浅析可逆性抑制对米氏方程和Lineweaver-Burk图像的影响

浅析可逆性抑制对米氏方程和Lineweaver-Burk图像的影响 浅析可逆性抑制对米氏方程和Lineweaver-Burk图像的影响 曹致宁(1105求是科学班3110000148) 关键词:可逆性抑制 米氏方程 摘要:在单一酶促反应体系中，若存在不同种类的可逆性抑制作用。酶的反应特征常数和反应属性会受到抑制作用特定影响。通过米氏方程中动力学参数的调整和在Lineweaver-Burk图像方程上的修正可以确定不同的抑制剂对酶促反应特征的影响，从而更好的研究和计算实际问题中遇到的抑制作用。 Charpter I酶促反应动力的基础理论 现在的科学家普遍认为一般的酶促反应可以用酶的中间产物学说来解释，那么可以认为在反应特征体现为零级反应的时候酶的潜在催化活性都被充分激活，此时酶的总量和与底物结合参与催化的酶量相等，可以将此时反应的特征看作该种酶促反应的特征。那么经过理论 VV[]Smaxmax数据的推导可以的得到米氏方程的三种不同形式: [](1)v=KS,,mK[]，Svm Vmax。我们可以用米式方程来示底物浓度和反应速度的关系。当V=2v的时候，v,maxKm1，[]S 则Km=[S]，由此我们可以知道可以用米氏常数来表现一个酶促反应中酶与底物的亲和力。而对应若对Km和v倒数为坐标做图便可以得到Lineweaver-Burk双倒数图像(简称LBplot)。 K111m此时的图像特征方程是 ,，vVSV[]maxmax 1 注:在下文所有的推导式中，是指某个条件下的底物弄浓度。是指在没有加入抑制剂的理想[]SVKmaxm 状况下反应的最大反应速度和米氏常数。 由于酶本身是一个具有复杂结构的高分子团，有一些物质可以和酶进行结合从而减缓酶促反应的速度。我们称这种物质叫做酶的抑制剂，而加入抑制剂后产生的效果可以称为抑制作用。有些生理毒性物质可以通过和酶的活性中心不可逆的结合从而破坏酶的活性中心使得酶失去催化效率。有些物质则是通过和酶进行可逆性的结合从而降低激活态的酶分子比例从而降低酶促反应的速度。前一种称为不可逆性抑制，毒性离子和基团使得酶分子永久失活，因此在参数中只是简单不可逆的降低实际反应酶量，和动力学的平衡问题没有关系，且在LBplot中只是简单的图像沿横轴平移，因此不将其划入讨论范围内，而后面的一种称为可逆性抑制剂，本身并不破坏酶的结构，只是降低了激发态活性分子的比例，本身具有活性的酶量不发生变化，因此可以通过米氏方程里面的动力学特征参数来修饰。本文 Charpter II 可逆性抑制作用动力学影响 单纯的可逆的抑制作用共有三种:竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制，而除了以上三种，还有混合型抑制作用。不同种类可逆性抑制剂的反应机理不一样，因此对米氏方程中参数和LBplot的影响不一样，需要分开讨论。本文以前三种相对可以进行清晰的动力学计算的为主体进行介绍。 1( 竞争性抑制 该种抑制的抑制剂I和本身目标反应的底物S具有一定程度上的相似性，在反应中 会和底物竞争和酶活性中心结合的机会，从何影响底物和酶之间的正常结合，因为酶的 2 活性中心不能与底物和抑制剂同时结合，因此底物和抑制剂之间会产生竞争关系并且达到一定程度上的平衡关系。而由于抑制剂和酶的活性中心可逆性结合而且底物和抑制剂处于竞争关系，这种抑制作用可以通过增加底物浓度而接触。这类抑制作用的典型例子就是丙二酸抑制琥珀酸脱氢酶结合琥珀酸生成延胡索酸的过程中。丙二酸和琥珀酸(丁二酸)有着相对相似的结构，是相对理想的竞争性抑制的例子。 k1k3,,,+SESEP,,,，,,,k2Eki1 ,,,，IEI,,,ki2 竞争性抑制剂的反应模型如上图，E和I结合后生成的EI复合物不能转化成E+P，因此从表观来看由于一部分酶和抑制剂结合，总体参与目标反应的酶含量下降。 我们以推导米氏方程的方法来对两部分动力方程进行推导: ki2首先设定一个常数，称K为EI的解离常数。经过计算可以得知这个常数是K,iiki1 EI的分解常数。 设酶的总量[Et]，在原始的米氏方程中[Et]=[E]+[ES]。而对应在加入竞争性抑制剂后 [Et]= [E]+[ES]+[EI]，针对目标反应的底物来说v=k[ES]，而如果此时假设所有的酶都3 和底物结合生成ES复合物从而催化目标反应。那么此时V=k[Et] max3 EESEI，，V,,,,,,max做比例式同时代入[Et]可以得到 ,vES[] 在米氏常数的推导过程中我们已经将米氏常数定义为ES复合体的解离常数即 kk，k23i2对应而EI复合体的解离常数。 K,K,mikk1i1 [][]ES[][]EI那么根据解离常数的定义可以知道 K,K,mi[]ES[]EI KES[][][]EIm代数变形得到，然后将[E]带入[EI]再带入[]E,[]EI,[]SKi 3 EESEI，，V,,,,,,max可以得到加入竞争性抑制剂后整个反应体系目标反应速度于,vES[] VS'[]max底物浓度和抑制剂浓度的关系。整理后得到，则此时和原始的v',[]IKS'(1)[]，，mKi V[]S[][]EImax速率方程作以比较，可以得到比较清晰的结论。由于，因此K,v=i[]EIK[]，Sm V[]Imax为正数项，所以原来的方程中分母如果令，那么计算可得v'v,,K2i []I，相比无抑制剂的情况下。而由于EI的复合体和底KSK'[],,[](1)SK,，mmmKi 物没有任何的亲和力，所以EI只能分解成E和I在体系中继续参与反应平衡的建立。因此可以视为本身E的特征参数没有发生变化，那么本身酶的总量和活性没有发生实质上的变化，则整体的最大反应速率不变。 Vmax K1[]11Im将整理后的式子左右同取倒数然后可以得到对应的,，，(1)vVKSV[]maxmaxi LBplot由新的方程图像可以知道相比较与原始的LBplot，由于任意一条直线的，所以取负倒数KK',mm 以后图像和X轴交点会不断向右移动，同时由于在图像方程中常数项没有发生改变，即对应的V数值不发生变化，所以纵坐标不会变化。 max 通过米氏方程的推导和LBplot的验证的得出了竞争性抑制剂对酶促反应的动力学 4 影响:当抑制强度增大的时候，米氏常数变大，最大反应速度不变。 2( 非竞争性抑制 这类抑制的特点是抑制剂本身和底物的相似程度并不大，但是可以和酶活性以外的基团相结合，因此两者不存在对酶分子活性中心的竞争作用。而且底物和抑制剂可以同时与酶结合，即酶在和抑制剂结合形成EI以后，仍然可以和底物结合形成ESI的复合物，但是三元复合物没有催化活性，不能进一步反应生成产物，因此酶的活力降低。由于该种抑制剂不存在和底物的活性中心竞争，因此无法通过增加底物浓度来解除抑制。比较典型的例子就是麦芽糖抑制α-淀粉酶对淀粉的水解作用。本身麦芽糖无法和α-淀粉酶的反应活性中心特异性的结合，但是可以结合α-淀粉酶的其他结构位点使之无法特异性的催化淀粉的分解。 kki11k3,,,,,,+()SESIESIEP，,,,，,,,,,,kk22iEkki11 ,,,,,,，IEISESI+,,,,,,kki22 此时的模型对应着E和ES都可以和抑制剂I结合，此时由于ESI无法分解成E+P，因此在一定程度上抑制了全部的酶分子进入反应体系。 开始的假设方法和推导过程和竞争性抑制很相似，但是有一点不同的是，由于这时候总的酶分子数量被分为了四部分，而在ESI复合体中也有一定量的酶分子，因此参考先前 EESEIESI，，+V,,,,,,,,max的比例式并且将原来的等式加以修正可以得到:。抑,vES[]制剂本身不存在和底物的竞争作用，而是和酶的非活性中心结合，所以抑制剂的结合不会影响底物的继续结合，同理底物和酶的结合也不会影响抑制剂和酶分子的结合。由于在简单的非竞争性抑制作用中我们认定在和E和ES结合I的时候完全等价，因此无论是E还是ES复合物和，结合的可能性相同，我们可以认为他们的动力学参数相同。同理E或者EI和S结合的动力学参数也相同。那么我们可以得到以下的结论 [][][][]ESEIS[][][][]EIESI K,,K,=mi[][]EIESI[][]ESESI 5 将常数式变形，只保留 四项，然后代入得到关于v的表达式 KK[]S[]Imi VS'[]max。由于在整体的反应体系中，E和EI和S结合几率一v',[][]IIKS'(1)[](1)，，，mKKii 样，那么表现出来的效果是总有一部分酶将以EI和ESI的形式存在，所以表观上参与 vS[]，那么和原始反应的总酶量减小。将得到的表达式变形可以得到,VKS，[]maxm []I(1)，Ki Vmax方程进行对比以后不难看出此时的表观最大反应速率，那么对'VV,,maxmax[]I(1)，Ki应的最大反应速率和不加入抑制剂的反应体系相比是减小的。 VV'maxmax此时由竞争性抑制剂的推导可以得到若，带入原式可以得到v'v,,,[]I22(1)，Ki此时。就原式关于v的方程式取双倒数以便作出LBplot，我们可以得KSK'[],,mm K1[]11[]IIm到LBplot的图像特征方程，作出对应的LBplot ,，，，(1)(1)vVKSVK[]maxmaxii 可以得到结果。相比较与原始 的LBplot，由于任意一条直线的，所以取负倒数以后图像和Y轴交点会不VV',maxmax 断向上移动，同时由于在图像方程中对应的没有发生改变，即一次函数中对应的一Km 次项系数数值不发生变化，所以纵坐标不会变化。 6 通过米氏方程的推导和LBplot的验证的得出了非竞争性抑制剂对酶促反应的动力学影响:当抑制强度增大的时候，米氏常数不变，最大反应速度变小。 3( 反竞争性抑制 该种抑制作用相对比较少见，主要见于混合型抑制(即不同种类的抑制都存在的抑制作用)或者多种底物参与的酶促反应，但是有着比较特征性的反应特征和动力方程。酶分子在没有结合底物的时候无法抑制剂相结合，而一旦产生了酶底物复合物ES，则抑制剂会和复合物可逆性的结合，生成ESI复合物，ESI三元复合物没有催化活性，不能进一步反应生成产物，因此酶的活力降低。由于此时无论如何提高底物浓度，都会有一些酶分子以没有催化活性的ESI形式存在，因此该种抑制作用也不可以通过提高底物浓度来解除。此类抑制作用在单一性的抑制作用很少出现，L-苯丙氨酸对兔小肠黏膜碱性磷酸酶的抑制作用可以视为一种相对典型的反竞争性抑制。 k3k,,,，EP1,,,E+SES,,,ki1k2 ,,,，IESI,,,ki2 此时的模型对应ES可以和抑制剂I结合，此时由于ESI无法分解成E+P，因此在一定程度上抑制了全部的酶分子进入反应体系。 EESESI，+V,,,,,,[][]ESI[][]ESmax此时参考先前的证明，对应，K,K,,mi[]ES[]ESIvES[] 将常数式变形，只保留 四项，然后代入得到关于v的表达式KK[]S[]Imi VS'[]max。表现出来的效果是总有一部分酶将以ESI的形式存在，所以v',[]IKS'[](1)，，mKi vS[]表观上参与反应的总酶量减小，经过变形可以得知:。由对,VKmaxm，[]S[]I[]I(1)，(1)，KKii Vmax应的方程式不难得到表观最大反应速度，而带入'VV,,maxmax[]I(1)，Ki 7 VV'Kmaxmaxm可以得到，相比不加入抑制剂的情况[]S,v'v,,,[]I[]I2(1)，2(1)，KKii ,,,，这是由于ES的消耗速度变大，因此抑制剂会促使向KSK'[],,E+SES,,,mm 正方向进行。因此表观的反应整体速度会上升。就原式关于v的方程式取双倒数以便作 K111[]Im出LBplot，我们可以得到LBplot的图像特征方程 ,，，(1)vVSVK[]maxmaxi Km观察图像得知，由于整体的没有发生变化，因此直线的斜率没有发生变化。但是Vmax 1[]I随着抑制强度的上升，会不断上升，因此会呈现直线不断地向上平移的(1)，VKmaxi Km结果，但是明显可以看出图像的的上升是平移，那么我们知道本身图像的斜率是，Vmax因此这两个比值不变。通过米氏方程的推导和LBplot的验证的得出了竞争性抑制剂对酶促反应的动力学影响:当抑制强度增大的时候，米氏常数变小，最大反应速度变小， Km但是不变。 Vmax 8 4( 混合性抑制 此种抑制作用很少能用简单的动力学方程来计算的。有相对简单的线性混合型抑 制，也有复杂的多种抑制作用综合作用的效果。在此只是简单的提及概况，不具体的加 以计算。混合性抑制中分线性混合性抑制和非线性混合性抑制。线性混合性抑制可以看 作是非竞争性抑制的一种普遍形式，非竞争性抑制的特殊之处无论是E还是ES复合物 和，结合的可能性相同，因此解离的动力学参数相同，同理E或者EI和S结合的动力 学参数也相同。但是这是一种极其特殊的状况。而理想状况下的线性混合型抑制相对特 殊性小一些，两者的动力学参数有着相对的线性关系但是并不相同。 akki11k3,,,,,,+()SESIESIEP，,,,，,,,,,,kak22iEkaki11 ,,,,,,，IEISESI+,,,,,,kaki22 即无论是S还是和I，只要和E结合后，那么都会影响ESI复合物的形成。但是由 于是理想模型，对应ES与I结合的平衡常数和E与I结合的平衡常数有着线性关系， 即方程式中的影响常数，这个常数也是E和S结合的平衡常数和EI与S结合的平衡a VS'[]max常数之间的影响常数，最后可以得到相对简单的等式。v',[][]IIKS'(1)[](1)，，，mKaKii 但是实际的反应状况中，存在着两个影响常数不相同的情况，那么需要修改原始的动力 模型再加以计算。而非线性混合抑制可以看作是不同种类简单可逆抑制的混合，常见的 有竞争性抑制和反竞争性抑制的混合抑制，竞争性抑制和反竞争性抑制的混合抑制。这 种抑制需要先分析出不同性质的抑制所占总抑制类型的百分比，然后分析抑制常数，最 终带入进行计算。 Charpter III 结语 在我们平时对酶动力学的研究和计算中，很少会出现理想状态下的酶催化反应，普遍的状况是有各种情况的外界抑制因子存在。抑制剂作为外界抑制因子中十分重要的一部分，值得我们去深入的了解，可逆性抑制作用作为其中的重点，只有我们深入地计算分析之后，才能更好的应用于实际的实验数据处理和题目的计算。 9 引用文献: 1.生物化学简明教程(第三版)罗纪盛 张丽萍等 著 2.Enzyme Kinetics—A modern Approach A.G.Marangoni 著 3.Outlines Of Enzyme Chemistry J .B.Neliands Paul K.Stumpf 著 4.生物化学 (第三版) 上册 王镜岩 朱圣庚 徐长法 主编 5全美经典学习指导系列—生物化学 Philip W. Kuchel Gregory B.Ralston 著 6.生物化学计算 Irwin H. Segel著 7.Harper’s Biochemistry Robert K. Murray Daryl K. Granner 等著 8.Biochemistry(Third Edition) Reginald H.Garrett Charles M. Grisham 著 10