蒽酮硫酸法测定总糖

蒽酮硫酸法测定总糖 苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法测总糖的方法及步骤 2011-07-15 11:45:19| 分类: 默认分类|字号 订阅 植物体内的碳素营养状况以及农产品的品质性状，常以可溶性糖和淀粉的含量作为重要指标，本实验学习几种定量测定可溶性糖和淀粉的方法。 (一)苯酚法测定可溶性糖 【实验原理】 植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是:糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10,100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。 【实验仪器及试剂】 1(仪器:分光光度计、电炉、铝锅、20mL刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。 2(试剂: (1)90,苯酚溶液:称取90g苯酚(AR)，加蒸馏水10mL溶解，在室温下可保存数月。 (2)9,苯酚溶液:取3mL 90,苯酚溶液，加蒸馏水至30mL，现配现用。 (3)浓硫酸(比重1.84)。 (4)1,蔗糖液:将分析纯蔗糖在80?下烘至恒重，精确称取1.000g。加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。 (5)100ug/L蔗糖标准液:精确吸取1,蔗糖标准液1mL加入100mL容量瓶中，加水定容。 【实验步骤】 1(标准曲线的制作: 取20mL刻度试管11支，从0,10分别编号，按27,1加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入1mL 9,苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以 5,20s。加入5 mL浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8 mL，在恒温下放置30min。显色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。 2(可溶性糖的提取 取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10,0.30g，共3份，分别放入3支刻度试管中，加入5-10mL 蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min(提取2次)，提取液过滤入25mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。 3(测定吸取0.5mL样品液于试管中(重复2次)，加蒸馏水1.5mL，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算测试样品中糖含量。 式中:C一标准方程求得糖量(ug) α一吸取样品液体积(mL) V,提取液量(mL) n一稀释倍数 W一组织重量(g) (二) 蒽酮法测定可溶性糖 【实验原理】 糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。 该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等(因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应X 所以用愈酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用意酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与意酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。 糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为630nm，故在此波长下进行比色。 【实验仪器及试剂】 1(仪器:分光光度计、电炉、铝锅、20ml刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。 2(试剂: (1)蒽酮乙酸乙酯试剂:取分析纯蒽酮1g，溶于50mL乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，在黑暗中可保存数周，如有结晶析出，可微热溶解。 (2)浓硫酸(比重1.84) 【实验步骤】 1(标准曲线的制作:按方法一标准曲线的制作方法加入标准的蔗糖溶液，然后按顺序向试管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯试剂和5mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管准确保温1min取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测其光密度，以光密度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。 2(可溶性糖的提取同方法一第二步。 3(显色测定:吸取样品提取液0.5mL于20mL刻度试管中(重复2次)，加蒸馏水1.5mL，以下步骤与标准曲线测定相同，测定样品的光密度。 4(计算可溶性糖的含量，计算公式同方法一。