细胞工程 动物组织和细胞培养

第3章 动物细胞和组织培养工程 第一节 植物组织和细胞培养的基础知识 一 动物细胞培养的基本条件 无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器， 洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外 灯，电热干燥箱，高压灭菌器，抗生素 细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶， CO2培养箱，培养基，血清 细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪 ，微孔板震荡器，高 速离心机，移液器 细胞保存条件：液氮罐 实验室安全：生物实验室安全，P1,P2,P3实验室安全 (一) 无菌条件 · 净化工作室，风淋室，传递窗，高效过 滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净 工作台，紫外灯，电热干燥箱，高压灭 菌器，抗生素. 1 净化工作室 ------ 我国药品生产洁净室（区）空气洁净度 ------- 洁净度级 尘粒最大允许数/立方米 尘粒最大允许数 别 100 10,000 100,000 300,000 ≥0.5um 3,500 350,000 3,500,000 10,500,000 ≥5um 0 2,000 20,000 60,000 浮游菌/立方 5 100 500 NA 沉降菌/皿 1 3 10 15 2 风淋室: ●风淋室是生物洁净室 的理想配套设备，用于 吹除进入洁净厂房的人、 物面附着的尘埃 ●是进行人身、物料净 化和防止室外空气侵入 洁净区的有效设备 ●风淋室可以配合加热 器，冬天可以加热，温 度可调，一般控制温度 在30-35℃较为适宜。 3 传递窗: 该装置是一种洁净室 的辅助设备，主要用于 洁净区与洁净区，洁净 区与非洁净区之间小件 物品的传递，以减少洁 净室的开门次数，把对 洁净区的污染降低到最 低程度。 4 高效过滤器: ●高效过滤器是用超细玻璃纤维 纸作滤料，胶板纸作分隔板，可 与铝合金框、木框及镀锌钢板框 组合而成。 ●特点：具有低阻高效、轻质、 容尘量大等特点， ●适用于常温常压常湿条件下环 境空气的净化. 5 洁净层流罩: 层流罩是可提供局部高洁净 环境的空气净化设备。洁净 层流罩是将空气经风机以一 定的风压通过高效空气过滤 器后，使洁净空气呈垂直气 流送入工作区，从而保证了 工作区内达到工艺所需的高 洁净度。 6 超净工作台 超净工作台的工作 原理是利用鼓风机 驱动空气通过高效 滤器除去空气中的 尘埃颗粒，使空气 得到净化。净化空 气徐徐通过工作台 面，使工作台内构 成无菌环境。 7 生物安全柜: 一种既能使操作造成无菌、 无尘的局部空气环境，保证检 验、检测不受污染，又能保证 被研究的对象（如病菌、细菌 等）不外溢，保护周围环境及 操作人员的安全隔离设备。 该设备可广泛应用于低、 中等危险度的临床细菌学，病 毒学、微生物学、组织培养、 生物学及生命科学的研究，加 工、检验部门。 · 如何除菌？ · 灭菌 8 紫外灯 ：紫外线消毒。主要用于培养室空气、 操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒 。 9 电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用干玻璃 器皿消毒 。 10蔡氏（ Zeiss）滤器：过滤除菌，滤器中的滤膜 一般用0.2～0.3μm孔径的微 孔滤膜。凡在高温或 射线下易发生变性或失去功能的物质，如人工合 成培养液、血清、消化 用胰酶等都须用滤器过滤 除菌。 滤 器 大容量高压灭菌器 (二) 细胞生长条件 · 纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶， CO2培养箱，培养基，血清 1自动双重纯水蒸馏器 2 纯水仪 精滤、活性碳吸附 反渗透 3 标准型细胞培养板 （Tissue Culture Plates） 6孔，12孔，24孔，48孔，96孔 4 培养瓶 5 CO2培养箱 CO2培养箱主要由箱体结构 件、温度控制系统和CO2浓度 控制系统三部分组成。 CO2培养箱设定的条件为37 ℃ ，5％CO2 。 再现活体环境对于温度、PH值 CO2浓度、氧分压（O2浓度）、相 对湿度等细胞生长关键的因素， 6 移液器 (三) 细胞检测条件： · 倒置显微镜，酶标仪 ，微孔板震荡器， 高速离心机，移液器 15 用于微生物、细胞、细菌、组织 培养、悬浮体、沉淀物等 的观察，并可将此过程中的任一形态拍摄下来。 2 酶标仪 3 微孔板震荡器 通过自动酶标仪计数来检测活细胞 数量。 主要用于酶标板、细胞培 养板(如6孔板、12孔板、 24孔板、48孔、96 孔板 等)等溶液的混匀或细胞 的混匀。 (四) 细胞保存条件： · 液氮罐 -196 ℃ (五) 实验室安全： · 生物实验室安全，P1,P2,P3实验室安全 实验室安全 层流净化细胞培养室管理规则 一级生物安全防护实验室 二级生物安全防护实验室 三级生物安全防护实验室 四级生物安全防护实验室 层流净化细胞培养室管理规则 局部小环境空气 达到洁净度等级 层流净化细胞培养室的总体要 求：经济、有序、高效、安全。 初步制定相关如下： 实验室安全级别 一级生物安全防护实验室 实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于 对健康成年人已知无致病作用的微生物，如用于教学 的普通微生物实验室等。 二级生物安全防护实验室 实验室结构和设施、安全操作规程、 安全设备适用于对人或环境具有中等 潜在危害的微生物。 二级生物安全防护实验室 1 可能产生致病微生物气溶胶或出现溅出的操作均应在生物安全柜(Ⅱ级生物 安全柜为宜)或其他物理抑制设备中进行，并使用个体防护设备。 2 处理高浓度或大容量感染性均必须在生物安全柜(Ⅱ级生物安全柜为宜) 或其他物理抑制设备中进行，并使用个体防护设备。 上述材料的离心操作如果使用密封的离心机转子或安全离心杯，且它们只在生物 安全柜中开闭和装载感染性材料，则可在实验室中进行。 3 当微生物的操作不可能在生物安全柜内进行而必须采取外部操作时，为防 止感染性材料溅出或雾化危害，必须使用面部保护装置(护目镜、面罩、个体呼吸 保护用品或其他防溅出保护设备)。 4 在实验室中应穿着工作服或罩衫等防护服。离开实验室时，防护服必须脱 下并留在实验室内。不得穿着外出，更不能携带回家。用过的工作服应先在实验 室中消毒，然后统一洗涤或丢弃。 5 当手可能接触感染材料、污染的表面或设备时应戴手套。如可能发生感染 性材料的溢出或溅出，宜戴两副手套。不得戴着手套离开实验室。工作完全结束 后方可除去手套。一次性手套不得清洗和再次使用。 三级生物安全防护实验室 实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于 主要通过呼吸途径使人传染上严重的甚至是致死疾病 的致病微生物及其毒素，通常已有预防传染的疫苗。 例如：艾滋病病毒的研究(血清学实验除外)应在三级 生物安全防护实验室中进行。 例如：重症SARS病人传染性 较强，这与病人产生的大 量呼吸道飞沫有关。 三级生物安全防护实验室 1 实验室中必须安装Ⅱ级或Ⅱ级以上生物安全柜。 2 所有涉及感染性材料的操作应在生物安全柜中进行。当这类操作不得 不在生物安全柜外进行时，必须采用个体防护与使用物理抑制设备的综合防 护措施。 3 在进行感染性组织培养、有可能产生感染性气溶胶的操作时，必须使 用个体防护设备。 4 当不能安全有效地将气溶胶限定在一定范围内时，应使用呼吸保护装 置。 5 工作人员在进入实验室工作区前，应在专用的更衣室(或缓冲间)穿着 背开式工作服或其他防护服。工作完毕必须脱下工作服，不得穿工作服离开 实验室。可再次使用的工作服必须先消毒后清洗。 6 工作时必须戴手套(两副为宜)。一次性手套必须先消毒后丢弃。 7 在实验室中必须配备有效的消毒剂、眼部清洗剂或生理盐水，且易于 取用。可配备应急药品。 四级生物安全防护实验室 实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对人 体具有高度的危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不 明，目前尚无有效的疫苗或治疗的致病微生物及其毒 素。与上述情况类似的不明微生物，也必须在四级生物安 全防护实验室中进行。待有充分数据后再决定此种微生物 或毒素应在四级还是在较低级别的实验室中处理。 1 在实验室中所有感染性材料的操作都必须在Ⅲ级生物安全柜 中进行。如果工作人员穿着整体的由生命维持系统供气的正压工作 服，则相关操作可在Ⅱ级生物安全柜中进行。 2 所有工作人员进入实验室时都必须换上全套实验室服装，包 括内衣、内裤、衬衣或连衫裤、鞋和手套等。所有这些实验室保护 服在淋浴和离开实验室前均必须在更衣室内脱下。 (六) 培养细胞生长的条件 1 细胞的营养需要 2 细胞的生存环境 温度: 37 ℃，O2 CO2: 5%，CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 3 无污染 4 无毒 1 细胞培养用液的配制 1）水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 2）平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液，维持一定渗 透压和pH PBS：NaCl            8.0 g KCl            0.2 g Na2HPO4.H2O  1.56 g KH2PO4 加水至1000 ml 0.20 3）消化液： · · · 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细 胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制, 常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 4） 培 养 基 ： · · · · · · · 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然 培养基和合成培养基。 ①天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸 液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限 成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。 易发生支原体污染 ②合成培养基： 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人 工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、 MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无 机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 。 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁 殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。 血清中含有： ①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ； ②多种金属离子；