小鼠肠系膜苏丹三染色

【实验目的】 （1）熟悉小鼠结构，了解小鼠肠系膜的剪取方法。 （2）熟悉并掌握苏丹三染色的原理及操作。 【实验原理】 脂肪是体内储存能量和供给能量的重要物质，根据其性质可以分为中性脂肪、脂肪酸、胆固醇、鞘磷脂等。很多细胞都含有脂肪，游离状态的脂肪呈小滴状悬浮于细胞质内，比较显著的如肝细胞。脂肪小滴可以集合，将细胞质及细胞核挤到一旁，如脂肪细胞。如果组织中脂肪过多，将会影响其正常功能。如脂肪肝。 脂肪不溶于水，易溶于浓乙醇、苯、氯仿和乙醚等，因此制作脂类标本一般不用石蜡切片，而用冰冻切片或者铺片法以保存脂类，固定多用甲醛类固定液。其染色方法有脂溶性染料显示法、化学显示法和特异染色法等。 脂溶性染料显示法利用苏丹染料中的苏丹III、苏丹IV或者苏丹黑等溶于脂类，而使脂类显色的原理显示脂类，使用时，要注意选择溶剂，要求既要溶解苏丹染料，又不溶掉脂肪。 苏丹染料是偶氮染料，它对脂类的显示是一种简单的物理变化。 苏丹染料是一种脂溶性染料，易溶于乙醇但更易溶于脂肪，所以当含有脂肪的标本与苏丹染料接触时，苏丹染料即脱离乙醇而溶于该含脂肪结构中而使其显色。 脂肪染料一般选用有机溶剂做溶剂，丙酮和乙醇对染料和脂肪都是很好的溶剂，这样可以染色大的脂肪积累块，但是小的脂肪滴会溶解。60%异丙醇当溶剂，可以减轻脂类的溶解。丙二醇或磷酸三乙酯不会溶解脂类物质，但是能溶解染料，是比较理想的溶剂。用这些溶剂配的染料溶液要过滤以去掉沉淀，防止蒸发，因蒸发会引起染料在材料中积累。常用相同溶剂洗掉多余的染料，然后再用水洗，可以防止多余的染料在材料中沉淀。 肠系膜是腹膜的双层膜，它在腹部的后壁连接着空肠和回肠，也就是说，它一般连接着多种腹腔的组成部分。 在本实验中，主要通过小鼠的肠系膜染色观察脂肪细胞，用断头法直接将小鼠杀死，分离小鼠的的腹腔处的肠系膜，经染色后，在显微镜下观察。 【实验材料】 器材： 镊子两把  显微镜  托盘一个  剪刀一把  滴管一支  小鼠一只 盖玻片载玻片各两片 试剂： 苏丹三染液  蒸馏水 70%乙醇  甲醛钙溶液 【实验步骤】 1、 检查实验所许多的试剂以及仪器是否齐全，准备实验； 2、 杀死小鼠： 1） 取一只小鼠置于解剖盘中，抓住小鼠的尾巴，确保小鼠的前爪在解剖盘中，慢慢的使小鼠安静下来； 2） 用剪刀紧紧的按住小鼠的颈的后部，使劲的向后拉小鼠的尾巴； 3） 按住剪刀几分钟，确保小鼠已经死亡； 3、 将小鼠的脸部朝上，用蒸馏水将小鼠的腹部湿润，用剪刀轻轻拉起小鼠的外皮，用剪刀在水平位置剪开一个小伤口，再用手扯开外皮，使肌肉层暴露，然后用剪刀轻轻的剪一个V字型的伤口，暴露腹腔； 4、 用剪刀轻轻的拉起小鼠的小肠，我们可以看到几乎透明的肠系膜，将肠系膜轻轻的展开，将一块5mm长宽的小的盖玻片粘附在接近血管处的肠系膜上； 5、 用剪刀轻轻的将盖玻片上的肠系膜剪断，小心操作，以免损坏肠系膜； 6、 将粘附有肠系膜的盖玻片放在载玻片上，用蒸馏水先进行润湿，吸干之后，再用甲醛钙固定20min，固定之后对细胞染色效果更好; 7、 用蒸馏水冲洗在盖玻片和载玻片之间的肠系膜，在载玻片的一端滴一滴蒸馏水，在另一端用吸水纸吸收蒸馏水； 8、 用同样的方法再用70%的乙醇冲洗； 9、 用少量的苏丹Ⅲ染液染色30min，染色后可以看到肠系膜上明显的变黄色; 10、用吸水纸吸干多于的染液，用蒸馏水清洗干净载玻片的底面和边缘，以及盖玻片的表面，之后在显微镜下观察； 【实验结果】 镜检照片 脂肪细胞 血管 图 1  低倍镜下脂肪染色（10×10） 脂肪细胞 血管 图 2  高倍镜下脂肪染色（10×40） 图 3  脂肪染色局部放大截图 【结果分析】 以上三幅图可看出观察到的脂肪细胞呈圆球形，内充满橘色脂类物质，并可以观察到小鼠肠系膜上脂肪细胞附着的血管。 但从图中也可看出，脂肪细胞多层叠在一起，且染色并不充分，细胞没有呈现出明显的桔红色，而是一种呈一种偏淡黄的颜色。造成这种现象可能的原因为：铺片时，没有将肠系膜铺的足够充分，导致脂肪细胞重叠，影响观察，进而影响了染色，因为细胞层数多，染液很难进入到细胞中，30min后，细胞依然没有呈现出桔红色。 在铺片时应掌握好力度，若用力过大，则肠系膜容易被撕破，铺片不成功；若用力过小，则细胞不能被铺呈单层，影响染色及观察。 【实验注意事项】 1.在抓握小鼠时，应迅速掐住其两耳之间的皮肤，使其头部不可扭动，并用同一只手掐住其背部至尾巴的皮肤，使小鼠整个腹部皮肤紧绷，不能反击。 2.铺片时尽量使细胞铺成单层，且要使小肠包围盖玻片大半部分，以防止肠系膜收缩，使细胞叠成多层。 3.找肠系膜时应尽量小心，以免将肠系膜扯破，且要找有血管的肠系膜，因为血管周围一般有脂肪组织保护，制作装片时应尽量用盖玻片铺开肠系膜。 ⒋染料溶液脂类而使其着色，使用时应注意选择溶剂，要求既要溶解染料，又不溶解脂肪。