TUNEL染色(1)

相关疾病：∙产品名称：罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒英文名称：Tunel产品货号：产品规格：50T试剂级别：试剂级产品产地：USA产品商标：RocheInsitucelldeathdetectionkit-POD法一、原理：TUNEL（TdT-mediateddUTPnickendlabeling）细胞凋亡试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡初期进程中细胞核DNA的断裂情形。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸结尾转移酶（TdTEnzyme）的作用下，能够连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH结尾，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radishperoxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反映产生很强的颜色反映（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因此在光学显微镜下即可观看凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因此没有3‘-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评判，和通过双色法确信细胞死亡类型和分化时期。二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT10×、荧光素标记的dUTP1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5μl20×DAB1μL30%H2O294μlPBS）、ProteinaseK工作液（10-20μg/mlin10mMTris/HCl，pH）或细胞通透液（%TritonX-100in%sodiumcitrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase1（3000U/ml–3U/mlin50mMTris-HCl，pH，10mMMgCl2，1mg/mlBSA）等。三、实验步骤操作图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）：1.用二甲苯浸洗2次，每次5min；2.用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理4.用ProteinaseK工作液处理组织15-30min在21–37°C（温度、时刻、浓度均需试探）或加细胞通透液8min；5.PBS漂洗2次；6.制备TUNEL反映混合液，处置组用50μlTdT450μl荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μlDNase1，反映在15~25℃×10min，后面步骤同处置组。7.玻片干后，加50μlTUNEL反映混合液（阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反映37℃×1h。8.PBS漂洗3次；9.能够加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm）；10.玻片干后加50μlconverter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反映37℃×30min。11.PBS漂洗3次；12.在组织处加50~100μlDAB底物，反映15~25℃×10min；13.PBS漂洗3次；14.拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后当即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。15.加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观看凋亡细胞（共计200~500个细胞）并拍照。可结合凋亡细胞形态特点来综合判定（未染色细胞变小，胞膜完整但显现发泡现象，晚期显现凋亡小体，贴壁细胞显现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）关于培育细胞的预处置：①在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸（见备注4），干燥后在去离子水中漂洗，干燥后4℃保留；②适当方式诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组，各组离心搜集约1×106个细胞，PBS洗一次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然干燥，使细胞专门好的吸附到载玻片上；③将吸附细胞的载玻片在4%多聚甲醛（见备注2）中固定25min；④PBS浸洗二次，每次5min；⑤将吸附细胞的载玻片在%的TritonX-100（见备注5）中处置5min；⑥PBS浸洗二次，每次5min；后续操作犹如石蜡包埋切片的6—15四、注意事项1.进行PBS清洗时，每次清洗5min。2.PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应。3.在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。4.TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。5.如果20×DAB溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。6.用甲基绿（MethylGreen）染液（3-5%甲基绿溶于醋酸巴比妥）染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。然后进行洗净（100%乙醇）、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微镜观看操作。若是现在利用80~90%的乙醇洗净时，甲基绿比较容易脱色，注意快速进行脱水操作。7.荧光素标记的dUTP液含甲次*酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途径进入机体，注意防护。8.试剂保留；未打开的试剂盒贮存在-20℃（-15~25℃）；converter-POD液一旦解冻，以后就保留在4℃（2~8℃）下，至少在6m内稳固，幸免再次冻存；TUNEL反映液临用前配好后，放至冰上直至利用。9.结果分析时注意：在坏死的晚期时期或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DN**断，从而引发假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，和细胞外的矩阵成份阻止TdT进入胞内反映，进而产生假阴性结果。能够选择利用Biotium公司的Tunel试剂盒，是荧光法的成效超级的好，价钱也有优势，若是有需要能够联系《上海开放生物》-Biotium中国总代理，另外还有生物素标记的dUTP试剂（包括不同连接臂长度的产品），能够为您的实验提供更多的选择性，希望能够帮到您！A、B二液混合，30μl/每片37℃1hPBS洗3×3minStreptavidin-HRP1:20037℃30minPBS洗3×3min%DAB%H2O2显色10min，水洗苏木素衬染1min，水洗蓝化吹干后常规树脂封片观看：凋亡指数（apoptosisinde×，AI）在一般光镜下持续观看10个高倍视野计数阳性细胞数，换祘为平均每平方毫米的凋亡细胞数，即为AI。其他IRAM:我在做Tunel检测细胞凋亡，用的是Roche公司的试剂盒，步骤如下：细胞固定（4%多聚甲醛室温40分钟后70%乙醇-20度1小时）--3%H2O2in甲醇室温10分钟%-100in%枸橼酸钠4度冰箱冰上通透3分半钟--加入TUNEl反映混合物，37度湿盒90分钟--加入POD，37度湿盒40分钟--加入DAB100微升，室温10分钟--苏木素2分钟。其间每步均用PBS洗涤3次，共5分钟。我做了两次，但成效均步理想，好象没有看到有细胞核被染成黄色的凋亡细胞（我的细胞应该是有凋亡的），因为试剂有限未做阳性对照，阴性对照结果与实验组无明显差距，实在不明白是怎么回事。是我的试剂没有配对仍是染色出了问题？Nevin:因为我也在用tunel检测细胞的淍亡，看了你的步骤后，提几点意见：一、“3%H2O2in甲醇室温10分钟”的方式仿佛有点问题，我以为H2O2的浓度偏高，有两种选择：A，%H2O2in甲醇；或B，3%H2O2。请注意浓度的转变。因为H2O2会减弱TdT的活性，可致假阴性。二、加入TUNEl反映液，要新鲜配制，后放置冰浴中备用。这也是tunel成功的关键。3、能够用蛋白酶K消化试试。totoo:我的实验是做兔角膜的切片的TUNEL的检测，用的是promega的荧光的试剂盒用FITC标记dUTP反映。蛋白酶k消化的浓度20ug/ml.10ug/度30分钟。我的正常的角膜应该有阳性的结果，可是没有阳性？midas:对角膜进行的什么处置？能够先用您盒子做一张已有明确凋亡细胞的阳性对照，若是能够染出来那么能够证明您的盒子应该是没有什么问题的。totoo:我已经用盒子做一张已有明确凋亡细胞的阳性对照，阳性对照出结果，而我做的角膜片子而不出结果pljgirl：请教列位大侠：有谁做过细胞凋亡的Tunel染色的吗？我用的是博士得得MK1020试剂盒1080元20个反映，可是他们得石蜡阳性片我染的专门好，确实是细胞片不怎么着色？我做Tunel时，加TDT标记液是37度2小时，之前加蛋白酶K消化30秒，没加Trtrion，因为试剂盒没要求，博士得的试剂盒说细胞涂片连蛋白酶K消化都不用，这些操作步骤合理吗？newfish：我用的是中山的蛋白酶K不是石蜡片采纳么？细胞不用吧！做那个实验有几个关键的地址，不能干片固定咱们一样用4％多聚甲醛30分钟。染色时不要只是看试剂盒怎么说，还要一张一张染，在镜下观看看到染上了再终止。另外你能够用苏木素复染！！DONGHAIJU：我此刻正在做细胞凋亡的TUNEL检测，用的是Boehringermannheim公司的试剂盒，结果还不错，3600元50次反映，你的实验步骤是如何进行的？可否写下来讨论一下缘故？刚开始我的实验也是没有结果，后来改变的实验步骤，结果就出来了，成效也不错。我的实验步骤可能如下：一、石蜡切片脱蜡至水，二、%H2O2的甲醇液室温作用5分钟，lPBS清洗两次，每次5分钟3、20ug/ml蛋白酶K处置，湿盒内37℃孵育30min，PBS清洗，4、加入TUNEL反映混合液50ul,盖上蜡膜，湿盒内37℃孵育1小时，PBS清洗，五、3%BSA室温作用20min,PBS清洗六、POD转换液50ul,盖上蜡膜，湿盒内37℃孵育30min，PBS清洗7、DAB显色5~10min，自来水冲洗，八、苏木素复染，盐酸酒精分化20s，自来水冲洗20min，九、梯度脱水50%，70%，80%，90%，100%（1），100%（2），2min/次二甲苯透明两次，10min/次，中性树胶封固，镜下观看。大灵通：我想做细胞爬片，然后加不同浓度增进凋亡的药物，然后做TUNEL检测凋亡情形。问题有二：一、随药物浓度升高，凋亡比例愈来愈高（我做流式取得的结论），可是很多调亡细胞都漂了，那会可不能阻碍TUNEL结果？不明白我说明白没有？确实是说尽管调亡细胞增多，可是漂的愈来愈多，玻片从培育液里拿出来细胞都留在培育液里了！可是文献上也都是这么做的呀。他们的细胞莫非凋亡了也都留在片子上的么？二、在用4%多聚甲醛固定细胞时，4%多聚甲醛是4度的仍是常温的？我用的是博士德的试剂盒，没说要4度，文献上有的写用，有的没提，我到底用不用呢？zhaoqingshan：其实，确实是如此的，凋亡的细胞在开始走向凋亡的通路的时候，或许在分岔口就已经离开贴壁了。有两点建议：一、听说国产的TUNEL试剂盒质量不太好，我以前用的是Roche的；二、4%多聚甲醛用常温固定15-20分钟即可；3、显然，凋亡的细胞大多数已经离开玻璃片了，因此应该把漂浮起来的细胞搜集，然后甩片粘在玻璃片上，才能充分说明问题。4、Tunel最后还得采纳图像分析的方法计算结果，比较主观，只能算是半定量。你也能够用Tunel试剂上流式啊！大灵通：TUNEL最后是要做记数的，若是随药物浓度升高细胞凋亡增多，但却都漂了。举个例子，比如在A浓度时细胞实际凋亡40%，B浓度时细胞实际凋亡80%，可是因为很多凋亡细胞漂起来了的，极可能最后发觉B浓度的片子反而凋亡数少，因为细胞都跑了。乃至B浓度时片子上都没有什么细胞了呀！若是要搜集漂的细胞，那以什么比例往片子上涂？因为这涉及最后凋亡的比例呀。而且文献上关于细胞爬片没有这么做的，都是捞出片子就做固定，乃至还有效PBS洗5分钟再固定的，莫非他们就没有我的问题？zhaoqingshan：不做爬片不行吗？做流式啊！尽管，我也接触图像处置和分析很多时刻，个人以为仍是比较主观的。做几个爬片当样子，出几张漂亮点的图就好了。wangzhang：可否试探一下固定的机会呀，也确实是说，细胞凋亡是有一个进程的，可不能够，分不同的时段固定，比较一下，在何时固定的细胞脱落的又少，还能看出不同呢。必然要用TUNEL看爬片吗？我曾将药物处置过的细胞离心后，悬于Hochest33258,若是药物的凋亡作用明显的话，也能专门好的看出来。大灵通：流式我已经做完啦，是用PI染色的。共5个药物浓度组：0，5，10，20，40，都是作用24小时。我发觉随药物浓度升高，凋亡比例不断增加。除流式，TUNEL也是我实验的一部份。我确实是想用细胞爬片做TUNEL,也是5个药物浓度组：0，5，10，20，40，也是作用24小时，观看凋亡比例。在做流式的时候我就发觉：随浓度升高，漂的细胞不断增加，凋亡比例也不断增加。因为做流式是不怕细胞漂的（最后搜集瓶内所有细胞上流式细胞仪），可TUNEL就不一样啦！你看我如此行不，药物作用到时刻后，轻轻从孔里掏出玻片（我用的是12孔板内放小玻片的方式），尽可能不晃动，使漂的细胞也被带上来一部份，然后当即固定。每一个浓度都如此操作，尽管不太正规，但象青衫说的那样，会出几个好片子，凋亡比例我内心有数哇！要不还有啥方法呀？zhaoqingshan：那样是不行的，因为不洗掉血清的话，固定的时候会很难看的，而且血清中的蛋白会黏附在细胞上被固定了。zhizuchangle：也即将做TUNEL了，我可能也会碰到类似大灵通的问题，我打算用96孔板做TUNEL,如此能够节省试剂，象大灵通所说的，冲洗时会把凋亡的细胞一路洗掉，确实很让人头疼，那个问题应该如何解决啊，victoh：（TO大灵通一、）事实上TUNEL更大的意义在于检测体内凋亡，假设做体外定量研究贴壁生长的细胞时，应该将悬浮的细胞搜集起来，只是如此统计起来较为麻烦，固然能够别离计数贴壁/悬浮的细胞数量，培育细胞做TUNEL要紧用于定性的研究。（TO大灵通二、）我平常将PFA置于4度冰箱内保留，历时掏出即用用TUNEL检测细胞凋亡，想比较各组的凋亡率的不同用什么统计方式pengwenf09:请问，用TUNEL检测细胞凋亡，因为是率的比较。应该用卡方查验，但如果是我想比较两两之间的不同又该用和种查验呢？maokai123:是不是t查验pengwenf09:我感觉是不是更应该用单因素方差分析。maokai123:查查excel的帮忙吧里面有比较详细的推荐。不确实是比较两组样本不同在必然置信水平下的显著性吗？你看看excel推荐的函数直接套用就好了。鄱译问题武林高手：那位高手帮忙翻译一下：TUNELstainingwasperformedaccordingtosupplierdirectionsusinginsitucelldeathdetectionkit,fluorescein(BoehringerMannheim).Sectionsweredeparaffinized,rehydrated,andwashedwithPBSfor10minfollowedbywashingwithpermeabilizationsolution%TritonX-100,%sodiumcitrate)for5minandthenwashedtwicewithPBS.Sectionswerethenincubatedwithlabelingsolution(BoehringerMannheim)for1hinhumidchamber.AfterthreewasheswithPBSsectionswereblockedinblockingsolutionsuppliedbytheZymedkitfor30min.Sectionswereincubatedovernightwithrabbitanti-ErbB-4antibodiesatafinalconcentrationof1:100.FollowingthreewasheswithPBS,sectionswereincubatedwithrhodamine-conjugatedgoatanti-rabbitIgG(1:100finaldilution)for2h,washed,andmountedforimmunofluorescentmicroscopy.Tunel后在封锁液中封锁30分钟Why?用的是什么封锁液？situ,permeabilization,Triton是什么意思？qxm：insitu：在原位，原处。permeabilization：破膜，在细胞膜上打孔的意思。TRITON确实是用来破膜的jpxq：翻译如下，不妥的地方请纠正：依照试剂说明书用原位细胞死亡检测试剂盒进行TUNEL染色。荧光素(BoehringerMannheim公司提供).切片脱腊入水，用PBS洗。10min后用通透液%TritonX-100,%枸橼酸盐）通透5min（破膜），然后用PBS洗2次。切片置于湿盒用标记液(BoehringerMannheim公司提供)孵育1h。用PBS洗三次后切片用封锁液（Zymed试剂盒）封锁30分钟。切片与终浓度为1：100的rabbitanti-ErbB-4抗体孵育留宿。PBS洗三次，切片和罗丹明标记的羊抗兔IgG（终浓度为1：100）孵育2h，洗后用荧光显微镜计数检测。另外，因为检测系统用到了生物素标记（文中没有提供），因此封锁液是为了封锁外源性的生物素。zhongweigao01：大体赞同jpxq的翻译：是的，tunel的检测是在标记液后用【内源性】的生物素的封锁液的（不是外源性），即Zymed试剂盒xwwq:如何翻译TUNEL（terminaldUTP-biotinnickend-labeling）技术pengding3:dUTP-生物素粘性结尾标记技术TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方式 细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分时期的进程，染色体DNA第一在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²和Mg²依托的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上显现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH结尾可在脱氧核糖核苷酸结尾转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-结尾，从而可进行凋亡细胞的检测，这种方式一样称为脱氧核糖核苷酸结尾转移酶介导的缺口结尾标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因此没有3’-OH形成，很少能够被染色。低分子量的DNA分离后，也可利用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。TUNEL或缺口翻译法事实上是分子生物学与形态学相结合的研究方式，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反映细胞凋亡最典型的生物化学和形态特点，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培育的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一样的组织化学和生物化学测定法要高，因此在细胞凋亡的研究中已被普遍采纳。  一、过氧化物酶标记测定法 原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，能够掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH结尾，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反映，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因此可在一般光学显微镜下进行观看。 毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体，因此非特异性反映很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反映不到1％，假设此抗体的Fc部份通过蛋白酶水解的方式除去后，那么可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。 本方式能够用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培育的或从组织中分离的细胞凋亡测定。 检测晚期凋亡。 大体原理： 对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dTUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dTUTP与核断裂的DNA 3’-OH结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dTUTP上biotin结合（每一个链霉亲和素至少能够再结合3个biotin分子），最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反映，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判定细胞凋亡发生情形。 罗氏试剂盒 一、试剂一、酶浓缩溶液5×50μl——结尾脱氧核糖核酸转移酶 （10×）二、试剂 二、标记溶液5×550μl——含有核苷酸混合液的反映液 （1×）三、试剂 3、转化剂-POD ——酶标记抗荧光素抗体（即用型，融后4℃保留）四、 二、所需的溶液和仪器 10mM Tris/HCl（~）、PK配制、DAB、饭盒、吹风机、3%H2O2甲醇溶液、PBS、盖玻片、中性树胶、苏木素、二甲苯和无水乙醇（用量多）、双蒸水（用以配梯度酒精） 1, 充分脱蜡和水化。脱蜡能够先60度20min，石蜡切片于染色缸中，二甲苯浸洗2次共5min,100%、95%、90%、80%、70%乙醇浸洗3min×5；②3%过氧化氢甲醇中浸洗10-15min，抑制内源性过氧化氢酶。 ③用蛋白酶K（20μg/ml溶于Tris/HCl中，~）室温孵育15~30分钟。 ④PBS洗约5min*2次，擦干样品周围的水。现在期配制TUNEL反映混合物——从试剂2中掏出100μl标记溶液作为两个阴性对照；将试剂1中取5μl试剂2中45μl标记液中，配成50μl TUNEL反映混合物混匀（即配即用，4℃避光！） ⑤标记反映：滴加50μl的TUNEL反映混合液，在湿盒中37℃孵育60分钟（为防蒸发和保证TUNEL 反映混合物均匀散布，能够在孵育进程中加盖盖玻片）。PBS洗5min*3次，至此样品可在荧光镜下（绿色）分析结果。 ⑥信号转化和分析：擦干样品周围的水分，加入50ul转化剂-POD，湿盒中37℃孵育20~30分钟（能够在孵育进程中加盖盖玻片）。PBS洗5min*3~5次  ⑦加入50~100μl DAB底物溶液，室温（10~25℃）孵育5~10 min，PBS洗5min*3次。（苏木素染1-3秒，以避免视野全染，需要试探条件） ⑧中性树胶 或甘油封片（在封片前能够复染），光镜下分析结果。•稳固性：TUNEL反映混合物需在利用前当即制备，不能贮存，配好的此液体必需将放入冰浴中。 二、转化剂-POD （即用型）：一旦融化此液体，需在4℃保留（最多保留6个月），而且不能反复冻存。 蛋白酶K一样工作液浓度为20ug/ml,但浓缩液可配制1~10mg/ml，可用PBS配制，也可用蛋白酶K缓冲液（100mM Tris HCl 50mM EDTA）；   注意： 1)蛋白酶K能够帮忙渗透组织，但延长孵育时刻可能致使切片脱落（come off the slide）,因此要最优化孵育时刻长短。时刻一样为10~30 min，4um左右的片子能够用10 min，但30 um左右的可用30 min，最终通过试探最正确时刻。太长易脱片、太短起不到通透成效。 2)关于比较困难的组织，能够选用 的枸橼酸盐缓冲液进行修复（石蜡切片无必要用），200ml需350W修复5min 3)对照： 阴性对照： 通过固定和通透的细胞样品加入50μl试剂2以代替TUNEL反映混合物，从标记步骤以下同上。阳性对照： 通过固定和通透的细胞样品用细球菌的核酸酶或DNase I使之产生DNA链缺口，从标记步骤以下同上。 4)操作流程：常规脱蜡、脱水处置——冲洗样品——滴加TUNEL反映混合物，37℃孵育60分钟——冲洗样品——选择：荧光镜下观看分析——滴加转化剂-POD，37℃孵育30分钟——洗样品——滴加DAB底物溶液，室温孵育5-20分钟——光镜下分析结果 5)假阳性多的缘故有很多：POD封锁不全、DAB显色时刻太长等缘故假阳性严峻，可能缘故应该是DAB孵育时刻太长，建议第一排除之，同时增强PBS浸洗 6)DAB显色时刻: （1）DAB显色时刻不是固定的，要紧由显微镜下操纵显色时刻，到显现浅棕色本底时即可冲洗； （2）DAB显色时刻很短（如几秒或几十秒）就显现很深的棕褐色，这极可能说明你的抗体浓度太高或抗体孵育时刻太长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时刻； （3）另外，假设很短时刻就显现背景很深，还有可能你前面的封锁非特异性蛋白不全，需要延长封锁时刻； （4）DAB显色时刻很长（如超过十几分钟）才显现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度太低或孵育时刻太短（最好一抗4度留宿）；另一方面确实是封锁时刻太长。 7)脱片产生的缘故和如何避免脱片: （1）多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，迈新按说也是不错的，可是都脱成什么样子了。后面补做第二批时用的病理科教师自己做的片子，要好一点。 （2）组织切的不行，切片机的问题例如比较老的旧的机械切的厚或不均匀，或切片者手法不行等。 （3）组织的问题，越是有坏死之类越容易脱。 （4）没烤好，时刻短温度不够之类。 （5）操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。 （6）另外，一旦见到有组织漂起来操作就加倍要谨慎，用PBS的时候尽可能用泡的，不要冲。凋亡转变。 2）形态学观看，看到细胞数量有限，统计学上的准确性受阻碍； 3）凝胶电泳检测DNA破坏了细胞的完整性也不能测出凋亡细胞占总细胞的比例； 4）流式细胞术可检测细胞、亚细胞及分子水平的特点性转变。 用于流式细胞仪检测的染料： PI、Hoechst、 EB、 DAPI、丫啶橙等，其中PI、Hoechst最经常使用。 PI和Hoechst33342双标： PI、Hoechst33342都可与细胞核DNA（或RNA）结合。可是PI不能通过正常的细胞膜，Hoechst那么为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中初期调亡细胞都可被Hoechst着色，可是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。 故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。 PI和Annexin-V双标： 磷脂酰丝氨酸（PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的初期（或细胞损伤时）PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的面，暴露在细胞外环境中。 Annexin-V（green）能够和磷脂酰丝氨酸（PS）特异性结合。因此细胞处于调亡或坏死时，Annexin-V可为阳性（初期的坏死细胞可能为阴性）。可是只有坏死的细胞PI是阳性 五、形态学观看 一、一般光学显微镜观看 二、透射电子显微镜观看 3、荧光显微镜观看 一、一般光镜下观看： 1)用苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失 2)Giemsa染色法、瑞氏染色法等，正常细胞核的色泽均一，凋亡细胞染色变深，坏死细胞染色浅或没染上颜色 直接用倒置显微镜观看： 1）细胞体积变小，全面皱缩； 2）凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。 二、透射电子显微镜观看 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。 细胞凋亡进程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样，部份染色质显现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。的，要紧结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射敞亮的蓝色荧光。 1）PI双染色法大体原理 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。 碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。因此将Annexin-V与PI匹配利用，就能够够将凋亡早晚期的细胞和死细胞区分开来。 注意事项：细胞凋亡时，其DNA可染性降低被以为是凋亡细胞的标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。 六、细胞凋亡的分子生物学检测方式: 细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分时期的进程，染色体DNA第一在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²和Mg²依托的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上显现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH结尾可在脱氧核糖核苷酸结尾转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-结尾，从而可进行凋亡细胞的检测，这种方式一样称为脱氧核糖核苷酸结尾转移酶介导的缺口结尾标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因此没有3’-OH形成，很少能够被染色。低分子量的DNA分离后，也可利用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。TUNEL或缺口翻译法事实上是分子生物学与形态学相结合的研究方式，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反映细胞凋亡最典型的生物化学和形态特点，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培育的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一样的组织化学和生物化学测定法要高，因此在细胞凋亡的研究中已被普遍采纳。 过氧化物酶标记测定法 原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，能够掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH结尾，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反映，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因此可在一般光学显微镜下进行观看。 毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体，因此非特异性反映很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反映不到1％，假设此抗体的Fc部份通过蛋白酶水解的方式除去后，那么可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。 本方式能够用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培育的或从组织中分离的细胞凋亡测定。 (一)试剂配制 一、磷酸缓冲液PBS（）：磷酸钠盐 50mM，NaCl 200mM。 二、蛋白酶K（200μg/ml，）：蛋白酶K ；PBS 100ml。 3、含2%H2O2的PBS缓冲液（）：H2O2 ；PBS缓冲液 、TdT酶缓冲液（新鲜配）：Trlzma碱 用 HCl调剂pH至 ，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸钠 29．96g和氯化钴。 五、TdT酶反映液：TdT酶32μl；TdT酶缓冲液 76μl，混匀，置于冰上备用。 六、洗涤与终止反映缓冲液：氯化钠 17. 4g；柠檬酸钠 ；ddH2O 1000ml 7、％二氨基联苯（DAB）溶液：DAB 5mg；PBS 10ml，, 临用前过滤后，加过氧化氢至%。 八、％甲基绿（）：甲基绿；乙酸钠100ml。 九、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。 10、 过氧化物酶标记的抗地高辛抗体（ONCOR） （二）实验步骤 一、标本预处置： （1）石蜡包埋的组织切片预处置：将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次5min。用无水乙醇洗两次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室温水解15min，去除组织蛋白。用蒸馏水洗4次，每次2min，然后按下述步骤2进行操作。 （2）冰冻组织切片预处置：将冰冻组织切片置10％中性甲醛中，于室温固定10min后，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃处置5min，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。 （3）培育的或从组织分离的细胞的预处置：将约 5 × 107个/ml细胞于 4％中性甲醛室温中固定 10min。在载玻片上滴加 50～100μl细胞悬液并使之干燥。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。 二、色缸中加入含2％过氧化氢的PBS，于室温反映5min。用PBS洗两次，每次5min。 3、用滤纸警惕吸去载玻片上组织周围的多余液体，当即在切片上加2滴 TdT酶缓冲液，置室温1～5min。 4、 用滤纸警惕吸去切片周围的多余液体，当即在切片上滴加 54μl TdT酶反映液，置湿盒中于37C反映 1hr（注意：阴性染色对照，加不含TdT酶的反映液）。 五、将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反映缓冲液，于37℃保温30min，每10min将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。 六、 组织切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反映30min。 7、用PBS洗4次，每次5min。 八、在组织切片上直接滴加新鲜配制的％DAB溶液，室温显色3～6min。 九、用蒸馏水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。 10、 于室温用甲基绿进行复染10min。用蒸馏水洗3次，前两次将载玻片提起放下10次，最后1次静置30s。依一样方式再用100％正丁醇洗三次。 1一、 用二甲苯脱水3次，每次2min，封片、干燥后，在光学显微镜下观看并记录实验结果。 （三）注意事项 必然要设立阳性和阴性细胞对照。阳性对照的切片可利用DNaseI部份降解的标本，阳性细胞对照可利用地塞米松（1μM）处置3-4hr的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞。阴性对照不加TdT酶，其余步骤与实验组相同。 洗2分钟×3次。 8.用抗体稀释液1:100稀释SABC：取1ml抗体稀释液加SABC10μl，混匀后50μl/片加至切片。37℃反映30分钟。 TBS洗5分钟×4次。 显色。 10.苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观看。 结果判定细胞核固缩有的呈碎片状，不规那么，大小不一致，呈棕黄色颗粒者为阳性细胞。 即凋亡的细胞 TUNEL改良方式在细胞凋亡检测中的应用 材料和方式 材料 取手术下新鲜组织，恒冷切片5μm，4%多聚甲醛缓冲液固定4-8小时，载玻片用APES处置，同时持续切片、1%火棉胶、、3%H2O二、枸橼酸盐缓冲液、通透液%Triton-100、枸橼酸钠)、标记缓冲液：二甲胂酸钠100mmol/L标记、二巯基苏糖醇L，氯化钴(coci)。 * TdT反映液；标记缓冲液中加TdT酶100U/ml，biotin-dUTP；链霉菌素标记的辣根过氧化物酶，蛋白酶K(20μg/ml)。 * 显色剂 氨乙基咔唑(amino ethyl carbazole,AEC)的 配制 AEC 20mg 二甲酰胺DMF 醋酸缓冲液 50ml %H2O2  实验步骤 （1）切片用冷风吹干后为避免冰冻切片脱片用1%火棉胶封片1分钟，PBS漂洗3×5分钟； （2）3%H2O2阻断10分钟后PBS洗3×5分钟； （3）组织切片浸泡于盛有L枸橼酸盐缓冲液的烧杯中，置于微波炉内，在650W，辐射时刻15min的条件下进行组织处置。冷却至室温。 （4）放在通透液（%Triton -100溶于%枸橼酸钠溶液）中室温20分钟，PBS漂洗3×5分钟； （5）滴加50μl TdT反映液37℃1h，PBS漂洗3×5分钟；(6)滴加50μl biotin-dUTP，反映液37℃1h，PBS漂洗3×5分钟；(7)滴加50μl链霉菌标记辣根过氧化物酶液37℃孵育30分钟，(8)PBS漂洗3×5分钟， AEC-H2O2显色10-15分钟，苏木素复染(用1%的酸性水分化)，水洗、水溶性封片。阳性对照dTd反映前用20μg/ml蛋白酶K处置切片。阴性对照用PBS代替dTd反映液。 结果判定及标准 改良的方式：凋亡细胞核呈红色固缩，有白边集或碎列，细胞膜皱褶，有的卷曲和出泡，在计数时躲开坏死区域，以幸免假阳性。计数500个细胞中的凋亡细胞数量，得出凋亡百分率。凋亡染色分度如下：每一个高倍视野平均1-3个为Ⅰ级；3-6个为Ⅱ级；6-10个为Ⅲ级；>10个者为IV级。阳性对照：经在dTd反映认前用20μg/ml蛋白酶，处置切片30分钟的切片同改良方式大体相同，但红色较浅。阴性对照：切片无棕色反映。 评判 正常的或正在增殖的细胞没有DNA的断裂，没有3’-OH结尾被标记，因此镜下无显色的物质。这种分子生物学与形态学相结合的方式，能够对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行标记，准确反映细胞凋亡最典型的生物化学与形态学特点，灵敏度远远高于一样的组织化学和生物化学方式。在检测进程中，可设阴性对照(不加TdT)阳性对照(已知的阳性标本)。 注意:AEC孵育切片，反映产物为红色。可用苏木精对衬染色，反映产物是纯酒精溶性的，因此。可用酸性水溶液分化，然后用水溶性封固剂封片。 五、凋亡细胞：凝胶电泳检测 前已提及凋亡细胞的突出特点是由于内源性核酸内切酶的激活而致使细胞核DNA的断裂。典型的细胞凋亡，在核内形成大量200bp大小及其倍体的核苷酸片段，而非典型的凋亡细胞，由于核内的DNA降解不完全，仅形成300~50kb的DNA大片。利用这一特性，可通过DNA凝胶电泳来判定凋亡的发生和进展情形。 试剂 1. PBS缓冲液 2. 消化液的配制： 100mmol/L NaCl 10mmol/L Tris-HCL 25mmol/L EDTA %SDS ml蛋白酶K 3. 酚：氯仿：异戊醇混合液按25:24:1比例配制。 4. 氯仿：异戊醇混合液按24:1比例配制。 5. 醋酸铵，L。 6. 100%和70%的乙醇。 7. TE 缓冲液：100mmol/L Tris-HCL,5mmol/L EDTA。 8. TBE缓冲液。 9. 电泳仪。 10. UV透射仪。 11. 照相设备。 12. 不含DNA酶的RNA酶。 13. 2%凝胶的配制：取凝胶粉2g，溶于100ml 倍的TBE缓冲液中，加热至沸腾，搅拌使其均匀。待凝胶温度降至50℃时，倒入待其凝固。 14.溴化乙啶(EB)：10mg/ml水溶液。 分子量标准物(Bio-Rad Lab，hercules,CA,USA)。 操作步骤 1.培育的悬浮细胞经离心(300g，5min)去上清液后，用冷(4℃)PBS缓冲液洗涤二次；培育的贴壁细胞经用胰蛋白酶消化后搜集，一样方式洗涤二次，离心并去掉上清，仅留细胞沉积物。 2.向细胞沉积物中加入消化液，混匀后，于50℃孵育12-16h。 3.用酚：氯仿：异戊醇混合液抽提一次，再用氯仿：异戊醇混合液抽提二次。其中每次加入抽提液后混匀5min，然后以3600g离心5min，吸取抽提物。  醋酸铵，至终浓度为L，混匀后，加入二倍体积的100%乙醇，4℃下静置2h。 12000g在室温下离心30min，弃去上清。 6.用70%乙醇重复上述步骤，洗涤一次，弃去上清。 7.真空抽干或空气干燥DNA抽提物。 8.将提取的DNA用TE缓冲液溶解。 μl溶于TB液的DNA抽提物，加入的无DNA酶的RNA酶，于37℃孵育1h。 10.吸取样品，在2%的凝胶孔内加样；并在第一孔内加入分子量标记物。 11.将凝胶置于倍TBE缓冲液的电泳槽内，按4V/cm电压电泳7h。 μg/ml的EB水溶液中染色30min。 13.用双蒸水洗涤凝胶1~2h，其间换水数次。 结果观看 将凝胶置UV透射仪上观看：典型的凋亡能看到200bp及其倍体的DNA梯带。 1阴性对照 2细胞色素诱导16小时 3细胞色素诱导36小时(凋亡) 4细胞色素诱导72小时(凋亡)  凝胶电泳特点 (1) 本方式不能检测单个细胞水平的凋亡。 (2) 不能提供细胞发生凋亡所处的组织位置和细胞分化状态。 六、荧光染料染色-流式细胞测定凋亡细胞 * 细胞凋亡在细胞学上发生一系列特点性转变，如细胞周期停滞、细胞膜表面蛋白质分子表达的水平及类型发生改变、细胞膜皱缩引发光散射性质发生相应的转变等。在细胞凋亡的初期，细胞对前向角光散射的能力显著下降，可是对90°角光散射的能力增加或没有转变。前向角散射的上升或下降与细胞的大小有关，90 °角散射的改变与细胞内结构，专门是染色质的浓缩有关。 * 在细胞凋亡晚期，前向角和右向角光散射的能力均降低。因此，通过流式细胞仪检测细胞光散射的改变能够取得凋亡细胞的一些信息。可是，细胞的机械损伤、分离取得的细胞核、和坏死细胞的前向角光散射能力也均表现下降。另外，晚期凋亡细胞，细胞膜表面蛋白可能丢失，凋亡细胞表型复杂化也使光散射能力的分析显现复杂的结果，因此单纯前向角光散射降低不是凋亡细胞特有的标志。 * 依照碘化丙啶(PI)只能使坏死细胞着色，而双苯并咪唑(Ho)却可穿越细胞膜对活细胞和凋亡细胞的DNA进行染色，在紫外光激发下产生不同颜色荧光的特点，因此采纳单一PI或Ho染色法，或应用两种染料通过复染并结合流式细胞仪的精准分析，可达到对凋亡细胞、坏死细胞和活细胞进行辨别与定量的目的。 七、电子显微镜观观点 透射电子显微镜已经用于凋亡细胞的检测。镜下可见凋亡细胞体积变小、细胞质浓缩、细胞核变小、染色质浓缩并凝结成块，显现染色质沿核膜内侧排列的核边集现象。晚期的凋亡细胞，清楚可见细胞核裂解产生的凋亡小体。 八、PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测： 原理 凋亡初期，细胞内膜的磷脂酰丝氨酸(PS)移位到细胞外膜，而荧光标记或生物素偶联的annexin V(磷脂结合蛋白)极易检测处于外膜的PS，由于PS外膜化比凋亡引发的核酸转变更早，因此该试剂盒比DNA检测法能更初期检测细胞凋亡。 九、mRNA水平的检测 一些基因在细胞凋亡时表达异样，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种经常使用方式。 作为凋亡前期（ Bax ）或抗凋亡（ Bcl-2和bcl-X ）的调剂物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡仍是存活。因此，通过定量PCR（Quantative PCR）检测这些凋亡相关基因RNA水平的表达，也能够对凋亡进行评判 十、凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析 该分子表达普遍，在原核和真核生物不同种属间具有很高的同源性。该分子具有增进某些肿瘤细胞(HL60、MGC-803、MCF-7等)凋亡的效应，可作为初期凋亡的信号评判指标。 十一、活细胞Bid(蛋白)转位检测 Bcl2家族蛋白Bid通常情形下位于细胞浆内，但在凋亡发生时，Bid迅速转入线粒体内，并引发了细胞色素C的释放，因此，通过Bid蛋白的检测能够监视凋亡前期的生化反映。 细胞凋亡相关抗体 * Fas(CD95)Monoclonal Antibody * Granzyme B Monoclonal Antibody * Fas Monoclonal Antibody * Apoptosis Sample * Bak Antibody * Bcl-xL Antibody * Caspase-10 Antibody * Cleaved Caspase-3 * Cleaved DFF45(D224)Antibody * Cleaved PARP(D214)Antibody * DFF45/DFF35 Antibody * Phospho-Bcl-2(Ser70)Antibody 细胞凋亡的医学意义 1. 凋亡在发生学中的作用 ①在胚胎发育、器官形成进程中，必然伴随着某些特定细胞群的凋亡，这些细胞群的凋亡是受基因操纵的，可准时发生，呈现生理性细胞死亡或进行性细胞凋亡。 ②淋巴系统的阴性选择(negative selection)，指在T淋巴细胞、B淋巴细胞分化成熟时，机体通过严格的选择机制，使那些编排细胞表面受体基因发生错误的细胞，和有可能致使自身免疫性疾病的细胞(具有自身抗原的细胞)发生凋亡，使得淋巴细胞在成熟进程中，有95%的细胞以凋亡的方式被清除，仅有5%左右的淋巴细胞从中枢免疫器官中被分化成熟。 ③神经元发育进程中也存在阴性选择机制，以清除那些有害的(即发生错误连接的)或无用的神经元，因此，有50%的神经元细胞在发育成熟前以凋亡的方式被清除。  现已发觉凋亡机制的异样，即凋亡的增加或被抑制与一系列疾病的发生有关。 (1)凋亡减少(抑制)所引发的疾病 ①恶性肿瘤：有滤泡性淋巴瘤、P53突变性肿瘤、激素依托性肿瘤(乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌)。 ②自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、自身免疫性肾小球肾炎。 ③病毒感染性疾病如对疱疹病毒、麻疹病毒、腺病毒易感性引发的疾病。 (2)凋亡增多引发的疾病 ①神经元变性，如帕金森病、侧索硬化、色素性视网膜炎、小脑变性。 ② 骨髓发育不良综合征，如再生性障碍性贫血。 ③ 缺血性损伤，如心肌梗死、卒中、再灌注性损伤。 ④ 中毒性肝炎，如酒精性肝病。 凋亡除与某些疾病发生有关，而且对许多疾病的医治有着极大的现实意义。肿瘤患者可通过基因医治启动细胞凋亡机制，也可通过药物(化疗)来诱导和加速肿瘤细胞凋亡，以操纵肿瘤的进展，并使其减缓。如在外科手术及器官移植中的再灌注性损伤，可采取启动抗凋亡基因或应用抗凋亡药物，来增进愈合和恢复功能。中衫的DAB给你一个我经常使用的DAB显色液配方，专门好用。DAB 6mgLTris-Cl  9ml%NiCl21ml30%H2O2    10～30μl这是10ml的配方。其中NiCl2能够增强DAB的显色成效。氯化镍NiCl2无水氯化镍试剂：DAB（经常使用四盐酸盐）　50mg LTB    100ml 30%H2O2    　30～40μl 配制方式：先以少量L的TB溶解DAB，然后加入余量TB，充分摇匀，使DAB终浓度为%,过滤后显色前加入30%的H2O230～40μl，使其终浓度为%。DAB3,3,-二氨基联苯胺DAB是有很多杂质不溶，不用管他，依照配方配，若是你担忧那些杂质，能够过滤，绝对能够用。我做过上百次了。若是你再加点CoCl2，显色出来的条带会是黑色的，好看一些。呵呵。我的配方是60mg/mlDAB50ul.30%H2O210ul，Tris4500ul,%CoCl2500ul,整体积5ml.配好尽快用，放置以后可能会失效。我每次都利用之前配，没有放置超过一个小时。个人感觉显色不用避光，显色后，若是你没过滤DAB（我比较懒，从来只是滤，但Tip头吸的时候会堵，把Tip头尖端剪掉吸就好了或警惕取上清），膜上会有杂质，用自来水冲一下就干净了。我每次配1mlDAB（60mg/ml)，室温避光保留，从来不放入-20度。DAB粉剂我一直放在室温，可能放了1年多吧，能够用。