光系统Ⅱ抑制型除草剂Atrazine诱导小麦幼苗叶绿体蛋白质组变化分析
光系统?抑制型除草剂Atrazine诱导小麦
幼苗叶绿体蛋白质组变化分析
农业环境科学学报2010,29(6):1039—1043
JournalofAgro—EnvironmentScience
光系统?抑制型除草剂Atrazine诱导小麦幼苗
叶绿体蛋白质组变化分析
王振英,李学平,李雪梅,彭永康
(天津师范大学化学与生命科学学院,天津市细胞遗传与分子调控重点实验室,天津300387)
摘要:为了研究除草剂作用机理,用光系统?抑制型除草剂阿特托津(Atrazine)处理小麦幼苗,用2-DE技术和生物质谱方法,分
析了叶绿体蛋白质组的变化.结果发现,在10mg?L浓度处理时,有7个叶绿体蛋白质斑点(斑点1,50kDa/PI8.1;斑点2,4lkDa/
PI8.4;斑点3,41kDa/PI7.6;斑点4,23kDa/PI7.1;斑点5,31kDMPI5.0;斑点6,35kDa/PI8.9;斑点7,14kDa/PI8.1)丢失.对7个发生
变化的斑点利用MALDI—MS方法,于NCBI进行数据查询,其中,有6个叶绿体蛋白质归属得到鉴别,它们是Calvin循环中,同定
CO的RuBPcase的激活酶(2个同T体和1个p型前体),在HO氧化裂解中起重要作用的23kDa氧释放蛋白(psbpprotein),在能
量转中起重要作用的3一磷酸甘油酸激酶和催化HCO;一CO水合作用可逆反应的碳酸酐酶.研究表明,叶绿体蛋白质组中丢失的
6个蛋白质是Atrazine处理的相关蛋内.
关键词:叶绿体蛋白质组;阿特拉津;MALDI—TOF—MS;光系统11;小麦
中图分类号:X503.231文献标志码:A文章编号:1672—2043(2010)06—1039—05
ChangesintheChloroplastProteomeinResponsetoPS?InhibitingHerbicideAtrazineinWheatSeedlings
WANGZhen-ying,LIXue-ping,LIXue—mei,PENGYong-kang
(TianjinKeyLabofCyto-geneticalandMolecularRegulalion,CollegeofChemistryandLifeScience,Ti
anjinNormalUniversity,Tianjin
300387,China)
Abstract:Toinvestigatethemechanismwithwhichtheherbicideworks,chloroplastproteomechanges
wereanalyzedinwheatseedlings
whichweretreatedwith0.01,0.1.l,10mg?L,Photosystem1IinhibitingherbicideAtrazinerespectively,byusing2-DEtechniques.There,
suitsindicatedthat7chloroplastproteinspotsdisappearedtreatedwithhighconcentrationAtrazine(10
mg’L-)inwheatseedlings.Theywere
spot1,50kDa/PI8.1;spot2,41kDa/PI8.4;spot3,41kDa/PI7.6;spot4,23kDa/PI7.1;spot5,31kDa/PI5.0
;spot6,35kDa/PI8.9;spot7,
14kDa/PI8.1.6proteinspots(spot1-spot6)wereidentifiedbyusingMAIDI-TOF—MSanalysisandNC
BIgreenplantsdatahase(Viridip1au,
tae1searching.Spot1-spot3wererespeetivelyidentifiedas2aetivasesubunitsofRuBPcaseandactivase
beta,formprecursor.These3pro—
teinswereassociatedwithCO2fixationinplantPS1I.Spot4wasidentifiedas23kDaoxygenevolvingpro
teinofPS?,thisproteinwas
showedtoregulatePS1IactivitybymodulatingtheCaandC1一requirementofwater-splittingreaction.Spot5was3-phosphoglyeerateki—
naseakeyenzymeinthetransferofhigh—energy.Spot6wasidentifiedascarbonicanhydrase,whichisan
importantenzymeforcatalyzing
thereversionconversionofHCO;一CO,,butspot7couldnotbeidentified,becauseitsteoretica1massandPIdidnotfitwelltheexpermental
one.Theresnltsindicatedthatthese6chloroplastproteinspots,whichweredisapperedinseedlings,were
associatedAtrazine—treatedpro—
teins.ThistechniquemayprovidebetterwaystounderstandingoftheresponsesofwheattoAtrazineatpr
oteomeleve1.
Keywords:chloroplastproteome;Atrazine;MALDI-TOF—MS;PhotosystemlI;wheat
我国是Atrazine的使用大国,至今每年仍以20%
收稿日期:2009—12一l5
基金项目:天津市科委基金项目(2006ZD08,08JCZDJC16500)
作者简介:王振英(1965,),女,博f,教授,主要研究方向为细胞与分
子生物学.E-mail:wzycell@yahoo.corn.cn
通讯联系人:彭永康E-mail:pykcell@yahoo.(~on1.cn
的需求量增加l】1.Atrazine可以在土壤中长期存在,并
在作物体内累积,造成农业环境污染,作物受害,对食
品安全造成潜在威胁,因此,引起人们的高度重视.如
对Atrazine的环境监测『2_3】,生物降解与除污I,动植
物的毒性影响f叫等.对Atrazine作用机理的研究已有
报道,Atrazine是一种光系统?(PS?)抑制性除草剂,
1040王振英等:光系统?抑制型除草剂Atrazine诱导小麦幼苗叶绿体蛋白质组变化分析2010年6月
它通过与一个位于叶绿体内的分子量为32kDa的
D1蛋白质相结合,阻止PS?中的电子传递,导致叶
绿体分子的破坏,抑制光合作用的正常进行.D1是一
种类囊体膜蛋白,是Atrazine的靶蛋白,Atrazine的除
草作用主要是破坏了D1蛋白质的功能,这是一直被
学术界接受的观点.但除D1以外,植物经Ps?抑制
型除草剂Atrazine处理后,叶绿体蛋白质组中的其他
蛋白质是否也会受到影响?这方面的研究尚未见报
道.近年来,蛋白质分析技术上的突破,特别是蛋白质
组技术的出现,在研究植物的某一个特定组织或在某
一
特殊环境因子的胁迫下植物体内蛋白质组分变化
时,可获得更大量,更全面的实验结果,目前已有很多
研究者利用蛋白质组研究技术,对植物受到盐,低温,
H0,疾病等胁迫时,体内蛋白质组的变化进行分析,
获得很多有价值的结果?oI”].小麦是我国主要粮食作
物,并且是Atrazine敏感作物,苗期除草常造成药害.
本研究中,以小麦幼苗为材料,用不同浓度PS?抑制
型除草剂Atrazine处理小麦,从叶绿体蛋白质组水平
上,对Atrazine的作用机理进行分析,以期获得一些
新的结果,为全面了解Atrazine作用机理,减少药害
提供科学依据.
1材料与方法
1.1材料与培养
栽培小麦(Triticumaestivum)农大189种子经3%
HgC1表面消毒5min,再用自来水冲洗2次,在含有
用蒸馏水湿润滤纸的培养皿中,室温下萌发24h,再
在28~C/25?(昼/夜)培养3d,每日光照12h.将3d
龄的幼苗分别放入0.O1,0.1,1和10mg?L阿特拉津
溶液中,处理5,10d.
1.2叶绿体分离和叶绿体蛋白质的制备
叶绿体的分离和叶绿体蛋白质的制备根据
Roscoe等卅的方法.将小麦幼苗叶子置于预冷分离介
质A(0.33tool?L一山梨醇,4mmol?L,MgCI2,2iHmo]?
L抗坏血酸,10mmo]?L焦磷酸钠,pH6.5)中匀浆,
4层纱布过滤,200xg4oC下离心7min,上清液放入
干净的离心管,1O00xg4oC下离心7min,沉淀物重
新悬浮于预冷分离介质B(0.33mol?L山梨醇,4
mmo]?L,MgC12,50mmo]?L,HEPES,2mmol?L,ED—
TA,pH7.6)中,1O00xg4oC下离心7min,此步骤需重
复3次.将叶绿体重新悬浮于经稀释的分离介质B
(1:25)中,8O00xg4oC立即离心5min,除去分离介
质,将叶绿体悬浮于等渗介质B和80%预冷的丙酮
中,一20?温浴1h后,35O00xg离心15min,将沉淀
物冻干,然后将干燥的沉淀物溶解在裂解缓冲液『含9
Hlmol?L脲,4%CHAPS,10mmo]?L—DTT,0.5%两性
电解质(pH3.0,10.0),1mmo|?L,PMSF,2mmo]?L
EDTA,20mmo]?L,Tris—HC1(pH8.5)1中,40O00xg离
心30rain.以BSA为标准蛋白质溶液,利用Bradford
的方法测定蛋白质浓度.
1-32-DE电泳和图谱分析
电泳第一向利用IPC胶条(pI-I3.0,10.0,11em),
在BioRad蛋白质分析系统进行2-DE分析,每根胶
条的上样量为60g.分别在250V下1h,500V下
1h,1000V下2h,2000V下2h,4000V下2h进
行等电聚焦.电泳的第二向为12.5%的聚丙烯酰胺凝
胶.2一DE提供的结果均经3次重复.凝胶用考马斯
亮蓝旧染色,凝胶通过GS800色谱扫描取得图像,用
PDQuest软件进行凝胶斑点检测,匹配和差异斑点鉴
别,确定对照和处理组之间有差异的蛋白质斑点,进
行质谱分析.
1.4凝胶消化和MALDI—TOF—MS分析
从制备胶上切下经鉴别有差异的蛋白质斑点,用
超纯水冲洗2次,50mmo]?L,NHHCO3脱色2次,
100%乙腈干燥,用0.1%TFA在50%乙腈溶液37
下消化过夜,将制备物混匀,冻干.将冻干的制备物溶
解在含有0.I%TFA和50%乙腈的5mg?mLCHCA
中,利用ABI4700型(USA)正离子生物质谱仪进行
MALDI—TOF—MS分析,质谱采用胰蛋白酶自动降解
片段作为内部标准校正.通过MASCOT软件,在
NCBInr数据库进行查询.为了表明新鉴别的蛋白质
的可靠性,查询条件为:每个被鉴定的蛋白质其序列
覆盖率至少达15%,最少肽数目为5个,肽质量数误
差范围为?0.1Da,未水解的酶切位点数为1,对照物
种为水稻和拟南芥.
2结果与分析
2.1叶绿体蛋白质组变化
利用等电点为3—10IPG胶条,分别对0.O1,0.1,
1,10mg?LAtrazine处理后小麦幼苗叶绿体蛋白质组
变化进行分析.发现在0.O1,0.1mg?L浓度下,叶绿
体蛋白质组没有产生变化,而在1mg?L浓度下虽有
变化,但不明显,只是个别叶绿体蛋白质斑点的含量
有些减少,而变化最为明显的是在10mg?L浓度下
处理的幼苗.用2DSDS—PAGE分析的结果表明,共
有350余个叶绿体蛋白质斑点被检测到.MW范围在
第29卷第6期农业环境科学学报1041
10,110kDa之间,PI范围4,10.有7个叶绿体蛋白
质产生变化,主要表现为叶绿体蛋白质斑点的消失.
图1是小麦幼苗叶绿体蛋白质组中有变化区域的凝
胶图,处理的幼苗明显可以看到叶绿体蛋白质斑点的
缺失,但没有发现新蛋白质斑点被诱导产生.
A对照B处理
一黪蓑i
A:control,B:treatment
图1小麦幼苗经10mg?LPSII抑制型除草剂处理后
叶绿体蛋白质组的变化
Figure1Changesinchloroplastproteomeinwheatseedlings
treatedwithPSIIinhibitingherbicideAtrazine(10mg?L-)
2.2与Atrazine处理相关叶绿体蛋白质的MS鉴别
在经10mg?LAtrazine处理后叶绿体蛋白质组
中,有7个斑点消失.为了对消失蛋白的生物学功能
及可能与Atrazine处理间存在的关系进行分析,我们
利用MS技术,对这7个消失的叶绿体蛋白质斑点的
归属进行了鉴别,这7个被消失的蛋白分别是:斑点
1,核酮糖一1,5一二磷酸羧化酶激活酶亚基2;斑点2,
核酮糖一1,5一二磷酸羧化酶激活酶亚基1;斑点3,核
酮糖一1,5一二磷酸羧化酶激活酶B一亚基前体;斑点
4,23kDa氧进化蛋白(psbpprotein);斑点5,三磷酸甘
油酸激酶;斑点6,碳酸酐酶;斑点7由于MS分析所
得出的匹配率偏低,未能鉴别其归属(表1o
从表1提供的数据看出,6个被鉴别出的蛋白质
斑点肽片段的匹配率高,蛋白质序列覆盖率高,得分
达100,表明该实验结果是可靠的.
3讨论
在前期研究中,我们对三氮苯类除草剂Atrazine
对水稻,白菜染色体结构和蛋白质变化作了分析比
较.水稻中得出的结果表明,在0.001mg?LAtrazine
浓度下,可引起染色体凝聚和微核的形成,而引起蛋
白质变化的浓度为0.1mg?L_I8].Atrazinc对白菜染色
体结构影响不明显,引起蛋白质变化的浓度为10
mg?L-11】.上述实验结果表明,不同作物对Atrazine的
耐药性有很大差异.
小麦是一种对Atrazine敏感的作物,很多研究表
明,在对Atrazine敏感的作物中,Atrazine可以阻断光
合作用Ps?的正常进行,引起叶绿素损伤,叶子枯
萎,作物生长受抑,最后导致死亡.在本研究中,我们
分析了Atrazine处理小麦幼苗后,叶绿体蛋白质组中
有7个蛋白质斑点消失,通过MALDI—TOF—MS分析
和数据库搜寻,它们分别为核酮糖一1,5一二磷酸羧化
酶激酶的两个亚基(ribulose—l,5一bisphosphatecar—
boxylaseactivaseisoform),核酮糖一1,5一二磷酸羧化
酶一加氧酶激酶B形式的前体(Rubiscoactivasebeta
formprecursor),23kDa的氧进化蛋白(23kDaoxygen
evolvingproteinofPS1I),3一磷酸甘油酸激酶(3-phos—
phoglyceratekinase)和叶绿体前体中的碳酸酐酶
(Carbonicanhydrase,chloroplastprecursor).
在Calvin循环中,CO:可以被酶催化转变为还原
性的化合物.核酮糖一1,5一二磷酸(简称RuBP)是COz
固定中的CO受体.核酮糖一1,5一二磷酸羧化酶(简
表110mg?L..阿特拉津处理10dNdx麦幼苗叶绿体蛋白质差异蛋白质的质谱鉴定
Table1Identificationof2-DseparatedproteinspotsfromwheatchloroplastfollowingtreatmentwithAtr
azine(10mg.L)f0r10days
,
1042王振英等:光系统?抑制型除草剂Atrazine诱导小麦幼苗叶绿体蛋白质组变化分析
2010年6月
称为Rubisco)可以催化CO与RuBP加成.Rubisco
存在于叶绿体的基质中,它是一个很丰富的酶,约占
总叶绿体蛋白质的50%.在高等植物中它是一个杂
多聚体,分子量为540kDa,由8个相同的大亚基和8
个小亚基组成.大亚基是酶的催化单位,它能结合底
物(CO和RuBP)以及Mgn;小亚基是调节酶活性的
单位,能使催化速度常数增加100倍以上.Rubisco的
大亚基是由叶绿体DNA的一个基因编码的,而小亚
基是由核DNA的一个多基因家族编码的.Rubisco以
3种形式存在:一是无活性形式,称E型;二是氨甲酰
化的无活性形式,称EC型;三是活性形式,氨甲酰化
并在活性部位有Mg,称ECM型.底物RuBP与E型
Rubisco的结合比与ECM型的结合更牢固,因此
RuBP是Rubisco活性的强抑制剂.从Rubisco的活性
部位除去RuBP是由Rubisco激活酶介导的,Rubisco
激活酶是一个调节蛋白,它能与E型Rubisco结合,
在消耗ATP的反应中促进RuBP的释放.然后,游离
的Rubisco经氨甲酰化和Mg的结合变成活性形式.
小麦在经过阿特拉津处理后,有两个Rubisco激酶的
亚基和一个Rubisco的前体与对照相比消失了,这会
造成Rubisco的活性受到抑制,从而使CO:和RuBP
的合成反应速率减慢或受到抑制,影响了小麦Calvin
循环中有机化合物的合成.
在光合作用研究中,光合放氧一直是一个最基
础,最焦点的课题,它是一个光合生物将低氧化性的
水转变为高氧化性的氧气的过程,放氧是发生在PS
?中的一个重要化学反应.在PS?中,一个完整的具
有光合放氧功能的放氧颗粒包括D1,D2,Cytb559,
CP43,CP47,33kDa,23kDa,17kDa等20多种蛋白
质.33kDa,23kDa,17kDa是突出于基粒片层膜外的
3个水溶性外周蛋白,它们结合于类囊体囊腔侧,对
维持锰簇的稳定及正常的放氧功能起很重要的作用.
由于位置上突出的特殊性,它们成为光合结构中对理
化处理特别敏感的部位,也容易受环境胁迫的影响.
现在已经知道,阿特拉津的作用机理是取代质体醌与
叶绿体类囊体膜上的32kDa蛋白结合,从而阻断光
系统?的电子传递而使光合作用受阻.在本研究中,
我们没有检测到32kDa蛋白的变化,而是发现23
kDa的蛋白质消失了.17kDa和23kDa蛋白的去除
也会引起放氧功能的部分消失,这主要是因为它们的
脱落会引起ca和Cl一的游离,研究发现缺失23kDa
蛋白会使Cl-X~锰簇的亲和力减小而对光抑制非常敏
感.由此可见,阿特拉津对小麦的处理对光合放氧也
产生了一些影响.这一结果与已有研究一致.
Calvin循环中,在Rubisco羧化酶作用下CO和
RuBP缩合生成不稳定的中间物,然后裂解成2分子
3一磷酸甘油酸,基质的3一磷酸甘油酸激酶催化磷酸
基从ATP转移到3一磷酸甘油酸,生成1,3一二磷酸甘
油酸.在甘油醛一3一磷酸脱氢酶催化的反应中
NADPH提供电子,生成甘油醛一3一磷酸.丙糖磷酸异
构酶催化甘油醛一3一磷酸与二羟丙酮磷酸互变.丙糖
磷酸在叶绿体中可以转化为淀粉或立即外运到细胞
质转变为蔗糖以便运送到植物的生长区域,为生长提
供能量.3一磷酸甘油酸激酶的消失使磷酸基不能转
移,从而也抑制了淀粉或蔗糖等碳水化合物的合成.
碳酸酐酶是锌金属酶,它可以催化CO水合作用
的可逆反应.在植物叶绿体中,碳酸酐酶对无机碳的
固定起着非常重要的作用.阿特拉津对小麦的处理
影响CO:的固定.
由以上结果可以看出,小麦在10mg?LAtrazine
处理10d后,叶绿体蛋白质组中涉及到光合作用的
多个蛋白质组分消失,可以认为这些蛋白质的消失,
影响了植物正常的光合作用,使植物生长受抑.
虽然以前的研究表明[21-23】,Atrazine是Ps?抑制
型除草剂,它主要抑制叶绿体蛋白质组中的D1蛋白
质,而阻断PS?的正常进行,Dl是唯一的Atrazine结
合蛋白.我们的研究则表明,Atrazine处理小麦幼苗
后,有7个叶绿体蛋白质消失,表明这7个蛋白质是
与Atrazine的处理相关的,虽然其确切的作用机理有
待进一步研究,但本项研究加强了对Atrazine作用机
理的了解,为减少Atrazine对作物的伤害和农业上安
全,合理使用除草剂提供了参考依据.
4结论
用10mg?LAtrazine浓度处理小麦幼苗后,有7
个叶绿体蛋白质斑点(斑点1,50kDa/PI8.1;斑点
2,41kDa/PI8.4;斑点3,41kDa/PI7.6;斑点4,23kDa/
PI7.1;斑点5,31kDa/PI5.0;斑点6,35kDa/PI8.9;斑
点7,14kDa/PI8.1)丢失.它们是calvin循环中,固定
CO:的RuBPease的激活酶(2个同工体和1个B型
前体),在H:O氧化裂解中起重要作用的23kDa氧释
放蛋白(psbpprotein),在能量转贮中起重要作用的
3一磷酸甘油酸激酶和催化HCO3一CO水合作用可逆
反应的碳酸酐酶.6个叶绿体蛋白质是阿特拉津处理
的相关蛋白,蛋白质组分析技术可用于Atrazine作用
分子机理研究.
第29卷第6期农业环境科学学报1043
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