超声波辅助热水提取香菇多糖及其应用的研究-4.开题课件资料

附件3： 北京理工大学珠海学院 毕业（论文）开题报告 题    目： 超声波辅助热水提取香菇  多糖及其应用的研究    学    院： 化工与学院          专    业： 生物工程              学生姓名： 毛颖                    指导教师： 周新明  朱超锋          一、研究的现状及其意义 香菇是世界第二大食用菌，味道鲜美，香气沁人，营养丰富，素有“植物皇后”美誉。因香菇营养丰富、味美纯香，为药食两用之佳品，我国国内市场每年有大量产品供应。香菇多糖作为香菇中的功能性成分之一，经研究发现具有抗肿瘤、提高免疫力、抗感染的作用，在降低血糖方面也具有良好的功效[1-3]。传统多糖一般采用水提法、酸碱溶液提取法等，得率较低，能量消耗大，而且在提取的过程中容易造成多糖降解，多糖活性降低。超声波技术目前已被广泛应用到植物活性成分的提取中，超声波的振动能产生强烈的空化及搅拌作用，加速有效成分溶入溶剂，提高植物有效成分的得率。利用超声波技术提取真菌多糖的应用也比较广泛，超声波法提取效果较好[4-5]。利用超声波辅助热水浸提取香菇多糖技术目前报道较少，香菇子实体经粉碎后，使用超声波技术进行前期处理，再用热水浸提，可使多糖充分溶出[6-7]。本实验在时间、温度、料水比以及超声时间四个相关工艺参数单因素实验的基础上，利用正交实验和响应曲面对实验条件进行优化，并对香菇提取液进行纯化，抗氧化能力的测定和抑菌实验的测定。 二、研究目标、研究内容和拟解决的关键问题 2.1 研究目标 （1）探究最佳提取香菇多糖工艺条件 （2）研究香菇多糖对几种常见菌的抑制作用 2.2 研究内容 （1）采用超声波辅助热水浸提香菇多糖的，从料液比，浸提时间，浸提温度和超声功率等几方面探究最佳的提取工艺 （2）用壳聚糖絮凝纯化香菇多糖，测定蛋白质的去除率和脱色率，确定合适的提取条件 （3）探究香菇多糖抗氧化性能和对几种常见菌的抑制作用 2.3拟解决的关键问题 （1）使用鲜香菇还是干香菇的多糖提取率比较高 （2）从香菇提取液中纯化香菇多糖，多糖的损失率需控制在合适的范围 （3）提取液分量较小，如何进行浓缩 三、研究的基本思路和方法、技术路线、实验及可行性分析 3.1 基本思路 通过正交实验和响应面实验对香菇多糖的提取条件料液比，浸提时间，浸提温度和超声时间4个方面进行工艺优化，寻找最佳提取工艺。在最佳提取工艺的条件下用壳聚糖絮凝纯化香菇多糖，测定纯化前后的蛋白质去除率，脱色率和多糖的损失率，寻找最合适的纯化条件。因为香菇多糖有抗肿瘤活性，抗病毒活性，免疫调节性能等多种功效，在此我们测试其抗氧化性能和对几种常见菌的抑制作用。 3．2 技术路线 香菇清洗、干燥——粉碎——按一定水料比配成香菇溶液——超声震荡——热水浸提2 h——冷却过滤——取上清液——硫酸?苯酚法测定粗多糖含量——确定最佳提取工艺——壳聚糖絮凝纯化——测定蛋白质去除率，脱色率和多糖损失率——确定最佳纯化条件——抗氧化性测试——抑菌能力实验 3.3 实验方案 3.3.1 香菇多糖的提取和测定 称取一定量的香菇粉末，按实验设计的浸提时间、浸提温度、料液比条件进行热水浸提，然后抽滤，重复提取2次，合并滤液，滤液浓缩至原体积的1/3，加入3倍体积的95％ 乙醇，4℃醇析过夜。醇析液在常温下于4 000 r/min离心15 min，将沉淀物热风干燥，得香菇粗多糖。取一定量的香菇多糖粉末，复溶，定溶至一定体积，按照苯酚一硫酸法，测定490 nm波长下的吸光度，并根据多糖标准曲线方程计算多糖含量。 设计正交实验和相应面实验，优化提取工艺 表1 正交实验因素水平 水平 A料液比 B超声时间/min C浸提温度/℃ D浸提时间/h 1 1：20 10 80 1.5 2 1：25 15 90 2 3 1：30 20 100 2.5           表2 响应面分析实验因素水平表 编码 因素 水平 -1 0 1 A 料液比 1：20 1：25 1：30 B 超声时间/min 10 15 20 C 浸提温度/℃ 80 90 100           3.3.2 壳聚糖絮凝纯化香菇多糖 在香菇多糖提取液中加入一定体积的壳聚糖母液。在一定温度下，充分搅拌并静置一定时间后，4000 r/rain离心去沉淀，得澄清液，测定色素、蛋白质和多糖含量的变化。在室温条件下，固定壳聚糖沉降时搅拌速度为60 r/rain，沉降时间为60 min，通过改变壳聚糖的用量，壳聚糖沉降时间和溶液酸碱度的变化，考察壳聚糖用量对絮凝效果的影响。 3.3.3 香菇多糖抗氧化性和抑菌实验 （1）还原能力的测定：在10mL具塞试管中加入lmL样品、0.2mL磷酸钠缓冲溶液(0.2mol/L，pH6．6)和0.5mL 1％K3[Fe(CN)6]。置50℃恒温水浴中反应20min 后流水速冷，再加入1mL 10％三氯乙酸溶液，取反应液1.5mL，加3mL蒸馏水和0.2mL 1％FeCl3，溶液，混合均匀，5min后于700nm处测定其吸光值，以水为空白，吸光值越大表示还原能力越强。 (2）清除超氧阴离子自由基的测定:在比色管中加入Tris-HCl溶液(ph8.2)5.0mL，加入糖液lmL及50μL邻苯三酚，迅速摇匀，以蒸馏水为空白对照组，每隔30s在325nm处测定吸收值。每个试样作3个平行样．取其平均值。 清除率按下式计算： 清除率s(％)=(F空—F样)/F空×100 式中：F空——空白溶液的吸光度随时间的变化率； F样——被测液的吸光度随时间的变化率。 （3）清除羟基自由基(?oH)的测定：利用H2O2与Fe2+产生?OH．在体系内加入水杨酸捕捉?OH并产生有色物质，该物质在5l0nm处有最大吸收。反应体系中含8.8 mmol/L H2O2 l mL、9 mmol/L FeSO4 l mL、9 mmol/L水杨酸一乙醇l mL、待测溶液l mL，其中H2O2是最后加入并启动整个反应。37℃反应0.5h后，以蒸馏水为参比，在510 nm下测定吸光度。考虑待测溶液本身的吸光值不同，以9 mmol/L FeSO4 l mL、9 mmol/L水杨酸一乙醇lmL、不同浓度多糖溶液lmL和蒸馏水1mL作为待测溶液的本底吸收值。 清除率计算公式为： 清除率(％)=[Ao-(Ax-Axo)]/Ao×l00 式中：Ao——不加糖液的空白对照液的吸光度； Ax——加入待测溶液后的吸光度； Axo——无显色剂时多糖的本底吸收值。 (4) 供试菌种的活化及菌悬液的制备:预先将6种供试菌种接入相对应的斜面培养基上进行活化，细菌置37℃恒温培养箱中培养24h，霉菌及酿酒酵母置28℃恒温培养箱中培养48h，然后分别挑取一环已活化好的菌种放入9mL无菌生理盐水中，振荡摇匀。制成一系列菌悬液，浓度约为107-108cfu/mL，备用。滤纸片的制备：用打孔器将定性滤纸加工成直径为6mm的圆形滤纸片，放人干燥的平皿中干热灭菌后。浸入浓度为20mg/ml香菇多糖供试液，浸泡30min。香菇多糖对6种食品常见菌的抑制作用:将固体培养基熔化倒入平皿，待冷却凝固后，分别加入0.2mL供试菌液。涂布均匀，做成含菌平板，用灭菌镊子夹出含有多糖的滤纸片放在培养基上。每皿贴4片。每菌做6次重复。细菌置37℃恒温培养箱中倒置培养24h．霉菌及酿酒酵母置28℃恒温培养箱中培养48h，取出。测量滤纸片抑菌圈的直径大小，比较抑菌效果。 3.4 可行性分析 （1）香菇中含有大量香菇多糖 （2）热水提取法稳定可靠，便于操作 （3）提取香菇多糖的工艺比较成熟 四、研究及进度安排 2012年8月-9月 查找资料，设计实验方案，对比各种提取方法； 2012年10月-12月 进行实验，再实验中改进方案； 2013年1月-5月撰写论文，老师评点，修改，完成。 五、参考文献 [1]王谦．大型食用真菌的多糖类物质[J]．广西轻工业,1995(4)：16-19． [2]王玢，任清，李奇，等．香菇多糖的提取及其抗氧化性和保湿性评价[J]．食用菌,2008(5):58-60． [3]李小定，荣建华，吴谋成．真菌多糖生物活性研究进展[J]．食用菌学报，2002，9(4)：50-58． [4]唐省三，朱晓琴．复合真菌多糖的抗肿瘤及免疫增强作用初探[J]．基础医学与临床，2004，24(5)：599-600． [5]刘宁,李腱．香菇多糖的提取工艺比较[J].食品科学,2007,28(9):199-202． [6]孙庆磊,梁月荣,陆建良．超声波在茶叶提取中的应用[J].茶口斗-,2006,32(2): 79-82. [7]高小荣．银耳碱提多糖的提取、分离、结构分析及其抗氧化活性的研究[D]．中国协和医科大学硕士学位论文,2004:41. 指导教师意见： 指导教师签名：            年  月  日 工作小组审查意见： 工作小组组长签名：      年  月  日