mol/LpH.72磷酸缓冲液溶解，在001mol/LpH.72磷酸缓冲液中透析去盐。用PEG10000覆盖透析袋至于4?冰箱中过夜，浓缩得粗提取液。选用2*25cm层析柱，将Sepharose4B缓慢装入层析柱中，避免产生气泡和断层，以0.01mol/LpH7.2磷酸缓冲液平衡12h，用核酸蛋白检测仪检测28Onm波长的吸收峰。将浓缩的粗毒液缓慢加入层析柱中，动作轻柔避免破坏胶面。使蓖麻毒素充分吸附在柱上。用0.01mol/LpH7.2磷酸缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测280nm波长下吸收峰，直至吸光值下降至0.1以下。用0.01mol/LpH7.2磷酸缓冲液透析收集液除去半乳糖，EPG10000适当浓缩后，备用。用0.01mol/LpH7.2磷酸缓冲液平衡并洗脱，蛋白检测 仪检测28Omn吸光值，收集吸收峰。 高宝岩在“蓖麻毒蛋白的提取及分析”一文中也是此方法提纯收集毒蛋白的。 而他在“蓖麻碱的提取及光谱研究”一文中是用，取上面所得蓖麻饼粕干粉20g, 装入索氏提取器回流料斗, 烧瓶中加入200mL 乙醇, 水浴加热提取8-10h, 提取液采用减压低温蒸馏可回收大部分乙醇, 剩下少许样品溶液进行真空干燥4h, 干燥后所剩物质溶于20mL 热水中, 冷却后用4?乙醚进一步萃取以除去少量残余的油脂, 连续萃取3- 4 次, 所得水溶液采用低温真空干燥箱干燥, 所得产物为?。用乙腈反复洗涤?, 洗涤液合并, 真空干燥得蓖麻碱?, 进一步精制可将?溶于乙醇, 在乙醇中重结晶。 赵青余等在“蓖麻碱的分离鉴定及其含量测定方法的研究”一文中用蓖麻饼500 g, 加水2 000 mL, 加热煮沸并保持微沸, 提取3 次, 每次2 h, 合并水提液, 减压浓缩至粘稠膏状, 加入氯仿回流提取3 次, 合并氯仿提取液, 减压浓缩至干, 用乙醚冲洗多次除去油脂后, 用无水乙醇重结晶, 得无色棱柱状结晶I。此结晶就是蓖麻碱。 张海悦在“蓖麻碱的提取纯化及结构分析”一文用的方法与上述相同，就是溶剂的顺序和选择及温度有一点点区别。 王春龙在“蓖麻碱的化学提取及其在黑大豆上的应用”一文中用氯仿、乙醇、甲醇三种不同化学溶剂分别从蓖麻籽壳和干燥的子叶中提取蓖麻碱。 (1) 从蓖麻籽壳中提取蓖麻碱的化学提取方法 用氯仿作为溶剂进行提取将经过通风干燥过的蓖麻籽壳分别称取30克、40克、50克，用食品粉碎机粉碎，粉碎效果达到能够通过100目双 层筛布程度。加入乙醚和石油醚混合液(1:2)，固液比(l:4)，放入超声波仪中超声20分钟，并不断用玻璃棒搅拌，取出后静止停放，待上层混合液澄清时将其倾出。反复上述操作3次后，通过低温干燥器进行干燥，得到松散的蓖麻籽壳。配置浓度为3%0稀盐酸水溶液，将称取的蓖麻籽壳按固液比1:20分别置于所配置的稀酸溶液中进行煎煮，煎煮时间为2h、4h、6h，煎煮次数为3次。经过2h煎煮后，将上述的稀酸溶液分别收集，用中速滤纸进行过滤，然后将滤液置于分液漏斗中，倒入石油醚进一步去除油脂、蹂质等物质，滤液与石油醚混合比例为1:2，反复操作3次，去除杂质后将滤液回收，用浓氨水将溶液调为中性后，将滤液通过浓缩得到粘稠的膏状物后称取质量。然后进行第二次煎煮，煎煮时间仍为2h，收集稀酸溶液，用中速滤纸进行过滤，去除杂质，滤液浓缩后称取质量，再进行第三次煎煮，操作方法同上。煎煮时间4h、6h的方法同上。 经过上述方法即可得到蓖麻碱的粗提物，称取从蓖麻籽壳中提取的蓖麻碱粗 提物5g，经硅胶展拌后包于滤纸包内，分别放入500ml装有200ml氯仿的索式提取器内进行回流提取，回流时间设为2h、4h、6h、8h、12h，回流提取后将溶液收集，通过旋转蒸发仪回收大部分氯仿，附着在旋转瓶内的淡黄色物质为蓖麻碱生物总碱，将其转移至容量瓶中，再次通过乙醇在超声波仪中进行脱色洗涤，蒸去乙醇，既得无色针状结晶蓖麻碱生物总碱。称取其质量，进行比较。 用乙醇作为溶剂进行提取经过上述方法即可得到蓖麻碱的粗提物，称取蓖麻籽壳中提取的蓖麻碱粗提物5g，经硅胶展拌后包于滤纸包内，分别 放入50Oml装有 20Oml75%乙醇的索式提取器内进行回流提取，回流时间设为2h、4h、6h、8h、12h，回流提取后将溶液收集，通过旋转蒸发仪回收大部分乙醇，附着在旋转瓶内的褐色物质为蓖麻碱生物总碱，将其转移至容量瓶中，再次通过乙醇在超声波仪中进行脱色洗涤，蒸去乙醇，既得无色针状结晶蓖麻碱生物总碱。称取其质量，进行比较。 用甲醇作为溶剂进行提取经过上述方法即可得到蓖麻碱的粗提物，称取从蓖麻籽壳中提取的蓖麻碱粗提物5g，经硅胶展拌后包于滤纸包内，分别放入500ml装有20Oml甲醇的索式提取器内进行回流提取，回流时间设为2h、4h、6h、8h、12h，回流提取后将溶液收集，通过旋转蒸发仪回收大部分甲醇，附着在旋转瓶内的褐色物质为蓖麻碱生物总碱，将其转移至容量瓶中，再次通过乙醇在超声波仪中进行脱色洗涤，蒸去乙醇，既得无色针状结晶蓖麻碱生物总碱。称取其质量，进行比较。 在蓖麻籽壳中，其结果是蓖麻总碱的提取乙醇为提取溶剂效果最佳，其次是甲醇，再次是氯仿。蓖麻子叶中也是用上述三种方法提取蓖麻碱，其结果是从蓖麻子叶粗提物中提取蓖麻总碱以乙醇为提取溶剂效果最佳，其次是甲醇，再次是氯仿。