凝胶电泳实验报告模板

凝胶电泳实验报告模板 重庆大学研究生专业实验教学 实验课程名称: 凝胶电泳实验 实验指导教师: 学 院: 专业及类别: 生物学 学 号: 姓 名: 实验日期: 成 绩: 重庆大学研究生院制 一、实验目的 1.理解凝胶电泳的分类及琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验的基本原理。 2.熟练琼脂糖凝胶电泳实验的基本操作。 3.通过实验了解凝胶电泳实验的注意事项并在以后的实验中尽量避免。 4.利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、浓度和分子量以及分离大小不同的DNA片段。 5.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳测定DNA和蛋白分子量大小的方法。 二、实验材料、用具及试剂 1.材料:菌落PCR产物(待检测DNA片段); 2.用具:?琼脂糖凝胶电泳:电泳仪，水平板型电泳槽，电子天平，微量移液器 (10µl)，枪头，三角瓶，点样板，梳子，微波炉， 凝胶成像仪; ?聚丙烯酰胺凝胶电泳:垂直板电泳槽，稳压稳流电泳仪，梳子; 3.试剂:琼脂糖，1×TAE缓冲液，载样缓冲液(Loading buffer)，goldviwe染料， DL5,000 DNA Marker (Takara)。 三、实验原理 核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段，具有以下优点:便于分离、便于检测和便于回收。其工作原理相对而言比较简单、主要用到了物理学的电荷理论。 当一种分子被放置在电场当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极，这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率。它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。也就是说，电场强度越大、电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度也就越快，反之则较慢。由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺胶等，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系 数是分 子的大小、极性及介质粘度的函数，因此根据分子大小的不同、构成或形状的差异，以及所带的净电荷的多少，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在生理条件下 ，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基因呈离子状态从这种意义上讲 ，D N A 和RNA多核苷酸链可叫做多聚阴离子 ( Polyanions ) 。因此，当核酸分子被放置在电场中时，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖- 磷酸骨架结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型，分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA 分子迁移要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。 聚丙烯酰胺凝胶电泳，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。 3.1 凝胶电泳的分类 按照分离物质来分凝胶电泳可以分为核酸凝胶电泳和蛋白质凝胶电泳;按照分离介质来分可以分为琼脂糖凝胶电泳技术和PAGE凝胶电泳。本次实验我们采用按介质的分类方法来学习的。 3.1.1琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是:它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。 琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。 蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6-9之间，离子强度0.02-0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达107bp的DNA片段。 3.1.2聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验室中常采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)。SDS—PAGE是蛋白分析中最经常使用的一种方法。它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS)以及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部的和肽链之间的二硫键被还原，肽链被打开。打开的肽链靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。不同的大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。 SDS—PAGE可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统，其基本原理如下: 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分、pH值和凝胶孔径，而且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀。由此产生的浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。 ?浓缩效应 样品在电泳开始时，通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般能浓缩几百倍)， 然后再被分离。当通电后，在样品胶和浓缩胶中，解离度最大的Cl—有效迁移率最大，被称为快离子，解离度次之的蛋白质则尾随其后，解离度最小的甘氨酸离子(PI=6.0)泳动速度最慢，被称为慢离子。由于快离子的迅速移动，在其后边形成了低离子浓度区域，即低电导区。电导与电势梯度成反比，因而可产生较高的电势梯度。这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。因而在高电势梯度和低电势梯度之间形成一个迅速移动的界面，由于样品中蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，所以，也就聚集在这个移动的界面附近，逐渐被浓缩，在到达小孔径的分离胶时，已形成一薄层。 ?电荷效应 当各种离子进入pH8.9的小孔径分离胶后，甘氨酸离子的电泳迁移率很快超过蛋白质，高电势梯度也随之消失，在均一电势梯度和pH的分离胶中，由于各种蛋白质的等电点不同，所带电荷量不同，在电场中所受引力亦不同，经过一定时间电泳，各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。 ?分子筛效应 由于分离胶的孔径较小，分子量大小或分子形状不同的蛋白质通 过分离胶时，所受阻滞的程度不同，因而迁移率不同而被分离。此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带。 3.1.3 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (1)因不含硫酸根和羧基，几(1)PAGE具有电泳和分子筛 乎消除了琼脂的电渗。 的双重作用 (2)对蛋白质吸附极微，故无(2)PAGE是目前最常用的电 拖尾现象。 泳方法。 (3)凝胶结构均匀，孔径较大，(3)设备简单 可用于分离酶的复合物、核酸、(4)样品量小(1-100ug) 病毒等大分子物质。 (5)时间短(30-60min) (4)透明度较好，可直接或干(6)操作方便 特点 燥成薄膜后进行染色。 (7)分离范围广(多肽、蛋白、 多糖等) (5)不吸收紫外光，可直接利 用紫外吸收法做定量测定。 (8)可提高灵敏度改为超微量 -12-9(6)有热可逆性。 测定(10-10) (7)易破碎，浓度不能太低。 (9)可用于蛋白质分子量测定 (8)易被细菌污染，不易保存， 临用前配置。 (9)琼脂糖支持层上的区带易 于扩散，电泳后必须立即固定染 色。 (10)与PAGE相比，分子筛作 用小，区带少。 3.2 影响DNA迁移速率的决定因素 (1)DNA分子的大小: 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比 (2)琼脂糖浓度: 浓度越低，相同核酸分子迁移越快 1 不同类型和浓度琼脂糖分离DNA片段的范围 浓 度(%) 标 准(kb) 高强度(kb) 低熔点(kb) 0.3 1-50 0.5 0.7-25 0.8 0.5-15 0.8-10 0.8-10 1 0.25-12 0.4-8 0.4-8 1.2 0.15-6 0.3-7 0.3-7 1.5 0.08-4 0.2-4 0.2-4 2 0.1-3 0.1-3 3 0.05-1 4 6 (3)DNA的构象: 同一分子的迁移速率:超螺旋环状,线状,切口环状 (4)凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭:溴化乙锭(EB)插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加 (5)所用的电压:低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比 3.3 常见琼脂糖种类及性质 常见琼脂糖的种类有两种,分别为:标准琼脂糖和低熔点琼脂糖 表2 不同类型琼脂糖的性质 琼脂糖类型 凝结温度/? 熔化温度/ ? 标准琼脂糖 35~38 90~95 40~42 85~90 高强度琼脂糖 34~43 85~95 修饰的低熔点/ 凝25~35 63~65 不同厂家生产的不点琼脂糖 35 65 同商品其凝结温度超低熔点 8~15 40~45 和熔化温度有一定低黏性低熔点琼脂25~30 70 差异 糖 38 85 30 75 3.4 电泳缓冲液 电泳缓冲液是指在进行分子电泳时所使用的缓冲溶液，用以稳定体系酸碱度，同时电泳缓冲液的另外一个重要作用是使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移。常用的电泳缓冲液有:TAE(Tris-乙酸)缓冲液 、TBE(Tris-硼酸)缓冲液 ，两者的区别主要有以下几点: 1)TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化; 2)TBE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量; 3)双链线状DNA片段在TAE中比在TBE中迁移快10%; 4)对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE，对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。 3.5 凝胶载样缓冲液 载样缓冲液是临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液，在电泳时具有以下作用: (1)增加样品密度保证DNA沉入加样孔内; (2)使样品带有颜色便于简化上样过程; (3)其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。 表3 6×凝胶载样缓冲液 类型 6 ×缓冲液 贮存温度 0.25%溴酚蓝 I 0.25%二甲苯氰FF 4? 40% (m/V)蔗糖水溶液 0.25%溴酚蓝 II 0.25%二甲苯氰FF 室温 15% Ficoll(Type400)水溶液 0.25%溴酚蓝 III 0.25%二甲苯氰FF 4? 30%甘油水溶液 IV 0.25%溴酚蓝 4? 40% (m/V)蔗糖水溶液 3.6 核酸染料 电泳后，核酸需经染色才能显色出带型，溴化乙锭(ethidium bromide, EB)是最常用的核酸染色剂，灵敏度高，它可嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。 EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB发出的荧光强度大10倍，因此无需洗净背景即可清楚观察核酸带型。但是EB是致癌物，对人体有害，操作时应小心保护，使用EB时的注意事项主要有: (1)EB被认为是一种强致癌物质 (2)EB可用来检测单链或双链核酸 (3)EB使用时的配制、贮存及使用:EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 μg/ml (4)当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。 针对EB的强致癌性，公司开发了很多其他比较安全的核酸染料，GoodView是目前使用量较多的一款。它与DNA发生结合并产生很强的荧光信号，灵敏度与 EB 相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，而单链DNA呈现红色荧光。GoldView特别适合大片段(,1 kb)DNA的检测，灵敏度高。也可用于RNA的染色。但是在针对小片段的检测效果不如EB。 四、实验步骤 4.1 PCR产物的准备 表4 菌落PCR反应体系 PCR体系反应条件 2×Taq mix 5ul94?5min T7引物 0.25ul94?30s AD-3?引物 0.25ul57?30s30三蒸水 4.5ul72?40s 模板 菌落72?5min Total 10ul4?10min 按照表4的体系和程序进行PCR扩增，扩增的的结果用于凝胶电泳实验。 4.2凝胶电泳 4.2.1琼脂糖凝胶电泳 ?胶浓度的选取:取决于待检测DNA片段大小，如下表: 表5 凝胶浓度所对应的线性DNA长度 凝胶浓度(%)线性DNA长度(bp) 0.51000,30000 0.7800,12000 1.0500,10000 1.2400,7000 1.5200,3000 2.050,2000 本实验中，DNA片段大小包含在500-10000之间，所以选取1.0%的胶浓度。 ?琼脂糖称取 其所需取决于所用胶板大小(40ml，80ml、160ml)和浓度(常用范围 0.8%-2.0%) 凝胶浓度(%)=琼脂糖质量(g)/胶板体积(ml) 本实验中，胶板大小为40ml，凝胶浓度为1.0%，所以称取0.4g琼脂糖。 ?TAE缓冲液配制 ?50×TAE: Tris 242g Na2EDTA 37.2g 冰醋酸 57.1ml 加水定容至1L ?1×TAE:将上述液体稀释50倍。 ?凝胶的制备 ?将琼脂糖加入盛有所需体积电泳缓冲液的三角烧瓶中; ?用塞子塞住三角烧瓶颈部，在微波炉中加热至琼脂糖融化; ?取出待融化的凝胶冷却至65?左右加入核酸染料，至终浓度0.5µg/ml， 轻轻地旋转以充分混匀凝胶溶液; ?琼脂糖溶液冷却时，用一个合适的梳子插入凝胶托板，置于水平板上; ?灌入湿热的琼脂糖溶液进入模具至凝胶溶液完全凝结，拔出梳子，安放到 电泳槽内; ?添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板约1mm为止，等待加样(提前将凝胶 放入到缓冲液中，有利于凝胶中的缓冲体系和外界平衡)。 ?加样 ?用10µl微量移液器吸取3µl Loading buffer于PE手套上，再吸取5µl PCR 产物，将其与Loading buffer混匀; ?然后将上述混合液加入到凝胶板的点样孔内，加样时要注意不要弄破凝胶， 以防止样品漏出。 ?电泳 ?加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100V，样品由负极(黑色)向 正极(红色)方向移动; ?当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。 ?观察与拍照 ?254nm紫外灯下初步观察; ?凝胶成像系统详细观察、拍照。 4.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ?安装夹心式垂直板电泳槽; ?配胶; ?制备凝胶板; ?样品的处理及加样; ?电泳; ?染色与脱色; ?结果处理。 五、实验结果及分析 琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示 图1 琼脂糖凝胶电泳图 电泳结果显示:?扩增出目的条带; ?电泳条带出现拖尾现象。 结果分析如下: 从图1中可以看出，本次实验跑出了条带，但是存在很多的问题:Mark跑的效果比较差，起到的指示作用相对而言也就比较差;同时PCR产物的各条带也不亮;拖尾现象比较严重，红线框标定的条带为我们组的实验结果，结果显示有轻微的拖尾现象，并且条带不太亮。针对实验中出现的各种问题，现将原因如下: ?拖尾在目的条带的前面，原因可能是: ?样品破碎或是被降解; ?样品DNA本身不纯，存在RNA。 ?拖尾在电泳条带的后面，原因可能是: ?DNA样品浓度太高，出现非特异性扩增，这种情况可以通过稀释模板来解决; ?样品DNA本身不纯，蛋白杂质阻碍DNA的泳动。 (3)Mark跑的条带效果较差可能的原因有: ?Mark加的量较少 ?琼脂糖胶做的效果不是太好，核酸染料加的较少。 (4)PCR产物不是太亮的问题可能是: ?加样时上样较少 ?制胶时添加的核酸染料较少 六、实验小结 6.1琼脂糖凝胶电泳 ?缓冲系统: ?在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢; 高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正 确; ?长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循 环是可取的。 ?琼脂糖:不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。 ?凝胶的制备: ?凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致; ?溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块; ?倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果; ?倒胶时，胶的温度不要高于65?，温度太高会使制板变形; ?胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔。 ?加样: ?加样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多; ?加样量勿超过加样孔最大容纳量，避免因样品过多而溢出，污染邻近样品; ?加样时，注射器针头穿过缓冲液小心插人加样孔底部，但不要损坏凝胶，然后缓慢地将样品推进孔内让其集中沉于凝胶底部;?每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。 ?电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。 ?DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。 ?DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。 ?溴化乙淀(EB)是强致癌物，切勿用手接触，注意戴手套，更不要污染环境，胶勿乱扔。 ?将电泳仪的正极与电泳槽的正极相连，负极与负极相连，核酸带负电荷，从负极向正极移动。 ?紫外线照射不要太久。 6.2聚丙烯酰胺凝胶 ?安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏。 ?用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。 ?样品中应含一定浓度的蔗糖溶液，目的是用以防止样品因对流而被稀释。 ?加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。