3D生物打印构建聚乳酸羟基乙酸、纳米羟基磷灰石支架骨形态发生蛋白2缓释复合体的实验研究

3D生物打印构建聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石支架骨形态 发生蛋白2缓释复合体的实验研究 臧晓龙，孙  健，李亚莉，陈立强，杨学财，梁立卿，杜国庆(青岛大学附属医院口腔颌面外科，山东省青岛市 266003) 引用本文：臧晓龙，孙健，李亚莉，陈立强，杨学财，梁立卿，杜国庆. 3D生物打印构建聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石支架骨形态发生蛋白2缓释复合体的实验研究[J].中国组织工程研究，2016，20(16):2405-2411. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.16.017    ORCID: 0000-0003-0926-5235(孙健) 文章快速阅读： 聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石支架骨形态发生蛋白2缓释复合体的形态学、降解特性及蛋白缓释性能 臧晓龙，男，1988年生，山东省青岛市人，汉族，青岛大学口腔医学院在读硕士，主要从事正颌外科与组织工程骨方面的研究。 通讯作者：孙健，博士，教授，主任医师，硕士生导师，青岛大学附属医院口腔颌面外科，山东省青岛市 266003 中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2016)16-02405-07 稿件接受：2016-03-09 骨形态发生蛋白2缓释系统制备 文释义：3D生物打印：该技术可以有效保持生物活性因子活性。利用3D生物打印快速成型技术一次性构造具有生物活性的构造块用以制造活体组织。实验采用打印机具有2个喷头2个墨盒，工作行走速度4 mm/min，可依据实验要求调整温度及喷出速度等相关参数，目的是一体化构建组织工程骨及保持其内细胞或生物活性因子的活性。 聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石支架(PLGA/nHA)：聚乳酸羟基乙酸(PLGA)和纳米级羟基磷灰(nHA)石均有良好生物相容性，PLGA体内经三羧酸循环降解产物为二氧化碳和水，无细胞毒性。实验利用PLGA无毒可降解及良好的亲水性和nHA良好的骨诱导活性及机械性能制得高分子/生物陶瓷复合材料，此复合材料既因羟基磷灰石的加入获取了良好的机械性能，经3D打印机塑形后抗压强度达(4.86±0.43) MPa，又因其的加入减缓了PLGA的降解速度，为骨再生及修复提供了时间保障。摘要背景：3D生物打印技术制备的工程骨支架，其形态、结构可控性好，但对组织工程骨细胞生长因子复合体的构建及缓释细胞因子的时效、量效特点有待进一步研究。目的：应用3D生物打印技术制备聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石支架骨形态发生蛋白2缓释复合体，检测聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石支架的生物学性能和负载细胞因子缓释复合体的性能，探讨其作为组织工程骨支架复合体的可行性。方法：用壳聚糖和β-甘油磷酸钠制备温敏型壳聚糖水凝胶，负载骨形态发生蛋白2壳聚糖纳米球形成缓释复合载体，3D生物打印制备聚乳酸羟基乙酸/纳米磷灰石壳聚糖纳米骨形态发生蛋白2细胞因子缓释复合体，体外实验检测其生物学特性及缓释骨形态发生蛋白2的时效、量效特点。结果与结论：3D生物打印技术制备的聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石支架材料平均孔径(431.31±1 8.40) μm，孔隙率为(73.64±1.82)%。 聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石复合体48 h内和第30天内蛋白累计释放率均符合生理状态缓释要求，有效控制了聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石缓释复合体的突释效应，缓释效果符合生物学要求。说明3D生物打印制备的聚乳酸羟基乙酸/纳米磷灰石壳聚糖纳米骨形态发生蛋白2细胞因子缓释复合体其孔隙率、孔径、缓释性能、降解速率、机械强度等指标，均符合构建组织工程骨的生物学要求。 关键词：生物材料；缓释材料；聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石；3D生物打印技术；缓释载体；支架；壳聚糖；水凝胶；纳米球；山东省自然科学基金 主题词：壳聚糖；乳酸；骨形态发生蛋白质类；组织工程基金资助：山东省自然科学基金项目(ZR2012HM069)缩略语：聚乳酸羟基乙酸/纳米磷灰石：polylactic-co- glycolicacid/Nano-hydroxyapatite，PLGA/nHA3D-bioprinting manufacturing polylactic-co-glycolic acid/nano-hydroxyapatite scaffold/bone morphogenetic protein-2 sustained release composite Zang Xiao-long, Sun Jian, Li Ya-li, Chen Li-qiang, Yang Xue-cai, Liang Li-qing, Du Guo-qing (Department of Oral and Maxillofacial Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China) Abstract BACKGROUND: Tissue-engineered bone scaffold fabricated by 3D-bioprinting technique has good controllability in morphology and structure. However, construction of tissue-engineered bone/cell growth factor complex and time-dose effect of sustained-release factors are needed to be further researched. OBJECTIVE: To fabricate a sustained-release composite of polylactic-co-glycolic acid (PLGA)/nano-hydroxyapatite (n-HA) scaffold carrying bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) using 3D-bioprinting technique, and test the biological properties of the PLGA/n-HA scaffold carrying BMP-2 and the sustained-release properties, thereby to discuss its feasibility as the tissue-engineered bone scaffold composite. METHODS: Temperature-sensitive chitosan hydrogel was prepared using chitosan and β-glycerophosphate to construct a sustained-release composite, chitosan nanoparticles carrying BMP-2 . 3D-bioprinting technique was utilized to fabricate the PLGA/n-HA scaffold carrying BMP-2. Biological features of the scaffold composite were tested, and time-dose effect of BMP-2 sustained-release was observed. RESULTS AND CONCLUSION: The average pore size of the scaffold-cytokine composite was (431.31±18.40) μm, and the porosity was (73.64±1.82)%. The cumulative release rate of BMP-2 from the scaffold-cytokine composite that effectively controlled the burst release during 48 hours and 30 days were suitable for the physiological needs. In conclusion, the porosity, pore size, release property, degradation rate, and mechanical strength of the scaffold-cytokine composite all meet the biological requirements of tissue-engineered bone construction. Subject headings: Chitosan; Lactid Acid; Bone Morphogenetic Proteins; Tissue Engineering Funding: the Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2012HM069 Cite this article: Zang XL, Sun J, Li YL, Chen LQ, Yang XC, Liang LQ. Du GQ. 3D-bioprinting manufacturing polylactic-co-glycolic acid/nano-hydroxyapatite scaffold/bone morphogenetic protein-2 sustained release composite. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(16):2405-2411. Zang Xiao-long, Studying for master’s degree, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China Corresponding author: Sun Jian, M.D., Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China 0  引言  Introduction 理想的组织工程支架复合体应需具备良好的仿生结构、生物相容性、细胞因子缓释效能、机械强度和降解速率等生物学特性[1]。利用生物多孔材料作为支架载体加载不同的生长因子构建组织工程骨，以期达到对骨缺损的修复重建，是近年来研究的热点。3D生物打印技术的出现，为构建仿生组织工程骨的构建提供了一种新的技术手段。3D生物打印区别于以往的构建方法[1]，其利用计算机辅助设计可以对缺损骨形态实现个性化制作[2]，同时其内部三维结构也可以达到近似仿生结构，使得组织工程骨的仿构建又向前迈进了一步[3-5]。以往的研究已证实聚乳酸羟基乙酸/纳米磷灰石(polylactic-co- glycolicacid/Nano-hydroxyapatite，PLGA/nHA)具有良好的生物相容性，无毒可降解性和优良的力学性能。此支架既因为羟基磷灰石的加入满足了组织工程骨机械性能要求，也可因其的加入使得PLGA降解减缓，为骨再生及修复提供了时间保障[6]。但其降解产酸可引起移植区无菌性炎症导致植入的失败[7-8]。考虑到上述因素，实验中骨形态发生蛋白2缓释复合体pH值介于7.2-7.6，可中和PLGA降解产生的酸，也可以保护其负载的骨形态发生蛋白2不受酸的影响。 作者在以往对于PLGA/nHA构建组织工程骨支架、壳聚糖纳米球细胞因子缓释载体等系列研究的基础上发现在制备PLGA/nHA支架过程中孔径变异较大，介于100-300 μm之间，抗力形差导致机械性能不尽人意，难以符合组织工程骨的力学要求[9-10]。骨形态发生蛋白2作为成骨最重要的细胞因子之一，具有强烈的异位诱导成骨特性[11-15]。以往实验对改良乳化交联法制作的骨形态发生蛋白2缓释载体已进行了时效、量效关系研究[9]，发现纳米缓释载体的缓释效果与壳聚糖浓度及交联剂和壳聚糖的比例呈现一定关系，但其缓释效果并不能令人满意。为了克服上述困难，作者拟探索用3D生物打印技术构建仿生个体化组织工程骨细胞因子支架复合体的可行性。    实验采用3D生物打印技术制作PLGA/nHA骨形态发生蛋白2壳聚糖纳米缓释载体复合体，体外实验检测其生物学性能和机械性能，同时检测支架复合体中骨形态发生蛋白2的仿生释放的时效、量效特点。 1  材料和方法  Materials and methods 1.1  设计  材料学研究。 1.2  时间及地点  实验于2015年2至10月在中国海洋大学中心实验室完成。 1.3  材料  聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)购自济南贷罡生物有限公司，其中丙交酯、乙交酯比例为75∶25；纳米级羟基磷灰石(nHA)购自美国sigma公司，直径< 200 nm；壳聚糖购自上海蓝季科技发展有限公司，其脱乙酰度> 90.0%。 1.4  方法  1.4.1  骨形态发生蛋白2纳米球及骨形态发生蛋白2缓释复合体的制备  人重组骨形态发生蛋白2购自美国Peprotech公司。实验采用离子交联法制备负载骨形态发生蛋白2的壳聚糖纳米球，即首先制备2.5 g/L壳聚糖乙酸溶液，用1 mol/L NaOH溶液调节pH至5.5，然后将10 μg/L骨形态发生蛋白2溶入到壳聚糖乙酸溶液中，三聚磷酸钠溶液(1 g/L)滴加入载有骨形态发生蛋白2的壳聚糖溶液中，置于高速离心机内(4 ℃，15 000 r/min)离心30 min，离心物于磷酸盐缓冲液中(PBS，pH=7.4)透析3次，所得即为负载骨形态发生蛋白2的壳聚糖纳米球；采用560 g/L β-甘油磷酸钠作为交联剂，将20 mg 骨形态发生蛋白2壳聚糖纳米球加入20 g/L壳聚糖乙酸溶液中溶液中震荡溶解，560 g/L β-甘油磷酸钠溶液逐渐滴加入混合溶液中，置入37 ℃恒温水浴锅内约15 min，完成细胞因子缓释系统的制备。 1.4.2 3D生物打印PLGA/nHA支架骨形态发生蛋白2缓释复合体  按PLGA∶nHA=4∶1加入1，4-二氧六环溶液(上海源叶生物有限公司)中，37 ℃搅拌溶解后冻干。将冻干材料装入3D生物打印机(青岛尤尼科技有限公司，organisms 2500 X)A桶内，并将温度调整至  130 ℃，将PLGA/nHA冻干材料熔融；将骨形态发生蛋白2纳米球缓释系统装入温度为4 ℃的B桶，保持B桶内温度，3D生物打印机采用机械式直推，打印喷头直径约300 μm，层厚200 μm，推料速度2.7 mm/s，打印速度  4 mm/min，复合体经电脑辅助设计成形，由打印机按预设参数在4 ℃恒温超净台内分层打印成形，制得PLGA/nHA支架-骨形态发生蛋白2细胞因子缓释复合体(图1)。 1.4.3 PLGA/nHA支架骨形态发生蛋白2缓释复合体形态观察及体外降解实验  取6个边长为10 mm的正方体支架，利用介质浸泡法计算支架孔隙率；扫描电子显微镜(JEOL JSM-840)下观察支架表面形态和内部结构；利用B1-223A生物光学显微镜(麦克奥迪，香港)测量孔径大小；利用万能实验机(岛津AGS-J，日本)进行力学性能测定，支架断裂时强度对应着其所能承受的最大压应力；将6个支架放入37 ℃含溶菌酶(Amresco，美国)的PBS(pH=7.4)溶液内，16周内不定时测定溶液pH值变化；将PLGA/nHA支架取出后冻干，计算质量损失率Rm(%)=(m0-mt)/m0×100%和体积损失率Rv(%)= (V0-Vt)/V0×100%。体积保有率=1-体积损失率(Rv)。V0，m0分别为支架原始体积及质量，Vt，mt分别为各观察点的支架体积及质量。 1.4.4  骨形态发生蛋白2缓释复合体体外蛋白缓释实验离子交联法制备的骨形态发生蛋白2纳米球作为实验对照组[9]，将20 mg骨形态发生蛋白2纳米球和含20 mg骨形态发生蛋白2纳米球的PLGA/nHA细胞因子缓释复合体各6个放入37 ℃ PBS(pH＝7.4)溶液中，分别于1，3，6，12，24，48，72 h及之后每间隔3 d(终点为30 d)取出2组试管，利用ELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)检测并绘制释放曲线。 1.5  主要观察指标  ①PLGA/nHA支架的孔隙率。②支架的孔径。③支架的机械强度。④体外降解实验。⑤PLGA/nHA支架骨形态发生蛋白2缓释复合体的体外蛋白缓释效果。 1.6 统计学分析  数值以 A B 图1 聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石(PLGA/nHA)支架-骨形态发生蛋白2细胞因子缓释复合体的制备 Figure 1 Preparation of polylactic-co-glycolic acid/nano- hydroxyapatite scaffold/bone morphogenetic protein-2 sustained release composite 图注：图A为3D生物打印机，B为冻干后的PLGA/nHA混合材料。 C B A 图2 聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石(PLGA/nHA)支架骨形态发生蛋白2缓释复合体形态 Figure 2 Morphology of polylactic-co-glycolic acid/nano-hydroxyapatite scaffold/bone morphogenetic protein-2 sustained release composite 图注：图中A、B为PLGA/nHA细胞因子缓释复合体打印成品可见其支架顶端有泡沫样物质，而非C，D图内多孔样形态，是因为PLGA/nHA内含有骨形态发生蛋白2缓释复合体；C、D为PLGA/nHA支架结构打印成品。 A B 图4 聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石(PLGA/nHA)细胞因子缓释复合体的超微形态 Figure 4 Ultrastructural of polylactic-co-glycolic acid/nano-hydroxyapatite scaffold/bone morphogenetic protein-2 sustained release composite 图注：图中A为骨形态发生蛋白2壳聚糖纳米球(箭头)包裹于壳聚糖水凝胶内部；B为支架孔径规则，连通性好；C为细胞因子缓释系统(箭头)呈疏松多孔性介于PLGA/nHA支架间。 时间(周) 蛋白累计释放率(%) 图7 骨形态发生蛋白2壳聚糖纳米球与聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石(PLGA/nHA)支架骨形态发生蛋白2缓释复合体体外蛋白累计释放图 Figure 7 The cumulative release of the bone morphogenetic protein-2 from the nanospheres and the scaffold-cytokine composite in vitro 图5 聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石(PLGA/nHA)支架降解后pH的变化 Figure 5 The change of pH value at different time points after degradation of polylactic-co-glycolic acid/nano-hydroxyapatite scaffold 图注：PLGA/nHA支架降解后pH值呈下降趋势。 图3 聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石(PLGA/nHA)支架骨形态发生蛋白2缓释复合体的孔径 Figure 3 The pore size of the polylactic-co-glycolic acid/nano-hydroxyapatite scaffold/bone morphogenetic protein-2 sustained release composite 图注：图中L1为交叉点距离，L2为PLGA/nHA支架孔径。 D C 骨形态发生蛋白2纳米球 PLGA/nHA支架-骨形态发生蛋白2缓释复合体 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 时间(d)