血清尿素的测定

血清尿素的测定 第十三章 非蛋白含氮化合物及总胆汁酸测定 非蛋白含氮化合物包括除蛋白质以外的尿素、肌酐、肌酸、尿酸、氨基酸、核苷酸、嘌呤、谷胱甘肽等多种含氮有机物。临床上应用较多的有尿素、肌酐、尿酸和肌酸及它们的最终代谢产物氨，含血红素蛋白的代谢产物胆红素，以及肝脏合成的胆汁酸。 尿素、肌酐、尿酸和肌酐清除率可作为肾小球滤过功能的指标，尿酸水平还能反映嘌呤代谢紊乱的情况;尿肌酸测定能反映肌肉损害性疾病。血氨是肝功能衰竭的指标，胆红素和胆汁酸可反映肝胆功能。 第一节 血清尿素测定 检测尿素的方法有二乙酰一肟法、半酶法和全酶法。二乙酰一肟法需煮沸反应，检测精密度较差，目前临床实验室基本上已不使用。半酶法是直接或间接测定经脲酶作用后由尿素转变成的氨，氨的测定方法有:?离子选择性电极法;?用波氏比色法;?干化学法。脲酶,波氏比色法在基层实验室较多用。全酶法用脲酶和谷氨酸脱氢酶偶联，使用连续监测法测定，可自动化，目前在多数医院普遍使用。 实验79 二乙酰一肟法测定血清尿素 【原理】 二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。因二乙酰不稳定，故由试剂中二乙酰一肟与强酸作用产生二乙酰。 【试剂】 1(酸性试剂 在三角烧瓶中加去离子水约100ml，然后加入浓硫酸44ml、85%磷酸66ml。冷至室温，加入氨基硫脲50mg及硫酸镉(CdSO?8HO)2g，溶解后用去离子水稀释至1L。42 置棕色瓶中，4?可保存半年。 2(179.9mmol/L二乙酰一肟溶液 称二乙酰一肟20g溶于去离子水中并定容至1L。置棕色瓶中，4?可保存半年。 3(尿素贮存液(100mmol/L) 精确称取于60,65?干燥恒重的尿素(Mw为60.06)0.6g，溶解于无氨去离子水，并定容至100ml，加0.1g叠氮钠防腐，4?可保存6个月。 4(尿素标准应用液(5mmol/L) 取5ml上述贮存液用无氨去离子水稀释至100ml。 【操作步骤】 按表13-1操作。 1 表13-1 二乙酰一肟法操作步骤 加入物(ml) 空白管 标准管 测定管 0.02 血清 , , 0.02 尿素标准应用液 , , 0.02 去离子水 , , 0.5 0.5 0.5 二乙酰一肟溶液 5.0 5.0 5.0 酸性试剂 混匀，置沸水浴加热12min，取出置冷水中冷却5min，以空白管调零，在540nm处读取各管吸光度。 A测定尿素(mmol/L),，5【计算】 A标准 【参考范围】 血清尿素1.78,7.14mmol/L。 【临床意义】 1(血液尿素浓度增高 分生理性和病理性因素两方面。 (1) 生理因素:高蛋白饮食引起血清尿素浓度和尿液排出量显著增高。血清尿素浓度男性比女性平均高0.3,0.5mmol/L，随年龄增加有增高倾向。成人日间生理变异平均为0.63mmol/L。 (2) 病理因素 1) 肾前性:最重要的原因是失水，因血液浓缩使肾血流量减少，肾小球滤过率减低而致血液尿素浓度增加。 2) 肾性:肾小球肾炎、肾病晚期、肾功能衰竭、慢性肾盂肾炎及中毒性肾炎等影响肾小球滤过的疾病，都可使血液尿素含量增高。 3) 肾后性疾病:所有使尿路阻塞的因素都可引起血液中尿素含量增高，如前列腺肿大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤致使尿道受压等。 2(血尿素浓度降低除婴儿、孕妇以及低蛋白高糖饮食者外，常见于肝功能衰竭患者。 【注意事项】 1(试剂中加入氨基硫脲和镉离子，可增进显色强度和色泽稳定性，但仍有轻度褪色现象，(每小时小于5%)。煮沸显色经冷却后，应及时比色。 2(尿液中尿素也可用此法测定，但因浓度高，需先用去离子水作50倍以上稀释。 3(尿素浓度以前习惯用尿素氮mg/dl表示，因为一个尿素分子中有2个氮原子，所以1mmol尿素相当于28mg尿素氮(1mmol/L尿素相当于2.8mg/dL尿素氮);另外还有以尿素氮 2 mmol/L表示，则1mmol/L尿素,2mmol/L尿素氮。世界卫生组织推荐尿素用mmol/L表示，我国卫生部临检中心也已规定一律使用此表示方法，不再用尿素氮一词。 【】 1(本法试剂单一，方法简便，但试剂具毒性和腐蚀性。在标本数量多时加热开始难以达到100?，各管间受热温度也可能不一致，因而本法重复性不佳。若改善加热条件，如采用在水浴锅底部加置高约5mm的网垫，在网垫上加热显色，可使CV由不加网垫时的6.46%降至2.99%。 2(线性上限仅达7.14mmol/L;回收率为96%,102.1%。 3(二乙酰一肟法的主要干扰来自血清中存在的含氮化合物。很多其它化合物在结构中会有尿素的残基，如瓜氨酸、四氧嘧啶和尿囊素，虽然也会产生一种带颜色的产物，但这些化合物在血清中浓度很低，故很少引起明显的干扰。另一些其它的化合物在血清中浓度高，但 71μmol/L、血红蛋白达10g/L这些色素的最大吸收峰不同，因此不产生明显干扰。胆红素达1 均无影响。 实验80 脲酶,波氏比色法测定血清尿素 【原理】 脲酶水解尿素产生2分子氨和1分子二氧化碳，氨在碱性介质中与苯酚及次氯酸钠反应，生成蓝色的吲哚酚阴离子，此过程需用亚硝基铁氰化钠催化反应。蓝色吲哚酚的生成量与尿素含量成正比，在630nm波长处有吸收峰。 【试剂】 1(酚显色剂 苯酚10g，亚硝基铁氰化钠(含2分子水)0.05g，溶于1L无氨去离子水中，存放4?可保存2个月。 2(碱性次氯酸钠溶液 氢氧化钠5g溶于无氨去离子水中，加“安替福明”8ml(相当于次氯酸钠0.42g)，再加无氨去离子水至1L，置棕色瓶内，4?可保存2个月。 3(脲酶贮存液 脲酶(比活性3 000,4 000U/g)0.2g置于20ml 50%(V/V)甘油中，4?可保存6个月。 4(脲酶应用液 脲酶贮存液1ml，加10g/L EDTA-Na溶液(pH6.5)至100ml，4?保存可2 稳定1个月。 5(尿素标准液(5.0mmol/L) 见二乙酰一肟法。 【操作步骤】 按表13-2操作。 3 表13-2 脲酶-波氏比色法操作步骤 加入物(ml) 测定管 标准管 空白管 脲酶应用液 1.0 1.0 1.0 血 清 0.01 — — 尿素标准液 — 0.01 — 无氨去离子水 — — 0.01 混匀，37?水浴15min 酚显色剂 5.0 5.0 5.0 碱性次氯酸钠 5.0 5.0 5.0 混匀，置37?水浴20min。波长630nm，空白管调零，读取吸光度。 【计算】 A测定尿素(mmol/L),，5 A标准 【参考范围】 同二乙酰一肟法(实验79)。 【注意事项】 (本法亦能测定尿液中尿素，但尿中的氨比血清中的氨多1 000多倍，因而测定尿氨时，1 氨必须经过校正，可测定用脲酶处理前尿标本中的氨以校正内源性氨。 2(空气中氨气对试剂或玻璃器皿的污染或使用铵盐抗凝剂可使结果偏高。高浓度氟化物可抑制尿素酶，引起结果假性偏低。 【评价】 1(呈色稳定性 在1h内吸光度的波动仅为0.005，12h后较最初吸光度读数也仅增高0.01,0.02。 (本法批内CV,1.8%，批间CV,2.7%;回收率96.71%,103.35%;与酶偶联法对照2 测定病人标本37例，相关系数(r)为0.972;线性范围较宽，达17.58mmol/L。 3(大气及试剂用水中的氨可明显干扰尿素的测定，使结果假性增高。酶工作液接触大气8d后，测定值上升1.07mmol/L;去离子水明显吸收氨，使测定值明显升高。胆红素在34.2μmol/L以上时尿素测定值有不同程度的降低，在25.65,68.4μmol/L之间时，平均降低0.47mmol/L，但与胆红素含量不成正比。 实验81 酶偶联速率法测定血清尿素 4 【原理】 尿素经脲酶催化水解生成2分子氨及1分子二氧化碳，在谷氨酸脱氢酶催化下，氨与α-酮戊二酸还原型辅酶?作用生成谷氨酸与氧化型辅酶?。还原型辅酶?在340nm波长处有吸收峰，其吸光度下降的速率与待测样品中尿素的含量成正比。其反应式如下: 尿素酶尿素，HO,,,,2NH，CO232 ，GLDH，NH，,,酮戊二酸，NADH，H,,,,谷氨酸，NAD，HO32 【试剂】 1(酶试剂 试剂成分和在反应液中的参考浓度如下: pH8.0Tris-琥珀酸缓冲液 150mmol/L 脲酶 8 000U/L 谷氨酸脱氢酶(GLDH) 700 U/L 还原型辅酶?(NADH) 0.3mmol/L α-酮戊二酸 15mmol/L ADP 1.5mmol/L 目前较多采用双试剂法，脲酶和NADH单独分装可延长保存期限，各试剂公司采用不同方法，使试剂有效期有所不同。 2(尿素标准液(5.0mmol/L) 见二乙酰一肟法(实验79)。 【操作步骤】 按表13-3操作。 表13-3 酶偶联速率法操作步骤 加入物(ml) 空白管 标准管 测定管 0.015 血清 , , 0.015 尿素标准应用液 , , 0.015 无氨去离子水 , , 1.5 1.5 1.5 酶试剂 混匀后立即在附有恒温装置的分光光度计上监测吸光度变化(ΔA/min)。 测定参数 温度37?，波长340nm，平衡时间30s，读数时间30s，样品/反应总体积为1?101。本法适用于各种类型的自动生化分析仪，测定参数可参照仪器和试剂盒说明书。 测定,Amin,空白,Amin尿素(mmol/L),，5【计算】 标准,Amin,空白,Amin 5 【参考范围】 同二乙酰一肟法(实验79)。 【注意事项】 1(在340nm试剂空白对水的吸光度应大于1.00A，试剂浑浊或吸光度低于1.00A的应放弃使用。 2(测定过程中，各种器材和去离子水均应无氨离子污染，防止交叉污染，否则结果偏高。 3(血液标本最好用血清，含NaF的血浆可导致结果偏低。 4(在内源性氨正常时，本法能用于测定尿中的尿素。因为在反应的最初几秒种内内源性氨会很快被耗尽，随后在340nm测定的是由脲酶催化尿素反应生成的氨所引起的吸光度。 【评价】 1(本法批内CV 0.78%，批间CV 2.94%;回收率93.0%,105.3%，线性上限为17.85mmol/L。 2(血红蛋白对测定有一定的干扰，应避免标本溶血。在自动分析仪中测定，因标本被大量稀释，故不受其它含氮化合物、胆红素、血红蛋白及高血脂的干扰。 第二节 血清肌酐测定 肌酐的检测目前多用的仍然是碱性苦味酸比色法，手工分析需去除蛋白后再测定，以避免假肌酐干扰;自动化分析则用碱性苦味酸速率法或两点法即能避开假肌酐影响。近几年发展了酶法，如肌酐酰胺水解酶法、肌酐亚氨水解酶法等，但在临床上应用尚少。 实验82 去蛋白碱性苦味酸法测定血清肌酐 【原理】 血浆或血清标本经除蛋白处理后，肌酐与碱性苦味酸产生Jaffé反应，生成橙红色的苦味酸肌酐复合物，在510nm和520nm间测定吸光度，与肌酐含量成正比。尿液标本可稀释后直接测定。 【试剂】 1(35mmol/L钨酸溶液 (1) 100ml去离子水中，加入1g聚乙烯醇，加热助溶(勿煮沸)，冷却。 (2) 300ml去离子水中，加入11.1g钨酸钠(NaWO 2HO,Mw 329.81)，使完全溶解; 242 (3) 300ml去离子水中，慢慢加入2.1ml浓硫酸，冷却。 于1L容量瓶中，将(1)液加入(2)液中，再与(3)液混匀，加去离子水至刻度，室温稳定1年。 6 2(0.04mol/L苦味酸溶液 苦味酸(Mw229.104)9.3g，溶于500ml 80?去离子水中，冷却至室温，加去离子水至1L。用0.1mol/L氢氧化钠滴定，以酚酞作指示剂。根据滴定结果，用去离子水定容至0.04mmol/L。0.04mol/L氢氧化钠1ml相当于0.04mmol/L苦味酸1ml (9.1644mg)。 3(0.75mol/L氢氧化钠溶液 氢氧化钠30g，加去离子水使其溶解，冷却后用去离子水定容至1L。 4(肌酐标准贮存液(10mmol/L) 113mg肌酐(Mw113.12)用0.1mol/L盐酸溶解，并移入100ml容量瓶内，再用0.1mol/L盐酸定容至刻度。 5(肌酐标准应用液(100μmol/L) 取1ml肌酐标准贮存液，用0.1mol/L盐酸稀释至100ml。 【操作步骤】 1(取血清(或血浆)0.5ml，加入35mmol/L钨酸溶液4.5ml，充分混匀，静置5min，3 000r/min离心10min，取上清液;若为尿液标本用去离子水作1?200稀释。 2(按表13-4操作。 表13-4 去蛋白碱性苦味酸法操作步骤 加入物(ml) 测定管 标准管 空白管 血清无蛋白滤液(或1?200稀释尿液) 3.0 , , 肌酐标准应用液 , 3.0 , 去离子水 , , 3.0 苦味酸溶液 1.0 1.0 1.0 氢氧化钠溶液 1.0 1.0 1.0 混匀后室温15min，波长510nm，空白管调零，读取各管吸光度。 【计算】 A测定血清肌酐(,mol/L),，100 A标准 【参考范围】 男性:44,133μmol/L;女性: 70,106μmol/L 【临床意义】 血液肌酐经肾小球过滤，肾小管既不重吸收，也不分泌，即肾脏对肌酐的排泄能力强，因而肾脏疾病早期血浆肌酐通常不高，在反映肾小球滤过率下降方面，血肌酐比血尿素的灵敏度低。但血肌酐受饮食、运动、激素、蛋白质代谢等因素的影响较少，所以诊断特异性比血尿素好。 【注意事项】 1(据报道碱性肌酐苦味酸复合物的最大吸光度在485nm，过量苦味酸离子存在于反应液 7 中，在波长低于500nm时会产生明显的吸收。 2(反应温度以15,25?为宜，10?以下，会抑制Jaffe反应。温度升高，可使碱性苦味酸溶液显色增深，但测定管较标准管更为明显。 3(呈色后标准管色泽较稳定，但测定管吸光度随时间延长而增加，可能与血标本中存在的非特异性物质有关，故在加显色剂后30min内比色为宜。 4(苦味酸一定要纯，否则需纯化。若含有杂质，则使试剂空白吸光度增加而影响测定结果。 【评价】 1(特异性 血浆中的蛋白质和糖、丙酮、维生素C、丙酮酸、乙酰乙酸等均能与碱性苦味酸发生非特异性反应，反应速率稍慢。红细胞中这类物质最多，约有60%，血浆或血清约20%，尿液约5%。故血清和血浆需制备无蛋白滤液后测定。 (回收率 受无蛋白滤液的pH影响，滤液pH在3,4.5时，回收率为85%,90%，pH2 在2以下时，回收率为100%。 3(线性范围 肌酐含量在1 320μmoL/L以内线性良好。 实验83 不去蛋白速率法测定血清肌酐 【原理】 根据肌酐与苦味酸反应生成桔红色苦味酸肌酐复合物的速度与假肌酐不同，而设置适宜的检测时间。一些假肌酐如乙酰乙酸在20s内已与碱性苦味酸反应，而在20,80s之间，肌酐反应占绝对优势，80s后其它多数干扰物才有较快的反应，故而选择25,60s的反应速率来反映真肌酐的含量。 【试剂】 1(0.04mol/L苦味酸溶液。 2(0.32mol/L氢氧化钠溶液。 3(碱性苦味酸溶液 根据用量，将0.04mol/L苦味酸和0.32mol/L氢氧化钠等体积混合，可加适量表面活性剂如Triton X-100，放置20min以后即可应用。 4(肌酐标准液同除蛋白碱性苦味酸法。 【操作步骤】 采用自动/半自动分析仪速率法检测，按试剂盒说明书操作，或参照以下参数分析:仪器波长510nm，比色杯光径1.0cm，反应温度37?，样品/反应体积,1/11。延迟时间20,30s，测量时间30s。得到标准管ΔA/min和测定管ΔA/min。 8 测定,Amin【计算】 血清肌酐(,mol/L),，100标准,Amin 【参考范围】 男性:53,97μmol/L;女性:44,80μmol/L 【注意事项】 1(必须严格控制反应时间，以尽量避免快速或慢速反应假肌酐物质的干扰。 2(溶血产生的红细胞内非特异性物质将干扰反应。 3(胆红素可引起负偏差。某些全自动生化分析仪，能设置空白速率参数，能去除胆红素负干扰。 【评价】 1(特异性 本法基本上可消除生理浓度的葡萄糖、维生素C和蛋白质等的干扰。但乙酰乙酸,500μmol/L、维生素C,2840μmol/L、丙酮酸,1 140μmol/L时有明显的干扰。高胆红素标本有明显的负干扰，溶血标本也有负干扰，标本应避免溶血。 2(回收试验 96.7%,100.4%，平均98.5%。 3(线性范围 肌酐在1 768μmol/L范围内，线性良好。 实验84 内生肌酐清除率测定 通过测定血和尿中肌酐含量来计算每分钟或24h有多少毫升或升血浆中的肌【原理】 酐通过肾脏被清除，此值称为内生肌酐清除率。肌酐清除率与个体的大小有关，可用体表面积来校正。 【操作步骤】 试验前3天，嘱受检者禁食肉类，避免饮用咖啡或茶，停用利尿剂，避免剧烈运动。适量饮水，使尿量不少于1ml/min。收集24h尿样的同时，抽静脉血3ml。同时测定血、尿肌酐含量。 【计算】 ,尿中肌酐(mol/L)内生肌酐清除率(L/24h) = ×24h尿量(L) 血中肌酐(mol/L), 1000内生肌酐清除率(ml/min) = L/24h× 1440 1.73校正后内生肌酐清除率(ml/min) = 内生肌酐清除率× 2体表面积(m) 体表面积可根据人体体表面积计算图查阅，见图13-1。 【参考范围】 男:105?20ml/min 9 女:95?20 ml/min 【临床意义】 血浆肌酐浓度(S)反映肾小球滤过功能，与肾小球滤过率(GRF)共同用于慢性肾功能不全Cr 的分期: 第一期 (肾功能不全代偿期):S 133,177μmol/L;GRF 50,80ml/min。 Cr 第二期 (肾功能不全失代偿期):S 178,442μmol/L;GRF 50,20ml/min。 Cr 第三期 (肾功能衰竭期):S 443,707μmol/L;GRF 20,10ml/min。 Cr 第四期 (尿毒症期):S?707μmol/L;GRF,10ml/min。 Cr 【注意事项】 1(最常见误差来源是尿液收集时间不准，或部分尿液丢失，因此要准确收集尿液。 要避免尿液在膀胱内潴留造成负误差，即要排空膀胱。 2(收集尿液期间避免作剧烈运动。 3(不同体表面积对结果影响很大，每个个体都应查图得出此值，参见图13-1。 图13-1 人体体表面积计算图 第三节 血清尿酸测定 10 尿酸测定方法可分为尿酸酶紫外法、尿酸酶,过氧化物酶偶联法及磷钨酸法三类。其中以尿酸酶紫外法的分析性能最为优越，是尿酸测定的参考方法。磷钨酸法先用血清或血浆制备无蛋白滤液再进行测定，方法繁琐，需手工测定，现在临床已较少应用。自动化分析可用尿酸酶,过氧化物酶偶联法，无需做无蛋白滤液。 实验85 磷钨酸还原法测定血清尿酸 【原理】 去蛋白滤液中的尿酸在碱性溶液中被磷钨酸氧化生成尿囊素和二氧化碳，磷钨酸被还原为蓝色的钨蓝。钨蓝的生成量与尿酸浓度成正比。 【试剂】 1(160mmol/L磷钨酸贮存液 钨酸钠50g，溶解于去离子水400ml中，加浓磷酸40ml、玻璃珠数粒，回流2h，冷却至室温，用去离子水定容至1L。置棕色瓶中保存。 2(16mmol/L磷钨酸应用液 取磷钨酸贮存液10ml，用去离子水稀释至100ml。 3(0.3mol/L钨酸溶液 钨酸钠(NaWO?2HO，Mw329.81)100g溶解于蒸馏水中，并定242 容至1L。 4(0.33mol/L HSO溶液 于去离子水900ml中加入浓硫酸18.5ml,冷却后用去离子水定24 容至1L。 5(钨酸试剂 于去离子水800ml中加入0.3mol/L钨酸溶液50ml、浓磷酸0.05ml、0.33moL/L HSO50ml，混匀。室温中可稳定数月。 24 6(0.99mol/L NaCO溶液 无水碳酸钠100g，溶于去离子水至1L。置塑料试剂瓶中贮存，3 如有混浊可过滤后使用。 7(6.0mmoL/L尿酸标准贮存液 在60?溶解碳酸锂60mg于去离子水40ml中，加入尿酸(CHON，Mw 168.073)100.9mg，待溶解后冷却至室温，移入100ml容量瓶中，加入甲醛5434 2ml，用去离子水定容。棕色瓶中保存。 8(300μmol/L尿酸标准应用液 取尿酸标准贮存液5.0ml、乙二醇33ml，用去离子水稀释至100ml。 【操作步骤】 按表13-5操作。 11 表13-5 磷钨酸还原法操作步骤 加入物(ml) 空白管 标准管 测定管 0.5 去离子水 , , 0.5 尿酸标准应用液 , , 0.5 血清 , , 4.5 4.5 4.5 钨酸试剂 混匀，室温5min，3 000r/min离心5min 2.5 空白管上清液 , , 2.5 标准管上清液 , , 2.5 测定管上清液 , , 0.5 0.5 0.5 NaCO溶液 3 混匀后静置10min 0.5 0.5 0.5 磷钨酸应用液 混匀，20min后，波长660nm处，空白管调零，读取各管吸光度。 【计算】 A测定血清尿酸(μmol/L), ，300A标准 【参考范围】 男149,416 μmol/L;女89,357μmol/L。 【临床意义】 尿酸测定主要用于各种原因引起的高尿酸血症，以及由此导致的痛风症。 1(原发性高尿酸血症 (1) 原发性肾脏排泄尿酸减少，占原发性中80%,90%，为多基因性常染色体显性遗传所致。 (2) 尿酸产生过多，以从头合成嘌呤过多占主要，占原发性10%,20%，也是多基因性常染色体显性遗传;而特异性酶缺陷，如次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)部分缺乏或完全缺乏等，导致鸟嘌呤和次黄嘌呤不能经补救途径合成嘌呤核苷酸，而使尿酸产生过多者，仅占原发性1%。 2(继发性高尿酸血症 (1) 尿酸排泄减少，为引起肾小球滤过减少和/或肾小管排泌尿酸减少的肾脏疾病所致。 (2)尿酸产生过多，见于骨髓增殖性疾病如各类白血病、多发性骨髓瘤、红细胞增多症， 12 慢性溶血性贫血、全身扩散的癌症、恶性肿瘤化疗或放疗后和严重的剥脱性牛皮癣等。 【注意事项】 1(草酸钾与磷钨酸容易形成不溶性的磷钨酸钾，造成显色液混浊，因此不能用草酸钾作抗凝剂。标本中尿酸在室温可稳定3d;尿液标本冷藏后，可引起尿酸盐沉淀，此时调节pH至7.5,8.0，并将标本加热到50?，待沉淀溶解后再进行测定。 2(尿酸在水中溶解度低(0.06g/L，37?)，但在碱性碳酸盐中易溶解，故配制标准液时可加入碳酸锂或碳酸钠助溶。 3(制备无蛋白滤液时，若滤液酸度过高，可引起尿酸与蛋白共沉淀，pH,3时尿酸回收率明显降低，滤液pH为2.4,2.7，回收率仅为74%,97%;滤液pH3.0,4.3，回收率为93%,103%。 【评价】 (特异性和干扰 血液中许多非尿酸还原性物质，可造成尿酸假性增高。如葡萄糖、谷1 胱甘肽、维生素C、半胱氨酸、色氨酸、酪氨酸等能使结果偏高17.8,29.3μmol/L。谷胱甘肽是血液中干扰最大的物质，当浓度为1.3mmol/L时可使尿酸增高41.65μmol/L。谷胱甘肽主要存在于血细胞内，故以血浆或血清为标本时并无明显干扰。蛋白质的巯基和酚羟基能使磷钨酸还原为蓝色，并产生混浊，故需制备无蛋白滤液。 2(准确度 在沉淀蛋白前加入尿酸标准液，其回收率为96,102%。标准液在150,600μmol/L范围内，测定值与真值的相关系数为0.9999。 3(精密度 日内变异系数为1.2%,3.5%，日间变异系数为2.9%,4.4%。 4(线性范围 在892.5μmol/L线性良好。 实验86 尿酸酶-过氧化物酶偶联法测定血清尿酸 【原理】 尿酸酶氧化尿酸，生成尿囊素和HO，在过氧化物酶催化下，HO使3，52222二氯2-羟苯磺酸(DHBS)和4-氨基安替比林缩合成红色醌类化合物(Trinder反应)，尿酸浓度与波长520nm吸光度成正比。 【试剂】 1(酶混合试剂 尿酸酶 160U/L 过氧化物酶 1 500U/L 4-AAP 0.4mmol/L 13 DHBS 2mmol/L 磷酸盐缓冲液(pH7.7) 100mmol/L 2(尿酸标准液 见磷钨酸还原法(实验85)。 【操作步骤】 按表13-6操作。 表13-6 酶偶联法操作步骤 加入物(ml) 测定管 标准管 空白管 0.1 血清 , , 0.1 标准液 , , 0.1 去离子水 , , 1.5 1.5 1.5 酶试剂 混匀，置室温10min,波长520nm，空白管调零，读取吸光度。 【计算】 A测定血清尿酸(,mol/L),，300 A标准 【参考范围】 同磷钨酸还原法(实验85)。 【评价】 (特异性和干扰 尿酸酶对尿酸催化的特异性高，但POD催化反应特异性较差，而且1 因为血清尿酸浓度较低，因此一些还原性物质如维生素C和胆红素对尿酸测定的负干扰，比起对葡萄糖、胆固醇和甘油三酯更明显。临床上高胆红素标本较多见，若试剂中加入亚铁氰化钾可部分消除这种负干扰。维生素C氧化酶可防止维生素的干扰。 2(尿酸标准浓度在178.6,713.8μmol/L范围内线性良好，回收率94.6%,102.3%;批内和批间CV在224.8μmol/L和792.8μmol/L时均小于5%。 第五节 血氨测定 血氨测定有早期的扩散法和后来的去蛋白波氏比色法、离子交换层析法，及较新发展的氨电极法、酶法和干化学法。扩散法和波氏比色法灵敏度低，准确性和精密度不佳;离子交换层析法需较长时间预处理，氨被吸收到强阳离子交换树脂上后，用波氏比色法测定氨，特异性好，准确度佳，已被作为血氨测定的参考方法;氨电极法准确度和精密度好，但稳定性受多种因素影响，尚难普及使用;酶法的准确度和精密度也好，可在自动生化分析仪测定，但因血氨标本数很少，使酶试剂盒使用周期太长，而存在变质的麻烦;干化学法用指示染料 14 与氨反应，一个标本用一张干试纸片，在干化学分析仪上检测，避免了生化分析仪上酶法测定的上述问。 实验87 酶法测定血浆氨 【原理】 在谷氨酸脱氢酶(GLDH)作用下，血浆中氨与α-酮戊二酸和还原性辅酶? +(NADPH)反应，生成谷氨酸和氧化型辅酶?(NADP)，反应体系中NADPH在340nm吸光度的下降程度与反应体系中氨的浓度呈正比关系。 【试剂】 全部试剂必须用无氨去离子水制备。 1(66.7mmol/L KHPO溶液 取9.12g KHPO溶入无氨去离子水中，定容至1L，4?保2424 存。 2(66.7mmol/L NaHPO溶液 取9.51g NaHPO溶入无氨去离子水中，定容至1L，4?2424 保存。 3(66.7mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH8.0?0.05) 取5ml上述“1”液及95ml上述“2”液， ?保存，稳定3周。 混合，4 4(310mmol/L α-酮戊二酸 取0.45gα-酮戊二酸,溶于5ml无氨去离子水中，用3mol/L NaOH调pH接近5.0时，改用0.1mol/L NaOH调pH至6.80?0.01，以无氨去离子水定容至10ml，4?稳定10天。 5(NADPH贮存液 称取10mgNADPH(,20?、干燥器保存)溶于1ml PBS中，取出50μl,以PBS稀释到5ml为工作液，以PBS调零，1cm光径，340nm波长读NADPH工作液的吸光度，计算NADPH贮存液中的实际浓度: A340 NADPH(mmol/L),，1006.22 6.22为NADPH的毫摩尔吸光系数，据上式计算结果确定制备GLDH工作液中加入NADPH贮存液的量，使达到149μmol/L。 149mol/L，需配GLDHml数(50),需用NADPH贮存液ml数, NADPH贮存液实际浓度mmol/L，1000 6(谷氨酸脱氢酶工作液 根据GLDH酶制品(,20?、干燥器保存)的比活，称出酶活力为992单位的相应量，称入ADP(,20?、干燥器保存)15mg,吸入计算量的NADPH贮存液，以PBS稀释到50ml，4?保存稳定7d。 7(氨标准贮存液(100mmol/L) 取硫酸铵1,2g于100,110?烘2h，置干燥器中冷却称取660.7mg，溶于去氨水中定容到100ml，4?保存。 15 8(氨标准应用液 用无氨去离子水将标准贮存液稀释成100μmol/L。 【操作步骤】 按表13-7操作。 表13-7 酶法操作步骤 加入物(ml) 空白管(B) 标准管(S) 测定管(U) 1.5 1.5 1.5 GLDH工作液 0.3 去氨水 — — 0.3 标准应用液 — — 0.3 血浆/血清 — — 37?水浴10min 0.06 0.06 0.06 α-酮戊二酸 混匀，波长340nm，于10s时读取吸光度A,于70s时读取吸光度A;求各管ΔA,A121,A。 2 【计算】 ,A,,AUB 血浆氨(μmol/L),，100,A,,ASB ΔA , A-A 10sec70sec 【参考范围】 18,72μmol/L (30.7,122.6μg/dl)。 【临床意义】 1(肝昏迷的监测 正常情况下，氨在肝脏转变为尿素，严重肝脏疾病时，氨不能从循环中清除，引起血氨增高。高血氨有神经毒，引起肝性脑病(肝昏迷)。 2(儿科Reye综合征的诊断 该症有严重低血糖、大块肝坏死、急性肝衰并伴有肝脂肪变性，在肝酶谱增高前，即见血氨增高。 【注意事项】 1(反应体系加入ADP可稳定GLDH，加快反应速率。NADPH作为辅酶较NADH可缩短反应时间。 2(α-酮戊二酸加入前应置37?水浴10min为血浆中LDH、AST等内源性物质消耗NADPH提供反应时间。 3(血浆氨含量甚微，要防止环境及所用器皿中氨污染。 4(血浆氨测定结果的准确性在很大程度上取决于标本收集是否符合要求。静脉采血后，与EDTA-Na抗凝剂充分混匀后立即置冰水中，尽快分离血浆，加塞于2,4?保存，在2,2 3h内分析;,20?可稳定24h。久置的血液会使血氨急剧升高，因为血浆中多肽和谷氨酰胺 16 易水解释放出NH。显著溶血标本不能用，因红细胞中氨浓度为血浆的2.8倍。 3 【评价】 1(本法特异性好，回收率97.7%,102.7%，批内CV3.4%，线性范围0,150μmol/L。 2(本法方法简便，可自动化。但由于血氨测定标本较少，使得一个试剂盒的使用周期很长，容易超过其有效期，由此影响到实用性，因而实际上临床生化实验室可能少用该法，而较多的是在急诊实验室应用干化学法测定血氨。 实验88 干化学法测定血浆氨 【原理】 干化学法需干片式生化仪及NH干试剂片。干试剂片的结构从上到下一般分3 为扩散层、试剂层、显色层和支持层。待测标本定量加到干测试片上，分布于扩散层，其中的氨通过半透膜进入试剂层，与指示染料反应产生颜色产物，其颜色强度与标本中氨含量成正比，由反射光度计在605nm进行比色分析。反应式如下: NH + Bromphenol Blue( 氨指示染料 ) Blue Dye 3 【试剂】 1(氨干试剂片 有效成分成是溴酚蓝(Bromphenol Blue)，其它成分包括表面活性剂、缓冲成分和保湿剂。由干化学分析仪厂家提供。 2(氨标准品 由干化学分析仪厂家提供。 【操作步骤】 不同仪器方法有所不同，应根据仪器和试剂说明书操作。分析参数举例:标本10μl，反应时间5min，波长605nm。 【计算】 由仪器定标后，标本检测结果自动显示。 【参考范围】 9,33μmol/L(根据仪器说明书。各实验室应当确定自己服务人群的参考范围)。 【注意事项】 1(标本由肝素钠或肝素锂抗凝，标本应保存于冰中，尽快分离血浆，加塞于2,4?保存，在1h内分析。血清标本不宜用，因血凝过程中有氨产生。 2(因为干化学法测定尿素时，也有氨产生，所以尿素和氨不能同时进行保温反应和检测(干化学分析仪一般可同时内置多种干试纸片进行多个项目的测定)。当血氨紧接于尿素检测时，尿素14.3mmol/L可使血氨增加14μmol/L。 【评价】 17 1(精密度 血氨浓度为413.3、262.6、100.3和93.5μmol/L时，CV值分别为4.5%、4.3%、9.6%和10.6%。 2(准确度 与GLDH酶法相比，干化学法(μmol/L),1.02GLDH法(μmol/L),5.6，相关系数r,0.989。血糖浓度超过33.3mmol/L时，血氨测定结果将下降8,40μmol/L。 第六节 血清总胆红素和结合胆红素测定 血清总胆红素及结合胆红素测定的传统方法和目前仍广泛使用的方法是重氮试剂法，我国推荐其中的改良J-G法，但因不能自动化而使其应用受限，故而许多厂家生产甲醇法和二甲亚砜法试剂。胆红素氧化酶法特异和准确，但酶制剂来源困难，价格高，使用尚很少。直接分光光度法主要用于3个月龄前的新生儿血清总胆红素测定，微量而快速，但自动化的重氮反应法同样微量快速，故直接分光光度法现已少用。 实验89 改良J-G法测定血清总胆红素和结合胆红素 【原理】 血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，产生偶氮胆红素;非结合胆红素须有加速剂咖啡因-苯甲酸钠-醋酸钠作用，其分子内氢键破坏后才能与重氮试剂反应，也产生偶氮胆红素。本法重氮反应pH6.5，最后加入碱性酒石酸钠使紫色偶氮胆红素(吸收峰530nm)转变成蓝色偶氮胆红素，在600nm波长比色，使检测灵敏度提高。 【试剂】 1(咖啡因-苯甲酸钠试剂 称取无水醋酸钠41.0g，苯甲酸钠38.0g，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na)0.5g，溶于约500ml去离子水中，再加入咖啡因25.0g，搅拌使溶解(加入咖啡因2 后不能加热溶解)，用去离子水补足至1L,混匀。滤纸过滤，置棕色瓶，室温保存。 2(碱性酒石酸钠溶液 称取氢氧化钠75.0g，酒石酸钠(NaCHO•2HO)263.0g，用去24462离子水溶解并补足至1L，混匀。置塑料瓶中，室温保存。 3(72.5mmol/L亚硝酸钠溶液 称取亚硝酸钠5.0g，用去离子水溶解并定容至100ml，混匀，置棕色瓶，冰箱保存，稳定期不少于3个月。作10倍稀释成72.5mmol/L，冰箱保存，稳定期不少于2周。 4(28.9mmol/L对氨基苯磺酸溶液 称取对氨基苯磺酸(NHCHSOH•HO)5.0g，溶于26432800ml去离子水中，加入浓盐酸15ml，用去离子水补足至1L。 5(重氮试剂 临用前取上述亚硝酸钠溶液0.5ml和对氨基苯磺酸溶液20ml，混匀即成。 18 6(5.0g/L叠氮钠溶液。 7(胆红素标准液 (1) 目前一般用游非结合胆红素配制标准液，此标准品须用含白蛋白的溶剂配制，常用人混合血清，对此血清的要求如下: 收集无溶血、无黄疽、无脂浊的新鲜血清，混合，必要时可用滤菌器过滤。取过滤后的血清1ml，加入新鲜0.154mmol/L NaCl溶液24ml，混合。在414nm波长，1cm光径，以0.154mmol/L NaCl溶液调零点，其吸光度应小于0.100;在460nm的吸光度应小于0.04。 (2) 配制标准液的胆红素须符合下列标准:纯胆红素的氯仿溶液，在25?条件下，光径1.000?0.001cm，波长453nm，摩尔吸光系数应在60 700?1 600范围内;改良J-G法偶氮胆红素的摩尔吸光系数应在74 380?866。 (3) 胆红素标准贮存液(171μmol/L) 准确称取符合要求的胆红素10mg，加入二甲亚砜1ml，用玻璃棒搅拌，使成混悬液。加入0.05mol/L碳酸钠溶液2ml，使胆红素完全溶解后，移入100ml容量瓶中，以稀释用血清洗涤数次并入容量瓶中，缓慢加入0.1mol/L盐酸2ml，边加边摇(勿用力摇动，以免产生气泡)。最后以稀释用血清定容。配制过程中应尽量避光，贮存容器用黑纸包裹，置4?冰箱3d内有效，但要求配后尽快作标准曲线。 【操作步骤】 1(样品的测定 按表13-8操作。 表13-8 改良J-G法操作步骤 加入物(ml) 总胆红 素管 结合胆红素管 对照管 0.2 0.2 0.2 血清 1.6 1.6 咖啡因苯甲酸钠试剂 , 0.4 对氨基苯磺酸溶液 , , 0.4 0.4 重氮试剂 , 每加一种试剂后混匀，总胆红素管置室温10min，结合胆红素管置37?1min 0.05 叠氮钠溶液 , , 1.55 咖啡因苯甲酸钠试剂 , , 1.2 1.2 1.2 碱性酒石酸钠溶液 混匀后，波长600nm，对照管调零，读取吸光度，在标准曲线上查出相应的胆红素浓度。 2(标准曲线制作 按表13-9 稀释胆红素贮存液。 19 表13-9 系列胆红素标准液的配制 加入物(ml) 管 号 1 2 3 4 5 胆红素标准贮存液 2.0 0.4 0.8 1.2 1.6 1.6 1.2 0.8 0.4 稀释用血清 , 34.2 68.4 103 137 171 相当于胆红素浓度(μmol/L) 混匀(不可产生气泡)，按总胆红素测定法操作。每一浓度作3个平行管，并分别做标准对照管，用各自的标准对照管调零，读取标准管的吸光度。配制标准液用的溶剂血清中尚有少量胆红素，同样测定后得一吸光度值。每个标准管的吸光度值均应减去此吸光度，然后与相应胆红素浓度绘制标准曲线。 【参考范围】 血清总胆红素:5.1,19μmol/L(0.3,1.1mg/dl); 血清结合胆红素:1.7,6.8μmol/L(0.1,0.4mg/dl)。 【临床意义】 1(血清总胆红素测定的意义 (1) 有无黄疸及黄疸程度的鉴别。 (2) 肝细胞损害程度和预后的判断 胆红素浓度明显升高反映有严重的肝细胞损害。但某些疾病如胆汁淤积型肝炎时，尽管肝细胞受累较轻，血清胆红素却可升高。 (3) 新生儿溶血症 血清胆红素有助于了解疾病严重程度。 (4) 再生障碍性贫血及数种继发性贫血(主要见于癌或慢性肾炎引起)，血清总胆红素减少。 2(血清结合胆红素测定的意义 结合胆红素与总胆红素的比值可用于鉴别黄疸类型。 (1) 比值,20% 溶血性黄疸，阵发性血红蛋白尿，恶性贫血，红细胞增多症等。 (2) 比值40%,60% 肝细胞性黄疸。 (3) 比值,60% 阻塞性黄疸。 但以上几类黄疸，尤其是(2)、(3)类之间有重叠。 【注意事项】 1(胆红素对光敏感，标准液及标本均应尽量避光保存。 2(轻度溶血对本法无影响，但严重溶血时可使测定结果偏低。其原因是血红蛋白与重氮试剂反应形成的产物可破坏偶氮胆红素，还可被亚硝酸氧化为高铁血红蛋白而干扰吸光度测 20 定。血脂及脂溶色素对测定有干扰，应尽量取空腹血。 3(叠氮钠能破坏重氮试剂，终止偶氮反应。凡用叠氮钠作防腐剂的质控血清，可引起偶氮反应不完全，甚至不呈色。 4(本法测定血清总胆红素，在10,37?条件下不受温度变化的影响。呈色在2h内非常稳定。 5(标本对照管的吸光度一般很接近，若遇标本量很少时可不作标本对照管，参照其他标本对照管的吸光度。 6(胆红素大于342μmol/L的标本可减少标本用量，或用0.154mmol/L NaCl溶液稀释血清后重测。 7(结合胆红素测定在临床上应用很广，但至今无候选参考方法，国内也无推荐方法。方法不同，反应时间不同，结果相差很大。时间短、非结合胆红素参与反应少，结合胆红素反应也不完全;时间长，结合胆红素反应较完全，但一部分非结合胆红素也参与反应。这是一个很难权衡的问题。在没有结合胆红素标准液的情况下，问题更复杂。 【评价】 1(灵敏度和线性范围 本法摩尔吸光系数为74 380，标本中胆红素17.1mol/L时吸光度约0.08(血清用量已达0.2m1)，正常血清总胆红素多数小于17.1mol/L，手工法测定显得灵敏度很不够。在病理血清结合胆红素增高在17.1μmol/L以下时，灵敏度同样不够。线性上限虽可做到1.7吸光度，但手工法在胆红素超过171μmol/L时，吸光度已达0.8，应减量操作。分析仪检测灵敏度高得多，最低吸光度可测至0.02，线性上限可达342μmol/L;但本法需3次加试剂，一般无法在全自动生化分析仪中使用。 2(精密度 正常浓度时精密度较差，特别是批间CV，据报道为14%,20%;而胆红素342μmol/L时，精密度佳，批内CV为0.95%，批间CV5%,10%。 3(重氮反应法测定胆红素，也可用甲醇(M-E法)或二甲亚砜等作加速剂，可做成单一试剂，反应pH和显色pH都在酸性，560nm波长比色，易于自动化。但灵敏度比改良J-G法略低，M-E法摩尔吸光系数为60 500，Hb干扰较明显，Hb,1g/L时，需用样品空白校正。 4(本法灵敏度高，且可避免其它有色物质的干扰，是测定血清总胆红素的参考方法，但不能自动化分析是其缺点。现有些商品试剂盒称咖啡因法或J-G法，但不加碱性酒石酸，即不在碱性条件下显色，其灵敏度和特异性不如上述方法。 21 实验90 胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素 【原理】 胆红素呈黄色，在450nm附近有最大吸收峰。胆红素氧化酶(BOD)催化胆红素氧化，随着胆红素被氧化，A下降，下降程度与胆红素被氧化的量相关。在pH8.0条450nm 件下，未结合胆红素及结合胆红素均被氧化，因而检测450nm吸光度的下降值可反映总胆红素含量;加入SDS及胆酸钠等阴离子表面活性剂可促进其氧化。 在pH3.7,4.5缓冲液中，BOD催化单葡萄糖醛酸胆红素(mBc)、双葡萄糖醛酸胆红素(dBc)及大部分δ胆红素氧化，非结合胆红素(Bu)在此pH条件下不被氧化。用配制于人血清中的二牛磺酸胆红素(ditaurobilirubin，DTB)作标准品，检测此条件下450nm吸光度的下降值可反映结合胆红素的含量。 【试剂】 1(0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.2) 称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)1.211g，胆酸钠172.3mg,十二烷基硫酸钠(SDS)432.6mg，溶于去离子水90ml中，在室温(25,30?)用1mol/L盐酸调节H至8.2(约用6ml)，再加蒸馏水至100ml，置冰箱保存，此液含4mmol/L胆酸钠、15mmol/L SDS。 p 2(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH4.5)。 3(BOD溶液 如系冻干品，按说明书要求复溶，但复溶后冰箱保存不宜过长(约可保存1周)，如系液体(可能含有甘油)，置4?冰箱可保存较长时间，BOD贮存溶液的酶活性一般在数千至1万,2万U/L，BOD工作液酶活性可按反应液中BOD终浓度达0.3,1.0U/ml计算。 4(总胆红素标准液(342μmol/L) 按胆红素测定J-G法中方法配制，或市售合乎要求的标准液。 5(结合胆红素标准液 将DTB配于胆红素浓度可忽略不计的人血清中，或用冻干品按说明书要求重建。配制后分装于聚丙烯管内，,70?保存，可稳定6个月。冻干品未重建前置低温中，至少稳定1年。 【操作步骤】 总胆红素和结合胆红素测定分别按表13-10和表13-11进行。 表13-10 酶法测定总胆红素操作步骤 加入物(ml) 标准空白管(SB) 测定空白管(UB) 标准管(S) 测定管(U) 0.05 0.05 血清 , , 0.05 0.05 总胆红素标准液 , , 1.0 1.0 1.0 1.0 Tris缓冲液(37?) 22 0.05 0.05 去离子水 , , 0.05 0.05 BOD工作液 , , 表13-11 酶法测定结合胆红素操作步骤 加入物(ml) 标准空白管(SB) 测定空白管(UB) 标准管(S) 测定管(U) 0.05 0.05 血清 , , 0.05 0.05 DTB标准液 , , 1.0 1.0 1.0 1.0 PH4.5磷酸盐缓冲液 0.05 0.05 去离子水 , , 0.05 0.05 BOD工作液 加入BOD工作液后立即混匀，置37C水浴5min，用分光光度计，在450nm波长，去离子水调零，读取各管吸光度(A)。用于对照管的比色杯与非对照管的比色杯不得混用。 【计算】 A,AUBU血清总胆红素(μmol/L),×C总胆红素 A,ASBS A,AUBU血清结合胆红素(μmol/L),×C DTBA,ASBS 【参考范围】 与重氮法相似，郭建报道总胆红素为10.26?4.10μmol/L(n=97)，结合胆红素为2.57?2.56μmol/L(n=95)。 【注意事项】 1(BOD浓度的选择 文献报道BOD在反应液中终浓度为0.18,1.14U/ml。国内有些厂家的试剂盒，BOD在反应液中终浓度按标示值计算很高，但反应速度很慢。选择BOD浓度时，可根据所用制品在测定高胆红素血清标本或342μmol/L标准液的反应速度，即能否在5min反应完全而确定。由于测定结合胆红素时反应液pH偏离BOD的最适范围，因此要求BOD有较高的浓度，一般使反应液中终浓度不低于0.5U/ml。 2(Hb在1.0g/L以下时，对结果影响不大。每升血清中分别加入维生素C 0.1g、半胱氨酸0.5g、谷胱苷肽0.5g、尿素0.5g、尿酸0.5g、葡萄糖10g、乙碘醋酸1g、白蛋白40g对总胆红素及结合胆红素测定几乎无干扰。每升血清中加L-多巴0.15g、α-甲基多巴0.15g使结果偏低约10%。 3(BOD的最适pH 在pH7.3,9.0之间酶活性的pH曲线变化幅度不大，但最适pH为8.0, 23 8.2。但在测定结合胆红素时，为防止Bu反应，选择pH为4.5，这时样本中mBc、dBc及大部分δ胆红素被氧化;pH低于4.0时，血清样本易发生混浊，严重干扰测定结果;郭健等报道，用枸橼酸盐、磷酸盐、硼酸盐和碳酸盐缓冲液比较时，枸橼酸盐缓冲液 (0.1mol/L，pH5.0)效果最好。 4(结合胆红素标准品 合成的二牛磺酸胆红素(DTB)为水溶性化合物，可与重氮化氨基苯磺酸直接反应，产生吸收光谱与偶氮胆红素相似的偶氮色素。用J-G法测得的摩尔吸光系数与Bu相同。20世纪80年代后期以来，国外结合胆红素测定大多用DTB作标准品。DTB反应前后的吸收光谱与Bu相似，最大吸收峰也在450,460nm之间。 5(混浊问题 Doumas报道，成人黄疸血清或肝素抗凝血浆，反应15min几乎均产生混浊而影响结果。在磷酸盐缓冲液中加入尿素可防止混浊。经电泳证明混浊是因球蛋白及纤维蛋白原沉淀引起。应避免使用肝素抗凝。 (光对BOD法测定结合胆红素有较大影响。经过蓝光治疗的新生儿黄疽血清，用BOD 6 法测定结合胆红素结果远比J-G法高，属假性增高。新生儿血清在体外经蓝光照射后，用高效液相色谱法(HPLC)未检出结合胆红素，重氮法结果通常保持不变，但BOD法结果显著增高。蓝光照射能产生光胆红素，其在 pH3.7易被BOD氧化。此种假性增高对临床监控新生儿黄疽及鉴别生理性黄疽与初期的病理性黄疽有影响。 【评价】 1(BOD法特异性高，手工操作简便快速，也适合于自动生化分析仪操作。结合胆红素的BOD法测定，解决了长期以来用重氮反应法测定总胆红素和结合胆红素条件的不同，包括试剂种类和浓度的不同，以及结合胆红素结合胆红素反应时间不同造成测定值变异大的问题，提高了结合胆红素分析的特异性和准确度。 2(本法测定结合胆红素，灵敏度和线性上限均较重氮反应法高。但手工分析因受分光光度计检测范围限制，只能做到342μmol/L左右，分析仪测定上限可到427.5μmol/L，最高达598.5μmol/L。但需受BOD用量的限制。 3(由于BOD来源困难，价格高，目前尚无国产试剂盒提供，而进口试剂则价高，故此法尚很少在临床实验室应用。 附1:二甲亚砜法测定总胆红素 【原理】 在加速剂二甲亚砜(DMSO)作用下，胆红素与重氮试剂反应产生偶氮胆红素，560nm波长比色，其吸光度与胆红素浓度成正比。 【试剂】 24 1(试剂A 去离子水285ml，加入1mol/L盐酸165ml混合，加5g对氨基苯磺酸，溶解，逐渐加入550ml DMSO，混匀，静置过夜，如有浑浊或沉淀，过滤后使用，置棕色瓶，避光保存，变红后弃用。 2(试剂B 称取0.5g亚硝酸钠，用去离子水500ml溶解，棕色瓶冰箱保存。 3(胆红素标准液 同改良J-G法(实验89)。 【操作步骤】 1(手工法 按表13-12操作。 表13-12 二甲亚砜法操作步骤 加入物(ml) 测定管 标准管 空白管 血清 0.2 标准液 0.2 去离子水 0.2 3.0 3.0 3.0 试剂A 0.05 0.05 0.05 试剂B 混匀，37?水浴5min，波长560nm，空白调零，读取吸光度。 2(自动分析法 按试剂盒和仪器说明书要求设置分析参数，一般采用双试剂法检测。不同厂家试剂盒的配方有差异，应按照试剂盒说明书设定反应时间和样品体积比。 【计算】 A测定,，C血清总胆红素(μmol/L) 标准A标准 【注意事项】 1(试剂A、B临用前可按3:1比例混合成单一试剂使用。显色液稳定1h，应及时比色。 (轻度脂血和溶血标本对结果影响不明显，重度脂血、溶血标本须做标本空白。 2 3(二甲亚砜是胆红素的优良溶剂，可破坏非结合胆红素的氢键，加速胆红素与重氮试剂的作用;二甲亚砜在试剂甲中的浓度直接影响反应速度，市售各试剂盒标示浓度为30%、40%、50%不等，上述方法为55%，可使反应在37?下5min完成。二甲亚砜能与水任意混合，又可溶解蛋白质，使蛋白质的影响降至最低程度。 附2:矾酸氧化法测定总胆红素和结合胆红素 【原理】 在pH3.0附近，表面活性剂和钒酸作用于血清总胆红素，将其氧化成胆绿素，使胆红素所特有的黄色减少，由此测定钒酸作用前后450nm吸光度差求出血清中总胆红素的浓度。在pH3.0附近，当试剂中表面活性剂改变时，钒酸只与血清中结合胆红素作用，使之氧化成胆绿素，同样测定450nm吸光度下降值求出血清中结合胆红素的浓度。 【试剂】 1( 试剂1 pH3.0缓冲液。总胆红素测定和结合胆红素测定之缓冲液不同。 25 2( 试剂2 矾酸溶液。总胆红素和结合胆红素测定用之试剂相同。 【操作步骤】 1(自动分析法 总胆红素和结合胆红素测定参数相同:标本10μl，R1 240μl，R2 60μl，主波长450nm，次波长546nm，反应温度37?，5min时加入R2;加入R2前读吸光度A，加入R2反应5min后再读吸光1 度A。 2 2(手工法 可参照自动分析法条件操作。不设次波长。 【计算】 A,A测定测定21,，C血清总胆红素或结合胆红素(μmol/L) 标准A,A标准标准21 【评价】 1(本法5min反应完全。试剂在4?至少一年内稳定。 2(精密度 总胆红素浓度分别为15.73μmol/L和155.78μmol/L，批内CV为0.82%和0.44%，日间CV为2.92%和1.63%;结合胆红素浓度分别为4.79μmol/L和121.9μmol/L，测得批内CV为2.91%和0.35%，日间CV为3.0%和2.84%。 3(线性 总胆红素在684μmol/L范围内线性较好，结合胆红素在线性在205μmol/L内。 4(准确度 用40份TB含量不同的病人标本(7.01,411.25μmol/L)，以钒酸氧化法和改良J-G法同时测定，结果Y=1.042X,0.291(Y为钒酸氧化法,X为改良J-G法)，r=0.9996，两法有较好的一致性。 5(干扰 血红蛋白对结合胆红素无干扰，3.0g/L以下时对总胆红素无干扰，叠氮钠10g/L以下无干扰。 第六节 总胆汁酸测定 血清总胆汁酸(TBA)测定有层析法，放免法和酶法等，酶法中又可分酶荧光法、酶比色法和酶循环法。其中酶比色法可用于手工操作，亦可自动分析，应用较广。近年发展的酶循环法灵敏度高、特异性好、是一个有前途的方法。 实验91 酶比色法测定总胆汁酸 【原理】 在3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)作用下，各种胆汁酸C3上α位的烃基(3α-OH)脱氢形成碳基(3α=O)。同时NAD还原成NADH。随后，NADH上的氢由黄递酶催化转移给碘化硝基四氮唑(INT)，产生红色的甲臢。甲臢的产量与总胆汁酸(TBA)成正比，在500nm波长比色。反应式如下: 3,,HSD++,,,,,3α-羟基胆酸 + NAD 3-氧代胆酸 + NADH + H 黄递酶++,,,,NADH + H + INT NAD + 甲臢 (红色) 26 【试剂】 +1(试剂? 黄递酶 1 000U，NAD 1 mmol，碘化硝基四氮唑(INT)0.5 mmol, 丙酮酸50 mmol溶于0.1mol pH 7.5 的磷酸缓冲液1 L中，加表面活性剂适量。 2(试剂? 3α- 羟类固醇脱氢酶(3α-HSD) 2 000U溶于0.1mol pH 7.5的磷酸缓冲液中1 L中。 3(终止液 1 mol/L HCl。 4(标准液(50μmol/L) 24.38 mg甘氨胆酸溶于1 L经透析的混合血清中。 【操作步骤】 1(手工法按表13-13操作 表13-13 酶比色法操作步骤 加入物(ml) 测定 测定对照 标准 标准对照 血清 0.1 0.1 标准液 0.1 0.1 试剂? 0.3 0.3 0.3 0.3 试剂? 0.1 0.1 去离子水 0.1 0.1 混匀，37?水浴10min，加终止液0.1ml，摇匀，500nm波长，以水校零，读取各管A值。 2(自动分析法 一般无法做对照管，而是设置两点终点法，读取前后两个吸光度A和1A。具体按说明书要求。 2 A,A测定测定对照【计算】 手工法:TBA(μmol/L) =×C 标准A标准,A标准对照 A测定2,A测定1 自动分析法:TBA(μmol/L) =×C 标准A标准2,A标准1 【参考范围】 60名健康成人的空腹TBA为4.9?2.38μmol/L,中餐后2h TBA为8.22?2.91μmol/L。 【临床意义】 胆汁酸的生成和代谢与肝脏生理关系密切，血清胆汁酸水平是反映肝实质损伤的一个重要指标。血清总胆汁酸(TBA)测定对肝病的诊断有十分重要的价值。 1(急性肝炎 急性肝炎时血清TBA显著增高，可达正常人水平的10,100倍，甚至更高，急性肝炎初愈患者血清TBA由最初的高值几乎与AST在同一时间降至正常水平，若持续不降或反而上升者则有发展为慢性的可能。 2(慢性肝炎 慢性肝炎分为轻度、中度和重度三个类型，空腹总胆汁酸(F-TBA)和餐后 27 2h总胆汁酸(P-TBA)测定对慢性肝炎的分型、监测、预后及疗效有着重要意义。 3(肝硬化 肝硬化时，肝脏对胆汁酸的代谢能力减低，血清TBA在肝硬化的不同阶段均增高，增高幅度一般高于慢性活动性肝炎。即使在肝硬化晚期亦如此。当肝病活动降至最低时，胆红素、转氨酶及碱性磷酸酶等指标转为正常，血清TBA仍维持在较高水平。 4(乙醇性肝病 乙醇性肝病血清TBA可增高，当乙醇性肝病(包括肝硬化)发生严重的肝损伤时，血清TBA明显增高，而轻、中度损伤增高不明显。有报道认为，血清TBA测定对乙醇性肝病肝细胞损伤诊断的可信度和灵敏度远优于各种酶学检查和半乳糖耐量试验等指标，甚至建议将血清TBA再加上β-氨基己糖苷酶作为乙醇性肝病的诊断指标。有人认为，餐后60min-TBA测定对乙醇性肝病诊断更有意义。 5(中毒性肝病 在中毒性肝病时血清TBA也将异常。 6(胆汁淤积 血清TBA测定对胆汁淤积的诊断有较高灵敏度和特异性。肝外胆管阻塞及肝内胆汁淤积包括急性肝炎、初期胆管性肝硬化、新生儿胆汁淤积、妊娠性胆汁淤积等均可引起TBA增高。在胆管阻塞的初期，胆汁分泌减少，使血清中的TBA显著增高，且在阻塞的不同阶段几乎保持不变;而血清胆红素水平则随不同阶段而变化。胆汁淤积患者肝组织中的胆汁酸含量明显高于正常人。肝外阻塞经引流缓解后，血清TBA水平迅速下降，而其它指标则缓慢恢复。 所有肝病中，餐后血清TBA水平及异常率均比空腹时测定更灵敏，有人甚至认为餐后测定TBA对各种肝病的诊断灵敏度和特异性高达100%，而同时测定空腹血清胆汁酸有40%的患者在正常范围。急性肝炎是否转为慢性，连续监测餐后血清TBA可以观察慢性过程，慢性活动性肝炎是否发生纤维化改变，连续监测餐后血清TBA可以了解纤维化过程，不做肝活检即可获得肝损伤的程度。 【注意事项】 1(由于血清中TBA含量低，样品中存在干扰物质的影响相对就大，乳酸脱氢酶(LD)是主要的干扰物质，由LD反应中生成的NADH往往比TBA反应中生成的量要大得多，因此测定前去除血清中LD的影响至关重要，方法有:血清67?加温30min;加草氨酸作为LD的封闭剂;碱或酸处理;用丙酮酸钠抑制LD活性。上述5种方法中丙酮酸钠法最好，可免去前处理步骤，直接加入反应体系，不影响体系的pH，且对反应无干扰。 2(血清中还存在其它脱氢酶(有相应底物存在时)和还原性物质，如不除去，测定结果会偏高。据无选择的40例肝功能标本的测定结果来看，平均干扰相当于TBA 18μmol/L，范围在5.5,45μmol/L之间。因此自动分析成双试剂二步法，样品先和不加3α-HSD的体系孵育，使样品中的干扰物质先反应，然后再加入3α-HSD，启动TBA反应。 28 3(脂肪酶、胆固醇(包括HDL-C、LDL-C)和甘油三酯测定试剂中均加有胆酸盐，自动分析时会引起携带污染，必须引起注意。某些先进的仪器可以设定试剂针、样品针和反应杯的补充清洗程序，亦可将TBA编排在上述有污染的项目前测定。对某些不具备上述功能的仪器，最好将TBA单批测定。 4(试剂中加适量表面活性剂可防止甲臢 沉淀。 【评价】 1(手工法测定TBA需做标本、标准的对照管，样品和试剂用量大，试剂价格高，费用昂贵。分析仪测定能避免以上缺点，但去干扰能力不如手工法分析。 2(血清TBA、尤其是正常血清TBA浓度低，因而检测灵敏度至为关键，本法测定TBA50μmol/L(标本/试剂比为1:10)的标准液，A为0.1左右。所以低浓度时重复性较差，500nm(1cm) 对31μmol/L和157μmol/L的样品各1份，用手工法每天上下午双份测定，测10天，结果总CV分别为5.46%和2.79%。。本法线性上限为300μmol/L。 附:酶循环法测定胆汁酸 【原理】 + 硫代- NAD 硫代- NADH ( 吸收峰 395 - 415nm) 胆汁酸 3α - 酮类固醇 3α - HSD + NAD NADH 在一定的反应时间内，酶循环产生的硫代-NADH量不断增加，在405nm测得的吸光度与样品中胆汁酸含量成正比。 【试剂】 1(试剂? 硫代-NAD 2mmol/L，Good’s缓冲液 200mmol/L，pH7.0。 2(试剂? 3α-HSD 15kU/L，NADH 3mmol/L,Good’s缓冲液200mmol/L,pH8.0。 3(标准液 同比色法。 【操作步骤】 自动化分析法。反应类型:速率法;反应温度:37?;波长:405nm(主)/660nm(次);样品3μl;试剂?200μl;3,5min后加试剂?50μl,，延迟时间1min,读数时间4min。 【计算】 A测定2,A测定1TBA(μmol/L) =×C 标准A标准2,A标准1 【参考范围】 40名健康成人的空腹TBA为3.71?2.98μmol/L。 29 【注意事项】 血清TBA测定的酶循环法是一种通过脱氢酶-辅酶体系来循环底物的方法，因此要求?这种酶对硫代-NAD和NADH都应有高亲和力;?反应体系的pH和缓冲液应允许正反应(底物氧化)和逆反应(底物还原)都能进行;?还要求硫代-NAD和NADH浓度比例合适。这些条件使反应的循环速率相当快(约100次/min),在一定的反应时间内通过胆汁酸的重复反应来增加硫代-NADH的量,提高反应灵敏度。 【评价】 1(干扰试验结果表明 胆红素,850μmol/L，血红蛋白,5g/L，抗坏血酸,2.84mmol/L，乳酸,24mmol/L，乳酸脱氢酶,10 000U/L时，偏差均,?5%，说明几乎不存在内源性干扰,但外源性干扰如仪器的携带污染同样存在,可用比色法中阐述的方法排除。 2(本法灵敏度 TBA50μmol/L(标本/试剂体积比为1:83)的样品，A为0.22左右。Beckman 410nm(1cm)DU-640分光光度计手工操作的批内CV,2.0%，总CV,4.0%，日立7170自动分析仪的批内CV,1.5%。本法(y)与比色法(x)比较y=0.921x–1.426，r=0.9982，n=64。本法线性上限180μmol/L。 (陈筱菲) 30