糖化酶的研究进展

糖化酶的研究进展 摘要:糖化酶是世界上生产量最大应用范围最广的酶类,介绍了糖化酶的结构组成、特性、生产、提取、活力检测以及提高酶活力的研究。 ; 活力 关键词: 糖化酶; 特性 一、糖化酶的简介 糖化酶是应用历史悠久的酶类，1 500年前，我国已用糖化曲酿酒。本世纪2O年代，法国人卡尔美脱才在越南研究我国小曲，并用于酒精生产。50年代投入工业化生产后，到现在除酒精行业，糖化酶已广泛应用于酿酒、葡萄糖、果葡糖浆、抗菌素、乳酸、有机酸、味精、棉纺厂等各方面，是世界上生产量最大应用范围最广的酶类。 糖化酶是葡萄糖淀粉酶的简称[Glucoamylase,(EC.3.2.1.3.)](缩写GA或G), 糖化酶是一种习惯上的名称,学名为α-1,4-葡萄糖水解酶 (α-1,4-Glucanglucohydrolace). 糖化酶是由曲霉优良菌种(Aspergilusniger)经深层发酵提炼而成。( 深层发酵是利用深层培养基的厌氧环境来培养厌氧细菌，但不能培养严格厌氧细菌,多用于兼性厌氧菌和微耗氧菌的培养) 重要糖化酶生产菌有:雪白根霉，德氏根霉，河内根霉，爪哇根霉，台湾根霉，臭曲霉，黑曲霉等。 糖化酶是具有外切酶活性的胞外酶。其主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解a一1，4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，并像B一淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成B—D一葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a一1，6糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a一1，3连接的碳链，但水解a一1(4糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。 二、糖化酶的结构组成及分类 糖化酶在微生物中的分布很广，在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中获得，从细菌中也分离到热稳定的糖化酶，人的唾液、动物的胰腺中也含有糖化酶。不同来源的淀粉糖化酶其结构和功能有一定的差异，对生淀粉的水解作用的活力也不同，真菌产生的葡萄糖淀粉酶对生淀粉具有较好的分解作用。 糖化酶是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白，分子量在60 000 到1 000 000间，通常碳水化合物占4, 18,。但糖化酵母产生的糖化酶碳水化合物高达80,，这些碳水化合物主要是半乳糖、葡萄糖、葡萄糖胺和甘露糖。。Hyun HH 等报道 A.saitoi 糖化酶 GAM1 中糖蛋白包含 18 %中性糖和 其分子量达 90 000, N端氨基酸都是同一氨基酸-丙氨酸。 0.77 %的葡萄糖胺, 通过对葡萄糖淀粉酶分离纯化的研究, 研究人员将其分为 3 类 GI、 G?、G?或 GAI、 GAI′ 、 GA?, 其中GAI′ 、 GA?(GI、 G?)对糊化的淀粉进行作用但不能水解生淀粉或作用能力非常弱, GAI ( G?) 对生淀粉发生作用。还发现 GAI′ 、 GA?可以通过枯草杆菌蛋白酶对GAI 作用得到。以来自Asper gillus awamori var.Kawachi葡萄糖淀粉酶为例, 它们的分子量分别为 GAI MW 90 000、 GAI′ MW73 000、 GA? MW57 000。 葡萄糖淀粉酶 GAI 之所以具有对生淀粉水解作用是由于其除了具有包含了催化位的 GAI′ 外还具有与生淀粉相结合的亲合位点 Cp 区域和 GP- l(MWl3 200) , 虽然亲合位点 Cp 与 GP- 1 的复合体对生淀粉具有吸附能力, 但对生淀粉和糊化的淀粉不具有催化能力。 Shinsaku HAYASHIDA 等 通 过 对 A.awamori vaKawachi、 A.awmori、A. iger 葡萄糖淀粉酶的 GP- I 肽链序列的比较发现它们有很大相似性, 可以推测不同来源的葡萄糖淀粉酶 GAI 有十分相似的亲合生淀粉的位点。 碳水化合物对亲合位点的吸附性能起重要作用GP- I 区域中 Thr 和 Ser 的含量比较高, 该区域主要是通过 Thr 和 Ser 的残基与寡聚甘露糖类经糖苷键连接组成, 如果将寡聚甘露糖用葡萄糖取代, 则酶对生淀粉的水解作用大大降低。根据Shen dy等研究人员的报道, 这种糖链与葡萄糖淀粉酶的耐热性有关, 此Williamson 等人认为 GP- I 区域是酶的催化位点与亲合位点连接的一段肽链骨架。 目前, 普遍认为糖化酶的多型性可能由下述 3 个原因引起: 一是基因调控、 转录的方式不同; 二是蛋白质合成的修饰作用不同, 即结合的糖量不同; 三是在发酵过程中受到自身蛋白水解酶和糖苷酶的作用, 由糖化酶的原始形式衍变成糖化酶的。此外培养基的成分和生长条件也对糖化酶组分多型性有影响。 三、糖化酶的特性 1、糖化酶的热稳定性 有关糖化酶的热稳定性报道很多。 目前, 主要集中在糖化酶的热稳定性机理及筛选热稳定性糖化酶菌株上。 工业上应用的糖化酶都是利用它的热稳定性。 一般真菌产生的糖化酶热稳定性比酵母高, 细菌产生的糖化酶的耐高温性能优 于真菌。CLostridium thermohydro- sulfuricum糖化酶是目前已报道的糖化酶中耐热最高的酶, 在 50 %的淀粉溶液中, 70?下酶完全稳定, 而且在 10 %酒液中仍很稳定。即使在 85?下处理 l h 其酶活性仍保持 50 %, 而且这种酶不受 Ca2+, EDTA 和α - ,β - ,γ - 环状糊精的影响。陈冠军等报道从黑曲霉As B- 11 发酵液中获得的 3 种类型糖化酶 GI, GII, GIII 其适3.430 9 变异株 温度均为 70 ?。Hyun H H[3等曾报道 A.niger IMDCCNO1203 糖化酶活性最高温度均为 70?。α - 环状糊精在 60?下可使糖化酶的热稳定性提高。 一般真菌产生的糖化酶热稳定性比酵母高，细菌产生的糖化酶耐高温性能优于真菌。在50,的淀粉溶液中，70 ?下酶完全稳定，而且在10,酒精液中仍很稳定。即使在85?c下处理l h其酶活性仍保持50,，这种酶不受Ca ，EDTA和α-，β-，γ-环状糊精的影响。 2、糖化酶的pH稳定性 一般糖化酶都具有较窄的 pH 值适应范围, 但最适 pH 一般为 4.5, 6.5。Tomoko TAKAHASHI 等报道来自于 A.saitoi 的糖化酶 GLUM1 其最适 pH 范围为 2.5,7.5, 最适 pH 值为 4.5。 HyunH H 等曾报道 A.niger 产生的糖化酶 pH 值稳定范围为 2, l1。 一般糖化酶都具有较窄的pH值适应范围，但最适pH一般为4.5,6.5。不同微生物菌株产生的糖化酶其耐热性、pH稳定性各不相同。真菌、细菌产生的糖化酶由于耐热性较高，巴氏灭活处理不能使酶失活，在啤酒生产中易影响终产品的风味。 3、糖化酶的底物特异性 糖化酶对底物的水解速率不仅取决于酶的分子结构，同时也受到底物结构及大小的影响。许多研究表明，碳链越长，亲和性越大。它的最大反应速度随着碳 链延长而增加, 呈线形变化。糖化酶主要作用于 a- 1,4糖苷键, 对 a- 1,6 和 a- 1,3 糖苷键也具有活性作用。王扬声等报道红曲霉糖化酶的粗酶液能百分之百地分解可溶性淀粉、 直链淀粉、 糖原、 玉米淀粉、 马铃薯淀粉、 麦芽糖和麦芽二糖等, 对其它碳链较小的底物分解限度则不同程度地降低。 管汉成等对黑曲霉变异株糖化酶的底物特异性进行探讨, 发现糖化酶 GA?仅能水解麦芽低聚糖和淀粉, 不能水解甘露糖、 木聚糖、 地衣多糖、 右旋糖苷及 α - ,β - ,γ - 环状糊精, 说明 GAI 对多糖中糖的组成及糖苷键具有较强的专一性, 它水解a- 1,4 键的速度比a- 1,6 键快近 100 倍。即使是同一糖化酶, 由 于具有多型性。 各型组分对同一淀粉的水解也不一样。方善康等报道黑曲霉 S4 糖化酶分离纯化得到该酶的 3 个组分 GI, GII, GIII 对底物的吸附能力各不相同, GI 对底物的吸附能力远远高于 GII和 GIII。酶对底物的吸附是有效地降解底物的基础。方善康等对A.niger S4 糖化酶纯化组分的性质进行研究, 发现 GII、 GIII 均作用于生玉米淀粉、甘薯淀粉、马铃薯淀粉。但是各糖化酶GI、 组分对这些生淀粉的作用能力均小于对可溶性淀粉的作用能力, 估计作用能力均降低与酶对底物作用的 Km值上升有关。从糖化酶对麦芽糖作用的动力学参数看, 只增加一个葡萄糖单元, Km却大大降低, Vmax升高, 即各糖化酶组分对麦芽糖的亲和水解能力均高于麦芽二糖, 表明各糖化酶组分的最小作用底物是麦芽二糖。同时也表明了糖化酶对底物的亲和力, 除了与酶本身的结构有关外, 还与寡糖链本身的长度有关。 四、酶的发酵生产 1、糖化酶产酶菌种 主要是霉菌，我国多用红曲霉、黑曲霉以及根霉。根霉以固体发酵为主，红曲霉和黑曲霉多以深层液体发酵生产。 2、生产方法 2.1 黑曲霉固体发酵法 工艺: 试管菌种一三角瓶款曲扩大培养一帘子曲种一通风制曲一成品。 2.2 液体深层发酵法 工艺流程: 试管斜面种子一种子扩大培养一发酵一过滤一浓缩一千燥一粗酶剂。 发酵用基质:碳源为玉米粉、甘薯粉等，有机氯源常用玉米浆、豆饼粉和酵母膏等，常用的无机氯源(NH4)2S04、NH4N03和NH3等，无机盐添加MgS04“7H20、KH2PO4等。菌种不同，产生糖化酶的最适pH值也不同，黑曲霉为4(0,5(0，用黑曲霉生产糖化酶一般控制温度30? ,35?。 3、使用糖化酶的优点 3.1 糖化酶对设备没有腐蚀性，使用安全。使用糖化酶工艺简单、性能稳定、有利于各厂的稳定生产。本品质量稳定，使用方便，利于连续糖化，提高产品质量，降低成本。糖化酶一般无任何毒副作用. 3.2、 使用糖化酶对淀粉水解比较安全，可提高出酒率，麸曲法能减少杂菌感染，节约粮食可降低劳动强度，改善劳动条件。 3.3使用糖化酶有利于生产机械化，有利于实现文明生产. 五、糖化酶成品的提取工艺 1、成品糖化酶可分为液体酶和固体酶2种，而固体酶的制备方法又可分为盐析法、有机溶剂沉淀法和附吸法等，采用一条合理的提取工艺，可制备系列酶产品以满足不同行业的需求及降低成本，具体流程如下: 2、目前国内对液体酶产品采用的浓缩方法有2种，一种为依靠热源来蒸发产品 六、糖化酶活力测定方法 目前检测糖化酶活力最普遍的方法是用淀粉作底物，通过测定被酶分解产生葡萄糖的含量来定量分析糖化酶的活力。但针对一些特殊情况还有另外一些方法，如复合糖化酶中作为底物的淀粉同样能被其他类型酶制剂所分解，要是用麦芽糖作底物，相比淀粉底物方法而言，麦芽糖只能被糖化酶专一分解。还有在筛选高活力糖化酶菌株时，采用Starch—PAGE电泳活性染色法，就可既简便、准确、灵敏，又可节约大量试剂。 1、用淀粉底物法测定糖化酶活力 1.1方法原理 糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1，4葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的 次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算出酶活力。 1.2 酶活力定义 lg固体酶粉(或1mL液体酶)于40?、pH4.6的条件下，l h分解可溶性淀粉，产生lmg葡萄糖，即为一个酶活力单位，以U,g(U,mL)表示。 2、用麦芽糖底物法测定糖化酶活力 2.1 方法原理 糖化酶水解麦芽糖生成D-葡萄糖。生成的葡萄糖可通过与葡萄糖脱氢酶反应而测得，葡萄糖脱氢酶(GlucDH)试剂中加入变构酶可将α-D-葡萄糖转化成β-D-葡萄糖。在GlucDH的作用下，β-D-葡萄糖与NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)发生反应生成NADH，后者即等于葡萄糖初始浓度，可用于分光光度法在340nm测定其数值。 2.2 酶活力定义 麦芽糖20 eeL，pH4(30，反应温度37? ，反应时间30min下，每分钟裂解1 p,mol麦芽糖所需酶量。 3、快速检测糖化酶活力的电泳活性染色方法 根据糖化酶能水解淀粉的性质，采用Starch—PAGE，在分离胶中加入淀粉作为糖化酶的作用底物，电泳结束后，在醋酸钠缓冲液中浸泡适当时间，使糖化酶所在部位胶板中的淀粉被酶解，其余部分的淀粉依然存在，碘液染色后，糖化酶存在的部位是无色透明的，没有被水解的部位被染成蓝色。经实验胶板中的淀粉浓度6,，醋酸钠的浸泡时间3 h-4 h，碘染时间1 min为宜。 采用Starch—PAGE电泳活性染色筛选高活力糖化酶菌株，活性染色区带的透明程度与酶液的活力呈正相关性，区带越透明，表明酶活力越高。 七、 提高糖化酶活力的研究 几十年来我国科研工作者为提高糖化酶的活力进行了不懈的努力，常规的物理及化学诱变的方法仍然是方便有效的途径。主要成就有: 1、。谷海先等对黑曲霉 AN- 149 菌进行自然分离、 紫外线和 NTG的复合诱变处理, 得到了一株高产糖化酶的菌株 WG- 93, 经 3OL发酵罐试验, 酶活力达 29 kU/mL(原糖化酶生产发酵水平为 12 kU/m1)。 2、1993 年, 李俊刚等对生淀粉糖化菌黑曲霉 S- 1 原生质体采用(λ l=260 nm, λ 2=266 nm)能量为 8 mJ 的激光直接照射, 得到高酶活力的生淀粉糖化酶突变株, 比出发株酶活力平均提高 37.4 % , 最高突变株酶活力达到 74.5 U/L, 比 出发株提高 91 %。 3、。 1998 年, 李俊刚等又以黑曲霉 523 原生质体为对象, 经激光、 紫外线和亚硝基胍复合诱变, 选育出生淀粉糖化酶高产突变株黑曲霉 NL- 3, 其生淀粉酶活力为 156 U/mL。 有人尝试将糖化酶基因克隆到埃希大肠杆菌和酵 DNA重组技术发展以来, 母菌中, 构建了糖化酶高产工程菌。近几年来,罗进贤等人将酵母 Ty转座子的 δ序列, 黑曲霉糖化酶cDNA 及 G418 抗性基因 neo 重组进酵母整和型质粒 Yiplae128 获得含 LEU2,tieo双标记基因, 糖化酶 eDNA的 高 整 和 型 表 达 载 体 YI128D.17N, 转 化 CRF18(YI128D.17N)糖化酶基因在该菌株获得高效表达, 产物分泌到胞外。吴晓萍等人将切除了 5' 端非编码区 50碱基对片段的黑曲霉糖化酶 GA I cDNA与大麦 a- 淀粉酶基因重组进埃希大肠杆菌-酵母穿梭载体, 构建重组表达质 pMAG11, 转化酿酒酵母 GRF18, 获得含 a-淀粉酶和糖化酶双基因的酵母工程菌 GRF18(pMAGII), 在酵母 PGK基因启动子和终止信号的调控下, a- 淀粉酶和糖化酶基因获得高效表达, 99 %的表达产物分泌至 胞外。 八、 糖化酶在食品工业中的应用 1、糖化酶在传统白酒生产中的应用 我国传统白酒的生产一直沿用固态发酵法，大多使用淀粉质原料，一般以曲为糖化剂，成本高 产酒率低是一个普遍存在的问题 据理论分析，高粱原料出酒率可达 55%左右，而实际上，从清香型 浓香型到酱香型白酒，随着制曲温度的提高，出酒率只有 40%到 20%左右，呈明显的下降趋势 影响出酒率的因素虽然是多方面的，但主要原因却是因为淀粉质原料的糖化不完全所致，而糖化是发酵的基础，因而糖化不好就成了影响出酒率的首要问题 随着白酒工业的发展，利用糖化酶代替部分曲，以提高出酒率，降低生产成本，已被众多白酒企业普遍用尤其近几年活性干酵母的出现，更使糖化酶在白酒中的用量飞速增长赵金松等改进了清香型小曲白酒的传统加工工艺，在不减或减少小曲用量的情况下，适量添加糖化酶，使淀粉的糖化进行得更加彻底，可以提高出酒率 5%，酒质风味不变 经测算，添加糖化酶操作法生产小曲酒，新工艺生产所获得的经济效益要比原传统工艺的经济效益约高出 1 倍[4]覃雪珍等报道，在湘泉浓香型白酒的混蒸混烧工艺中添加耐高温酒用活性干酵母(TH- AADY )和糖化酶，有助于提高出酒率和酒质，提高己酸乙酯的含量，抑制乙酸乙酯的生成，提高己酸乙酯 /乙酸乙酯比 值，突出湘泉浓香型酒的主体香成分己酸乙酯的特征[5] 2、糖化酶在酿制干啤酒中的应用 干啤酒是一种发酵度高的淡爽型啤酒 生产干啤酒与生产普通啤酒的不同之处，在于它提高了啤酒的发酵度 提高发酵度的方法主要有添加发酵性糖法(加 添加酶制剂法(加酶法)和添加特种酵母法 左永泉报道了一种经过加酶糖法) 法改进的干啤酒发酵生产工艺，采用多温度段糖化，提高麦汁可发酵性糖的比例，结果显示，应用此工艺酿制干啤酒，能够达到有效地提高啤酒发酵度的目的，生产出的干啤酒具有风味独特 口味干爽纯正等优点[6] 3、糖化酶在黄酒酿造中的应用 传统的黄酒酿造主要使用活性干酵母作为糖化发酵剂，依然存在产酒率低的普遍问题 王卫国等首次将糖化酶应用于黄酒生产，由于糖化力高发酵快，使生产周期大大缩短，并使出酒率有很大提高 这样，既节约了原料，又降低了成本，提高了经济效益 研究结果表明，糖化酶的加酶量为0.02%，最适温度为 32 ，最适 pH 值为 4.6，主发酵期缩短 2 3 天，后发酵期缩短 10 60 天，出酒率高达 92.07%，是传统法的 3.1 4.6倍[7] 4、糖化酶在食醋酿造中的应用 目前，我国食醋酿造仍以传统工艺为主，具有多菌种低温混合发酵的特点， 传统酿醋工艺存在着酒母培养条件差、 酒母质量不稳定、 原料淀粉利用率低 、出醋率低、 高温季节生产不稳定等诸多生产技术难题。 王传荣在前液后固发酵工艺和液体深层发酵工艺中应用耐高温酒用活性干酵(TH- AADY )和糖化酶， TH- AADY具有耐高温、 耐酸度、 抑制杂菌能力强的特性，能够保证食醋夏季生产的正常进行，不仅降低了原材料的消耗，而且显著提高了淀粉利用率和出醋率，具有较好的经济效益。张安宁等利用 TH- AADY 糖化酶以及耐高温- 淀粉酶提高原料出酒率，进而提高食醋出醋率， 试验表明，该方法可平均提高食醋出醋率1.56Kg/Kg主粮。 5、糖化酶在冰冻食品生产中的应用 一般膨化雪糕中的总固体含量为 18% 、28%，总固体含量低会影响膨化雪糕的膨胀率，产品口感变差 。要提高冷食品中的总固体含量就势必增加白砂糖、 奶粉 、淀粉 、奶油等的用量，从而导致原料成本增加， 而只有增加淀粉的用量，才不至于使原料成本增加太多 ，但当淀粉的含量超过 3%时，冷冻食品贮藏一段时间后，淀粉易发生老化返生现象，出现生淀粉味，这也限制了淀粉在冷冻食品 中的用量刘爱国等采用 - 淀粉酶对冷冻食品中的淀粉进行水解，并用糖化酶糖化使其生成葡萄糖。由于葡萄糖的增加降低了浆料的冰点，使冷冻食品组织状态更加完善;同时由于改变淀粉的分子结构，可以防止淀粉老化返生，消除淀粉味感这种方法可以适当降低白砂糖 、奶粉 、奶油的用量，并增加淀粉的用量，从 、柔软，质量得到改善。 而降低了产品的生产成本;同时可使产品的口感细腻 八、糖化酶研究的展望 虽然糖化酶的研究已经达到很高的水平了，但是仍有许多问题尚待进一步探索。如: 糖链在糖化酶活性、稳定性及构象状态中所起的作用，进一步阐明糖化酶的多型性原因及糖化酶的热稳定性机制。 提高糖化酶的活力，利用诱变、DNA重组技术或其他方法获得优良菌株，提高糖化酶基因在受体菌中的表达水平等，进一步优化糖化酶纯化工艺及保存条件;另一方面，诱变筛选耐热糖化酶产生菌或克隆耐热糖化酶基因，将是一个重要方向，因为耐热糖化酶在发酵业的应用将会大大降低能源消耗，从而降低生产成本，将给糖化酶在工业中的应用开辟更为广阔的前景。 九、存在的问题及改进措施 1、铯 - 137 放射源的安装 。对放射性的物体，为最大限度地降低对人的危害，要求安装、 拆卸时要快速 、准确。 尽管设备提供方做了防装反措施，但不可靠，出现了装反的现象，经及时发现，没有造成严重后果，但射线对人的危害还是不可以轻视的 。事后对铯源装置进行定位改造，彻底解决了这一安全隐患。 2、接收器线路防护。 因现场环境恶劣，虽使用了耐高温电缆，但经常出现烧电缆、 控制线绝缘低等故障。 在改进线路走向，并用石棉布防护后情况有改善，但费时费力 。为实现电缆的快速更换，以适应快节奏的生产需要，将耐高温、 防水的液压管套在电缆外面，解决了电缆防护、 更换难题。 3、 液面不稳、 不能自动、 在自动控制下，对液面不稳 不能自动等难题，进行跟踪 、分析、 研究，找到由于接收器内部晶体与光电管接触不良从而引起液面不稳 、不能自动的根本原因，从而解决了这一少见的技术问题。 4、数字电动缸动作不灵活。 电动缸在使用 10个月后就出现动作不灵， 甚至卡死现象，打开电动缸后发现滚珠丝杠悬臂端轴承磨损严重，更换后问题解决。 为防止类似问题再次发生，对所有电动缸进行检查，轴承都有不同程度的问题，为此定期检查、 加强润滑，每 9 个月更换一个轴承， 此后此类问题再无发生。 参考文献 【1】钟浩; 谭兴和; 熊兴耀; 苏小军; 胡亚平. 糖化酶研究进展及其在食品工业 中的应用 [J]保鲜与加工,2008,(03)。 【2】张秀媛; 袁永俊; 何扩. 糖化酶的研究概况 [J] 食品研究与开发,2006,(09). ,罗惠波,吴士业.糖化酶在清香型小曲酒生产中的应用,J, .食品科【3】赵金松 技,2006,(3). 【4】覃雪珍,向宗府,张学英.TH- AADY 和糖化酶在湘泉浓香型白酒工艺中的应 用研究,J, .酿酒科技, 2006,(6). 【5】张安宁,王传荣,夏如柏.应用 TH_AADY 和糖化酶提高食醋出醋率,J, . 酿酒科技,2006(11) 【6】黎卫强. 糖化酶在食品工业中的应用研究进展[J]沿海企业与科 技,2010,(04). 【7】钟浩. 糖化酶筛选及高产糖化酶菌种诱变选育的研究[D]湖南农业大学, 2009 . 【8】康明丽. 淀粉酶及其作用方式[J]食品工程, 2008, (03) . 【9】甘文青,王娟,麦国琴,余少文. 提高工业生产中糖化酶纯度的新思路[J]. 食品 科技, 2010, (04) . 【10】彭燕,向宗府. 活性干酵母辅以糖化酶在混蒸混烧工艺中的试用[J]酿酒, 2006, (03) . 【11】复合酶中糖化酶活力的测定[J]无锡轻工大学学报, 2004, (04) . 【12】钟浩. 糖化酶筛选及高产糖化酶菌种诱变选育的研究[D]湖南农业大学, 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