疆不同地区牛粪源大肠杆菌O157H7分离鉴定及毒性分析

菌株及来源 ．9 2．1．3主要试剂 ．．1 0 2．1．4主要仪器 一1 O 2．1．5引物的合成 。1 O 2．1．6试验方法 一1 O 2．2试验结果 1 2 2．2．1 SMAC平板选择性培养结果 一12 2．2．2 MUG试验结果 ．1 2 2．2．3 PCR特异性检测结果 一1 3 TV 万方数据 2．2．4生化试验结果 1 3 2．3讨论 。 1 4 第3章多重PCR方法检测大肠杆菌0157：I-17 ．．16 3．1材料与方法 16 3．1．1菌株来源 ．．1 6 3．1．2主要试剂及仪器 一1 7 3．1．3引物序列 ～1 7 3．1．4试验方法 。 一17 3．2结果 ．1 8 3．2．1单一PCR反应结果 1 8 3．2．2多重PCR反应结果 1 9 3．3讨论 一20 第4章小鼠感染大肠杆菌0157：H7的临床症状及其血液生化指标变化一22 4．1材料及方法 22 4．1．1标准菌株及来源 一22 4．1．2主要仪器及试剂 一23 4．1．3试验动物 一23 4．1．4方法 ．．23 4．2结果 ．24 4．2．1动物攻毒试验结果 一24 4．2．2血涂片镜检结果 ．．25 4．2．3血常规结果 ．．25 4．3讨论 26 第5章结论 28 参考文献 29 致谢 3 5 作者简介 ．=．．． 36 V 万方数据 新疆农业大学硕士学位论文 第1章前言 大肠杆菌(Escherichia coli，E cold可分为致病性和非致病性两种不同类型。其中 致病性大肠杆菌(Enteropathogenic E coli，EPEC)菌群又可根据相同的或密切相关的 毒力因子分为不同血清群或血清型。在讨论EPEC菌体抗原(O抗原)、鞭毛抗原(H 抗原)血清型的分类和致病性问题上，过去曾强调O抗原、荚膜抗原(K抗原)的重要 性，对于H抗原不是很重视。我国在开展内病原性大肠杆菌研究中一开始就很注重菌株 全面血清学(O：K：H)的鉴定，根据H抗原的分类结合生化特性，最终提出了主要流行 血清型的新概念【l埘。EPEC国际会议上，丹麦Orskov也提出了相似的主张【3】。*rskov总 结他们32年的研究成果认为在EPEC血清型鉴定中无需对K抗原进行测定，而在他有 关致病性大肠杆菌的论文中也不再列入K抗原【4】。目前一致认为在确定EPEC菌株时， 只需用O：H血清型定型即可。 当前国际上已发现170多种携带有不同菌体抗原的大肠杆菌，其中有一些血清型比 较特别的菌株具有致病性，人类感染该致病性菌株后可引起腹泻、肠炎等一系列相类似 的临床症状。根据E coli引起人感染性腹泻机致的不同，EPEC可分为5类：肠致病性 大肠杆菌；产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic E coli，ETEC)；肠侵袭性大肠杆菌 (Enteroinvasive E coil，EIEC)；肠道聚集黏附性大肠杆菌(Enteroaggregative E coli， EAEC)和肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhage曼coli，EHEC)。其中EHEC的命名是 因能引起人出血性肠炎，现阶段对EHEC血清型研究主要是几种常见的血清型：分别是 E髓C 0157：H7血清型、EHEC 026：H1 l血清型、EHEC 01 ll：B4血清型等。主要病原 菌的研究目前在国内和国外主要是倾向于E．coli 0157：H7，还包括E coli 026：H11和鞭 毛无动力的E coli 0157：NM菌株等【5】。 1．1．2大肠杆菌0157：H7在全球的流行情况 1982年，因出血性肠炎(Hemorrhagic enteritis，HC)事件的暴发，美国首次 万方数据 预疆不同地区牛粪源大砀秆蔼ols7：m分离鉴定及霉往研究 ii i- 了该事件源头是由E coli0157：H7引起的。此次事件之后，在日本、英国、加拿大、澳 大利亚等国家也接连不断发生因E coli 0157：H7引起的各起食物中毒事件。1996年， 日本爆发了范围涉及广、人数涉及上万人的E coli0157感染事件，感染期不到短短2 周就已经有1 1人死亡。据美国相关调查数据显示：因E coli 0157：H7影响，每年造成 的经济损失可达数百万之多【6】。1986年，我国江苏省初次从一例腹泻患者粪便中分离到 了E coli 0157：H7菌株。1999年，E coli 0157：H7在徐州市及邻近的安徽省发生暴发感 染，195例HC患者中有177人死亡【7】，而多数的病人主要集中在年龄稍长的阶段。2000 年，河南也报道35个感染E coli 0157：H7的新病例，其中28例在感染后死亡。在中国， 由于E coli 0157疫情只是针对于E coli 0157感染的几个零星的病例报告，所以长期以 来科研工作者只根据调查报告也不能确切的定义其疫情来源【8-11]。 1．1．3大肠杆菌0157：H7的传播途径 E coli 0157：H7作为一种人畜共患病原菌，可通过动物源性食品传染给人，未充分 熟的牛肉和牛奶常被认为可引起该病原菌传播的主要因素。很多调查结果表明，牛、羊、 猪等家畜是E coli 0157：H7重要的寄生宿主，携带该菌的阳性率要高于其他宿主【12】。牛、 绵羊和山羊等一些反刍动物可在粪便中携带E coli 0157：H7，所以粪便也被视为这种病 原微生物的自然储存地【13】。 1．2大肠杆菌0157：H7毒力因子及致病机制 现今很多国内外文献中对E coli 0157：H7感染机体相关致病机制表述并非是彻底 清晰明确的，所以E coli 0157：H7毒力因子的研究对分析该菌有举足轻重的作用。E coli 0157：H7携带的重要毒素有志贺类毒素(Shiga toxins，．溉)、紧密黏附素(Intimin)、 溶血素(Haemolysin，h／y)和菌体脂多糖(LPS)基因等。 1．2．1志贺样毒素 产志贺毒素大肠杆菌(Shinga Toxin-producing E coli，STEC)可诱发HC和溶血性尿 毒综合症(Hemolytic-uremic syndrome，HUS)疾病。Stxs包括志贺毒素(Shiga toxin， Stx)和志贺样毒素(Shiga．1ike toxin，SLT)【14】，SLT能使非洲绿猴肾细胞(Vero)坏死， 万方数据 颓疆农业大学硕士学位论文 故又称其为Vero细胞毒素Wero toxin，玎)。VT分为stxl和stx2，其两者有相类似的生 物学活性，区别在于它们的抗原性不同。对于感染E coli 0157：H7后引发腹泻、HC和 HUS等临床疾病的机制尚且不能确定，但有许多研究表明其中0157：H7毒力因子SLT 在引起这些症状中起到了重要作用。HUS是一种肾功能急性衰竭、血小板病理性减少、 微血管溶血性贫血为主要临床反应的综合病征。毒力因子SLT主要通过两步诱发HUS。 第一步：肾小球基底膜细胞、肾近曲小管上皮细胞和附着的巨噬细胞或单核细胞通过分 泌大量的细胞因子和趋化因子对SLT毒力因子的入侵发挥免疫应答，使机体相应部位产 生炎症反应。第二步：细胞因子和趋化因子作用肾髓袢内皮细胞，使鞘糖脂(Gb3)表 达于细胞表面，Gb3与SLT特异性结合，SLT通过胞吞作用进人细胞内发挥细胞毒作用。 同时这些因子还能使中性粒细胞黏附于肾髓袢内皮细胞，进而加重对细胞的损害【15】。更 有研究表明在引起疾病HC和HUS的过程中，stx2相比stxl的致病力更强【16'17】。因此， 玎不同类型的毒力因子将为我们在临床医学和流行病学中区分不同亚型提供依据。 1．2．2紧密黏附素 Intimin是一种分子量大小为97 kD的外膜蛋白，由E coli 0157：H7染色体上的肠细 胞脱落位点(LEE)毒力岛eaeA基因编码，同时也是一种胞外特异性肠道黏附因子。 虏E coli 0157：H7编码的转位紧密黏附素受体(Tir)、,Ol整合素和核仁素是目前公 认的3种Intimin受体。在E coli 0157：H7感染初期，Ⅲ型分泌系统(Type III secretion system，TTSS)与Ⅲ型分泌蛋白(EspA)形成丝状Ⅲ型分泌系统(Filamentous TTSS， FTTSS)，该系统以一种类似“注射器”样的结构介于细菌和宿主细胞中间，其功能是将 Tir转位、吸附在宿主的细胞膜上，并使Tir位于不依赖信号肽的TTSS顶端。借助FTTSS 的同时，Intimin和Tir结构域紧密结合在宿主细胞膜上，最终将入侵细菌牢固的黏附在 宿主肠道黏膜上。Tir以非酪氨酸磷酸化方式活化细胞骨架偶联蛋白(Teep)，Teep进一 步活化Wiskott-Ardrich综合症蛋白和蛋白复合物，产生级联放大信号，激发肌动蛋白聚 合，从而使磷脂双分子层重排后形成基座蛋白，小肠微绒毛纹状缘逐步消失最终致使机 体产生擦拭性损伤(A／E)。同样在Tir的作用下，Intimin与核仁素、声l整合素的相互作 用被抑制；当Tir缺乏时，Intimin才能表现相应的活性，形成擦拭性损伤[18】。 万方数据 巍疆不葡地区牛粪源太肠杼馥ol s7：m分离鉴定及毒性研究 ===詈詈詈詈詈皇詈皇詈I 一 。--I-． -．． -一一 ．一I詈詈暑詈詈|詈詈詈篁 1．2．3溶血素 大多数的E coli 0157：H7均含有一个分子量为92 kb的毒力质粒p0157，该质粒编 码一种h／y蛋白，Law[19】等研究了E coli 0157和其它产毒素大肠杆菌利用血和血红蛋白 的情况，结果发现血和血红蛋白可刺激E coli 0157：H7生长，继而产生肠溶血素，而非 E coli 0157菌株的这些特性明显较低。hly是由p0157中一个分子量为3．4 kb的片段所 编码的基因，同时也是组成孔道形成细胞溶素的重要构成，其主要功能是在机体靶细胞 膜上形成孔道，继而发挥对靶细胞的杀伤作用。溶血素基因hly主要由4个片段构成： 分别是A片段(hlyA)，B片段(htyB)，C片段(htyC)和D片段(htyD)，这四个片 段均是厅咖合成和转运所必需的。hly可在细胞表面形成膜孔主要是依靠静电作用将这些 片段锁定在细胞膜及其结构域上，从而，hly溶解细胞的活性依赖该环境的适宜温度， 只有在O-4℃以上的环境温度时溶血素才具有溶解活性，在37℃时溶解活性达到最佳 效果。hly的致病机制目前尚不清楚，可能因hly发挥溶解红细胞的作用导致红细胞内血 红素和血红蛋白的释放，从而促进了E coli 0157：H7的生长，也为细菌的生长提供了铁 源。 1．2．4菌体脂多糖基因、鞭毛基因 rfoe基因是编码E coli 0157：H7 LPS的最主要致病基因。Bilge等通过研究编码E coli 0157抗原的基因簇发现其中7弦P基因是E coli 0157血清型的特异基因，同时也是 E coli 0157独特的特异性抗原基因【20】，其中特异性rJbe基因位于菌体细胞壁脂多糖 (Lipopolysaccharide，LPS)的侧链上，其抗原性很好，能使机体产生特异性抗体。很 多利用细胞壁LPS抗原性检测抗0157：H7抗体诊断E coli 0157：H7感染的研究也已在 国外的相关报道中被发现【21122]。LEIWANG等分别对166种不同血清型E coli 0157 O抗 原基因簇进行测序后对比发现E coli 0157的帕P基因的序列与其它细菌类似功能基因 的序列没有同源性，证明帕P为E coli 0157的特异基因【23】。 编码E coli 0157：H7鞭毛H7的脚基因也是E coli 0157：H7的特异性基因，该鞭 毛抗原化学成分为蛋白质，其抗原性较强。E coli 0157：H7有周生鞭毛，鞭毛呈单线状， 长15．20岬，直径为0．01．0．02岬，蛋白分子量约为60 kD，也有研究利用E coli 0157：H7 4 万方数据 颞疆农业大学硕士学位论文 l I IIIII 鞭毛的特异性抗体诊断E coli 0157：H7感染。虽然有一些E coli 0157可能由于环境等 因素的影响，会出现暂时缺失鞭毛的情况，但一般通过简单地诱导后其鞭毛就可完全恢 复。 1．2．5其他相关因子 E coli 0157：H7除上述主要的毒力因子外，还有其他许多与毒力相关的因子，例如 细胞外丝氨酸蛋白酶、艰难梭菌类毒素、过氧化物酶、肠凝集性热稳定毒素(Heat stable enterotoxin，ST)、淋巴细胞抑制因子等。 细胞外丝氨酸蛋白酶：用培养液对E coli 0157：H7进行培养，检测培养液时可检测 到多种蛋白，如E coli分泌型蛋白A(E coli Secreted proteinA，EspA)、E coli分泌型 蛋白B(E coli Secreted protein B，EspB)、E coli分泌型蛋白D(E coli Secreted protein D，EspD)和E coli分泌型蛋白E(E coli Secreted protein E，EspE)等。细菌培养基与 生长温度等条件可调控作为intimin受体EspE的表达。在细菌感染的早期阶段，EspA 通过运送EspE等细菌蛋白到宿主的细胞质而发挥其传输作用。Brunder[241等报道E coli 0157：H7能分泌一种E coli分泌型蛋白P(E coli Secreted protein B，EspP)蛋白，该蛋 白分子量大小为104 kD，由p0157质粒介导编码。有研究表明该EspP蛋白对某些底物 (如人的凝集因子V)具有蛋白溶解活性。由此提示EspP在E coli 0157：H7菌株致病 过程中可能起到影响血液的凝集的作用，在疾病的发生过程中起一定的影响作用。 艰难梭菌类毒素：E coli 0157：H7的大质粒p0157中有一比较大的编码复杂蛋白的 开放阅读框(L7095)，其中这些复杂蛋白是由3169个氨基酸组成且与艰难梭菌肠毒素 和细胞毒素在内的梭菌毒素家属的N末端前700个氨基酸残基排列基本相类似，并且由 艰难梭菌肠毒素引发的肠炎与感染E coli 0157：H7后引发的HC症状尤其相似，由此可 推测肠道组织的病变与上述p0157中的开放阅读框有关。 过氧化物酶：p0157质粒中还有一个与多种细菌过氧化物酶同源的三磷酸腺苷 (Adenosine triphosphate，ATP)敏感性钾通道(KATP)基因，该基因编码一个分子质 量为82 kD的蛋白，且该蛋白具有过氧化氢、过氧化物酶的双重功能。E coli 0157：H7 所产生的过氧化物酶和超氧化物歧化脱酶可使细菌逃避宿主的防御系统，继而使宿主巨 万方数据 飘疆不葡地区午粪源大肠秆琶0157：H7分离鉴定及霉性研究 噬细胞和嗜中性细胞的氧化失去作用。 肠凝集性热稳定毒素：某些E coli 0157：H7可能携带热稳定性肠毒素(astA)基因， 而由astA基因编码的肠凝集性热稳定毒素蛋白可能与E coli 01 57：H7感染病例中具有 HC症状患者的水泻有关。 淋巴细胞抑制因子：Klapproth[2Sl等的研究成果发现E‘coli 0157：H7可产生一些由染 色体编码的蛋白因子，这些蛋白因子能抑制宿主淋巴细胞的活性和淋巴因子的释放，从 而对宿主的免疫应答造成一定的影响。 1．3大肠杆菌0157：H7国内外检测技术 目前国内外对于控制人感染E coli 0157：H7并无具体有效的实施办法，应用抗生素 对细菌滋生无抑制作用，反而会导致细菌破裂加快E coli 01 57：H7 SLT的释放速度，因 而更加促进HUS的发生。E coli 0157：H7是能够对人类卫生健康造成重大影响的病原 微生物之一，所以我国现已将其归为可能造成人食源性疾病的12种病原微生物之一。 因E coli 0157：H7菌株培养周期短、繁殖量大、感染力强、且存在人感染后致死率高等 特点，未来的军事研究很可能会倾向将单纯的细菌个体演变成细菌战剂应用于军事斗 争。所以当E coli 0157：H7成为可能造成全球性公共卫生问题的源头时，对其特异、方 便、快速的独特检测方法的研究就显得尤其重要。近几年，随着生物分子诊断技术的飞 跃发展，国内外检测研究都竞相使用更为准确、快速的检测手段，其检测方法大部分都 撇弃了传统的分离培养，用更加准确的免疫学方法以及分子生物学方法。 1．3．1表面等离子共振检测技术的应用 表面等离子共振是一种无需对试样标记、分离纯化就可确定样品种类和样品浓度的 检测技术。它的优点就在于可方便研究者通过在线的方式对生物分子间的相互作用进行 实时监测。该检测技术已被我国广泛应用于食品、微生物、安全环境等多个监测领域， 更深一步发挥了其灵敏度高、适用范围广、样品无需标记的特点。姚辉126】等将亲和素． 生物素系统和银纳米粒子结合表面等离子共振生物传感器检测方法检测大肠杆菌E．coli 0157：H7。这三种技术的同时运用使样品检测信号被放大多倍，大肠杆菌的检测限也通 6 万方数据 藏疆农业大学绶士学位论文 II I II II 11 11 I[ ]1 I 过表面等离子共振生物传感器被扩展到更低的检测限。刘霞【27】等采用三明治夹心法【28】， 其中E coli 0157：H7多克隆抗体为一抗，金纳米粒子标记E．coli 0157：H7复合物 (AuNPs．PAb)为二抗，结合双通道表面等离子共振传感器检测E coli 0157：H7的检出 限为10 CFI 7／mI，。 1．3．2免疫胶体金技术的应用 免疫胶体金技术是一种利用抗原抗体特异结合、并且以胶体金作标记物的新型免疫 标记技术。现今应用最多的是以膜为固相载体的免疫胶体金技术，该技术主要包括两个 试验：免疫层析试验(Immunoehromatographic assay，ICA)；免疫渗滤试验 (Immunofiltration assay，IFA)。其技术在免疫检测中的重要参与物胶体金是一种特定 大小的金颗粒，一般大小范围在1．100 am之间，因静电作用而呈现出一种稳定的胶体 状态。胶体金表面的负电荷可与蛋白质分子的正电荷基团相互吸引后在胶体金表面形成 牢固的结合物，当大量结合物聚集时，胶体金具有的高电子、高密度特性使大量聚集的 结合物形成肉眼可见的红色斑点，从而帮助我们快速定性免疫检测。黄岭芳等【29】利用多 克隆抗体和驴抗鼠抗体(二抗)作为检测线(T线)和质控线(C线)，研制出了快速检 测E coli O 1 57：H7的胶体金试纸条，通过用纯培养E coli O 1 57：H7菌株检测胶体金试纸 条的检测限和灵敏度，结果显示可检测E coli 0157：H7菌株的灵敏度为105个细胞／mL。 熊齐荣等【。o】利用免疫磁珠富集法结合胶体金试纸条检测法，建立了一种快速、准确检测 E coli 0157：H7的检测方法，使检测灵敏度达到7．6x103 CFU／mL，这种联合检测法的应 用比直接利用试纸条检测法提高了一个数量级。 1．3．3核酸徽阵列生物芯片分析法的应用 生物芯片技术主要是一种运用微型生物化学分析系统实现对生命体各组织中的核 酸、细胞形态、蛋白质组成、以及其他生物组分进行准确、快速、大信息量检测的新型 技术。Douglas R等用多重聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)结合核酸 微阵列生物芯片分析方法，以此来研究E coli 0157：H7的基因分型。该阵列比凝胶电泳 敏感32倍，能够从极少量的基因组DNA中检测扩增产物【3l】。 万方数据 詈詈詈暑詈暑 , 新疆不l司地区牛粪源大肠秆萄0157：H7分离鉴定及霉性砚冤 i!詈皇皇暑昌==詈 I,I。r II I,1 ii 1．3．4荧光纳米技术的应用 荧光纳米粒子是指通过包埋、共价键连接、超分子组装等方式将可发荧光的半导体 纳米微晶体或荧光团引入有机纳米粒子或无机纳米粒子中后形成的复合物。荧光纳米粒 子具有高亮度、光照稳定、水分散性和生物相容性等特点。目前荧光纳米粒子主要有三 大类：分别是无机发光量子点、荧光高分子纳米微球和复合荧光二氧化硅纳米粒子。周 丽霞【32】等建立了一种将高荧光强度的联吡啶钌二氧化硅荧光纳米颗粒与激光共聚焦显 微成像法相结合的试验方法检测E coli 0157：H7，试验结果证明该双色显微成像技术的 建立可以迅速、准确的从大量非目标菌存在的体系中检测到少量目标E coli 0157：H7。 万方数据 新疆农业大学硕士学位论文 II II II 第2章磁珠富集结合PCR方法分离鉴定大肠杆菌01 57：H7 E coil 0157：H7是引起人类感染性腹泻的病原菌，E coli 0157：H7可产生Stx、hty 和Intimin等很多对人体造成严重损害的毒力因子【33】。同时该菌作为一种人畜共患病原 菌，也可以通过动物源性食品将这种病原菌传染给人。很多调查结果表明，牛、羊、猪 等家畜是E coli 0157：H7的主要宿主，而其阳性率则高于其他宿主【34】。国外很多地方从 牛的粪便中已分离到了该茵，并进一步证明了该菌与食源性疾病的相关性，同样我国也 做了相应的研究，包括从肉类食品、乳制品、家畜粪便中也分离到了该茵。 免疫磁珠(Immunomagnetic beads，IMMs)技术是指将有免疫活性的物质包被磁性 微球表面，然后进行免疫学分离细菌、细胞等应用的一种新型技术【35】。基本原理是利用 磁场吸引结合有抗原．抗体复合物的磁性微球，微球在磁力作用下发生移动，继而使微 球表面上与抗体特异性结合的抗原与其他杂质分离【s6】。本试验利用该新型免疫学方法结 合PCR鉴定对所采粪样进行E coli 0157：H7的分离鉴定，了解新疆这三个地区不同牛 场大肠杆菌O 1 57：H7的流行情况 2．1材料与方法 2．1．1样本来源 表2．1粪便样品来源 E coli0157：H7标准菌株(菌号：CICC 21530；中国工业微生物菌株保藏中心提供)： E coli标准菌株(菌号：CICC 10389；中国工业微生物菌株保藏中心提供)。 9 万方数据 2．1．3主要试．剂 山梨醇麦康凯培养基(Sorbitol—MacConkey Culture Medium，SMAC)、E coli营养 肉汤(EC肉汤)、细菌基因组DNA提取试剂盒、4．甲基伞形酮毋D葡萄糖醛酸苷培养 基(4一methylumbelliferone-fl-Dglucuronide，MUG)均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责 任公司；PCR反应相关试剂购自上海生工生物工程股份有限公司；肠杆菌科细菌生化编 码鉴定管GYZ-15 e购于杭州天和微生物有限公司；E coli 0157：H7免疫磁珠(Dynabeads anti-E．coli 0157：H7)由俄亥俄州立大学Jeffery教授惠赠。 2．1．4主要仪器 TPro fessional高性能梯度PCR仪(Biometra)；空气浴振荡培养箱(型号MODEL： ST-F160AC)；eppendorfCentrifuge 5415R离心机；SW-CJ一2F双人双面垂直洁净工作台 (上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；XH．C型漩涡混合器(江苏省金坛市医疗仪器 厂)；磁力架(Dynal．MPC-S，由俄亥俄州立大学Jeffery教授惠赠)；DYY-6 C型电泳仪 (北京市六一仪器厂)。 2．1．5引物的合成 从Gene Bank及参考相关文献选取和E coli 0157：H7的rfbe和．∥疋引物。咖P， F．A1rT GCG CTG AAG CCT TTG，R-CGA GTA CAT TGG CAT CGT G，拟扩增片段长度 为500 bpt37】；∥iC，F-GCG CTG TCGAGT TCTATC GAG C，R-CAA CGG TGA CTT TAT CGC CAT TCC，拟扩增片段长度为625 bpt38】。引物均由上海生工生物工程股份有限公 司合成。 2．1．6试验方法 2．1．6．1增菌培养 采集的319份样品及时在无菌环境下称取25 g加入到高压后无菌的含有225 mL EC 肉汤的三角瓶中，摇床上37℃过夜培养。 2．1．6．2免疫磁珠捕获与分离 按照国标GB／T 4789．36．2008的操作方法进行，具体步骤：(1)取高压好的1．5 mL 10 万方数据 蹶疆农业大学硕士学位论文 离心管，依次编号(包括阴性和阳性质控菌)，先加l mL增菌液，再分别向每个1．5 mL 离心管中快速加入20皿抗E coli 0157：H7的免疫磁珠悬液。(2)将上述1．5 mL离心 管置于试管架上，并连同试管架用手轻轻微转10 min，使免疫磁珠与菌液充分接触。(3) 将试管架放置于磁力架上，不断倾斜并上下颠倒磁板架3 min(确保悬液中与离心管盖 子上的免疫磁珠全部都被吸附聚集)。(4)轻微倾斜磁板架，将枪头缓慢深入免疫磁珠 聚集物对侧的倾斜液面，轻轻吸走浑浊上清液。如枪头内吸取的上清液内含有红褐色聚 集物，则应将液体再打回至1．5 mL离心管中，并重复上一操作步骤。(5)取出试管架， 在每支1．5 mL离心管中加入l mL缓冲蛋白水，上下颠倒翻转磁板架至少三次，多次洗 涤免疫磁珠混合物，再重复上述(3)，(4)，(5)操作步骤。(6)重复(3)，(4)操作 步骤。(7)移走磁力架，使免疫磁珠聚集物重新与100 gL缓冲蛋白水混合。⑨将缓冲 蛋白水与免疫磁珠吹打混匀，取50此免疫磁珠悬液至SMAC平板的一侧，用无菌棉签 将免疫磁珠悬液涂布SMAC平板的一半，再用接种环接种平板的另一半。在无菌通风 环境下使平板自然晾干，当琼脂平板表面水分完全被蒸发后，翻转平板置37℃恒温箱 培养24 h后观察平板表面菌落形态。 2．1．6．3 MUG试验 分别从每个SMAC平板上挑取5个白色、透明的菌落接种于含MUG的培养基中， 37℃培养18．24 h。将培养后的MUG培养基在暗处用波长为336啪、功率为6 W的紫 外光灯照射观察，选择并保留不发蓝白色荧光的菌株纯培养。 2．1．6．4 PCR鉴定 (1)细菌DNA模板的制备挑取单个菌落至50皿TE缓冲液中，用移液枪将缓 冲液反复吹打混匀，95℃5 min PCR仪加热，使菌体热解释放基因组DNA，成为PCR 体系的模板。 (2)PCR反应各反应体系总量均为25儿，其中砌聚合酶预混染料(2xEs Taq Master Mix)12．5止；F-Primer l皿；R-Primer l此；细菌DNA模板l此；无菌水加 至25灿。．肛基因的PCR反应参数：95℃预变性5 rain，94℃变性30 S，58℃退火45 s，72℃延伸45 S，30个循环，72℃延伸10 mira rfbe基因的PCR反应参数：95℃预 变性5 rain，94℃变性30 s，54℃退火30 S，72℃延伸45 S，30个循环，72℃延伸10 min。 万方数据 新疆不葡地区牛粪源大物杆菌0157：H7分离鉴定及毒性研究 扩增后的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像分析系统观察结果。 2．1．6．5生化鉴定 根据E coli 0157：H7的生理生化特性，对于PCR鉴定rfbe基因扩增出500 bp条带、 fliC基因扩增出625 bp条带的菌株用肠杆菌科细菌生化编码鉴定管进行鉴定，验证PCR 检测结果。 2．2试验结果 2．2．1 SMAC平板选择性培养结果 标准E coli 0157：H7在SMAC平板上的形态为圆形、光滑、较小的无色菌落(图 2．1)；标准E coli在SMAC平板上菌落形态为红色菌落。通过细菌在SMAC上的菌落 形态初步筛选出疑似E coli 0157：H7菌株。 一 m2．1 E coli 0157：H7菌落形态 图2．2 E coli菌落形态 图2-3分离菌株SMAC检测板 2．2．2 MUG试验结果 97％￡cDli含有葡萄糖醛酸苷酶，MUG作为培养基可被水解，水解后释放的4一甲 基伞形酮在紫外灯照射下产生蓝白色荧光(图2．4)。SMAC平板筛选出的疑似E coli 0157：H7菌株进行MUG试验后总计1 18株细菌不产生蓝白色荧光。 12 万方数据 图24标准E coli(左)，标准E coli0157：H7菌(右) 图2．5部分菌株MUG试验图 2．2．3 PCR特异性检测结果 118株MUG试验不发荧光的菌株经ifbe基因、fliC基因PCR特异性扩增后，67株 细菌可扩增出．∥?C基因(图2—7)，在625 bp出现典型单一条带；67株扩增 flic基因 片段的菌株进行,；／be基因扩增后其中10株细菌可在500 bp出现典型单一条带(图2．6)。 2000 bp 25 bp 图2-6．帕P基因PCR凝胶电泳图 图2．7．fliC基因PCR凝胶电泳图 注：图2-6：M：DL2000 Marker；+：标准E coli0157：H7(21530)；．：标准E coli(10389)；1，2为被检样：图2．7：M：DL2000 Marker；+：标准E coli 0157：H7(21530)：-：标准E coli(10389)；2-7：1．4为被检样： 用肠杆菌科细菌生化编码鉴定管对lO株能扩增出，扣e基因、fliC基因条带菌株进 行生化检测，结果10株细菌生化反应结果符合国标GBT4789．36．2008中E coli0157：H7 的鉴定标准(表2．2)，同时也与PCR扩增结果完全相同。 万方数据 新疆不同地区牛粪源大酝孝}蕾015，：m分离鉴定及毒性研究 表2-2．部分生化试验结果表 2．3讨论 本试验对新疆伊犁、塔城、阿克苏三个地区不同牛场采集的319份粪便样品进行E coli 0157：H7的分离与鉴定，分离到lO株E coli 0157：H7菌株，检出率为3．13％。E coli 0157：H7是一种国内外研究比较多的人畜共患病原菌，而新疆对于该菌的研究文献和调 查方法却很少。近几年国内很多地区对于该菌的感染情况进行调查并予以报道，2002 年何泽民等对安徽江淮地区家畜家禽粪便和苍蝇样本E coli 0157：H7的感染情况进行 了调查，检出两株E coli 0157：H7139]；2012年赵秋华等对上海地区280份不同猪场的样 品分离鉴定后得到2株E coli 0157：H7，一株携带stxl基因、eaeA基因，另一株仅检 测出毒力基因eaeAt。刚。对于该病原菌的鉴定，本试验使用PCR方法鉴定菌株特异性rfbe 基因、filC基因的同时结合生化试验，确定菌株生化特性的同时验证PCR结果的准确性。 本次试验从牛粪便中共分离到10株E coli 0157：H7，推测排泄被感染病原菌粪便的家 畜可能是带菌动物，而携带E coli 0157：H7的家畜在排出粪便时，由它们生产的牛肉或 牛乳都可能被该菌污染，所以及时发现并切断感染途径的工作尤为重要。 目前，分离鉴定E coli 0157：H7的方法有多种，传统的试验室检测方法主要是细菌 的分离鉴定和常规的血清学试验，但这些方法存在耗时、特异性不高等缺点。而本试验 应用了新的免疫学磁珠富集技术，该免疫学方法能从含有大量杂菌的样品中快速、特异 性地分离出目的细菌，在减少其他杂菌干扰的同时，也为我们从杂菌中快速分离出目标 细菌缩短了筛选时间。近年来，利用11V11VIs富集分离的方法引起了人们广泛的关注，关 于该项新技术也有很多文献报道。Grossman等将IMMs和超导电子干涉装置两种方法 14 万方数据 飘疆农业大学礤士学位论文 结合用于细菌检测【41】。Kalnauwakul等利用IMMs技术对人工接种E coli 0157：H7的粪 便样品进行了检测，其中检出E coli 0157：H7的灵敏度为102-103 CFU／gt42】。Islam等的 研究也发现IMMs的检测灵敏度要明显优于PCR、法【43l。 毒力基因是病原菌感染机体很重要的影响因素，选择特异性的靶基因对检测E coli 0157：H7至关重要。大多数研究都选择检测E coli 0157：H7的脱丁基因、eaeA基因的 保守区或者hly基因等[44。46】，虽然E coli 0157：H7含有这些基因，但这些基因不是E coli 0157：H7所特有的基因。本试验以E coli 0157：H7的，徊e、filC基因为特异性扩增片段 进行PCR扩增，对预防和控制E coli 0157：H7在新疆的流行具有重要的兽医公共卫生 意义。 万方数据 新疆不同地区牛粪源大酝杼菌0157：}n分离鉴定及毒性研究 =詈詈I i—— 。 i詈詈墨 ll 。i 第3章多重PCR方法检测大肠杆菌0157：H7 近年来，针对E coli 0157：H7致病性基因的研究已越来越深入，主要靶基因有stxl、 stx2、eaeA、咖e、hZy、fltc等【47】。对于血清型较复杂的E coli 0157：H7，多重PCR可提 高特异性，减少假阳性结果的判定。选择特异的靶基因并设计出合理的引物对多重PCR 检测E coli 0157：H7至关重要。目前多使用共同检测毒力因子基因和rJbe、fliC基因的多 重PCR方法。Visetsripong等建立了针对rfbe乘l喃素基因的二重PCR，经过8 h培养可检 测102 CFU／25 g的生蝌48】。赵志晶等建立了针对该菌特异坳疋，咖P，stxl与stx2基因的 四重PCR，用于牛奶样品中E coli 0157：H7的检测，经过培养步骤检测限可达O．1 CFU／mL；对鸡肉样品的检测敏感性为104 CFU／mLl49]。迄今为止，针对粪样中E coli 0157：H7多重PCR检测的报道存在灵敏度不高和样品培养时间较长等问题，原因多种， 如多重PCR反应系统中存在引物退火温度的不同和引物间相互干扰等。另外，样品中存 在大量竞争菌，也会大大影响检测的敏感性本文参考国内外文献报道选取E coli 0157：H71拘IfliC基因、rfbe基因、eaeA基因、stxl基因和stx2基因五个基因片段，用多重PCR 方法对E coli 01 57：H7进行扩增，能迅速检测出E coli 01 57：H7，同时又能了解E coli 0157：H7的毒力因子携带情况。 3．1材料与方法 3．1．1菌株来源 E coli 0157：H7．1—E coli 0157：H7．10菌株从新疆伊犁、塔城、阿克苏三个地区牛 场的319份粪样中分离鉴定为E coli 0157：H7。 表3-1试验菌株一览表 菌株 来源 标准E coli 0157：H7 中国工业微生物菌株保藏中心提供(CICC 21530) E coli 0157：H7 中国工业微生物菌株保藏中心提供(CICC 10389) E coli 0l 57：H7．1 新疆阿克苏新和县兴农牛场 E coli 0157：H7．2 新疆伊犁昭苏大明育肥小公牛 E coli 0l 57：H7．3 新疆阿克苏新和县兴农牛场 E COli 0157：H7-4 新疆伊犁新纪元牛场 E coli 0157：H7．5 新疆伊犁新纪元牛场 E coli 0157：H7．6 新疆伊犁昭苏大明繁育 E coli 0157：H7-7 新疆伊犁昭苏大明繁育 E coli 0l 57：H7．8 新疆塔城 E coli 0l 57：H7．9 新疆伊犁昭苏大明育肥 E coli 0157：H7．9 新疆塔城 万方数据 甄疆农业大学硕士学位论文 3．1．2主要试剂及仪器 SMAC培养基；PCR反应相关试剂购自上海生工生物工程股份有限公司：PCR仪空 气浴振荡培养箱(型号MODEL：ST-F 1 60AC)；SW-CJ．2 F双人双面垂直洁净工作台(上 海博讯实业有限公司医疗设备厂)：DYY．-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂)；凝胶成像 系统nUNS也LUMINATOR JVLABO。 3．1．3引物序列 如表3．2，从Gene Bank及参考相关国内外文献[37，38'50】选取E coli 0157：H7的相关扩增 片段。 表3-2 E coli 0157：H7特异基因引物序列及扩增片段长度 3．1．4．1细菌DNA模板的制备 挑取分离菌株于LB液体培养基中过夜培养，吸取菌液3 mL，12000 r／min离心l min 去上清_加600 pL Lysis BufferA漩涡重悬，加入20¨L Proteinase K，60℃水浴50 min， 中间颠倒混匀数次，加入10此RNaseA混匀以消化RNA，室温放置10 min左右_Lysis Bu仃er B充分混匀后加入400皿一离心12 min，将上清液垂直倒入离心柱中，12000 r／min 离心l min，弃离心柱中废液-÷加入700此按比例加入无水乙醇后的Wash bufferA， 12000 r／min离心l min后弃离心柱中废液_加入700止按比例加入无水乙醇后的Wash buffer B，12000 r／min离心l min后弃离心柱中废液一加入500此Wash buffer B，12000 r／min离心l min，弃废液_12000 r／min离心2 min后，将拔出的离心柱置于一新离心管 中，并打开离心柱盖，于室温放置10 min直至无明显乙醇味-÷在硅基质膜中央加入50止 万方数据 藐疆不同地区午粪源大肠秆萄ols’：m分离鉴定及毒性研究 TE buffer(事先预热60℃)，室温放置2 min，再次12000 r／min离心2 min，．20℃保存 备用。 3．1．4．2单一PCR方法 各反应体系均为25止，其中2xEs Taq Master Mix 12．5此；F-Primer l此；R．Primer 1此；细菌DNA模板l止；RNase-Free Water加至25皿。毒力因子fliC，咖P，stxl， stx2，eaeA的各PCR反应参数：94℃预变性5 min，94℃变性30 S，58℃(刀iC)、54℃ (咖e)、57℃(stx2)退火45 S，72℃延伸45 S，30个循环，72℃延伸10 min；扩增 后的PCR产物保存在4℃冰箱待鉴定。 3．1．4．3多重PCR方法 各反应体系均为25止，其中2xEs Taq Master Mix 12．5皿；各对引物2此：细菌 DNA模板1此；RNase-Free Water加至25此。各PCR反应参数根据试验摸索最适宜 的温度进行扩增，扩增后的PCR产物4℃保存待鉴定。 3．1．4．4 PCR产物鉴定 取5止扩增产物，在1％琼脂糖凝胶中电泳，120 V恒压电泳，DL．2000 Marker作为 分子量对照。电泳后凝胶成像系统观察。 3．2结果 3．2．1单一PCR反应结果 以标准E coli 0157：H7作为阳性对照，标准E coli作为阴性对照，对新疆不同地区分 离的10株E coli 0157：H7进行PCR扩增。lO株E coli 0157：H7菌株咖P基因、fliC基因的 PCR检测均能扩增出500 bp(图3-1)矛11625 bp(图3—2)长度的目的DNA带；stxl基因(130 bp)、stx2基因(346 bp)、eaeA基因(815 bp)的PCR扩增只有E coli 0157：H7．1、E coli 0157：H7—6、E coli 0157：H7—7Z株细菌在砌．2基因扩增时在346 bp处出现扩增带，其他7 株细菌则未扩增出目的片段(图3．3)。 18 万方数据 巍疆农业大学硕士学位论文 图3．1，拍e基因PCR电泳图图3-2fliC基因PCR电泳图 图3-3 stx2基因PCR电泳图 注：图3·1 M：DL-2000 Marker l：CICC 10389；2：CICC 21530；3：E coli 0157：H7-l：4：E coli 0157：H7·3；5：E coli 0157：H7-6：图3-2 M：DL-2000 Marker；l：C1CC21530；2：E coli 0157：H7-4；3：E coil 0157：H7-3：4：E coliOl 57：H7-2；5 E．coli 0157：H7-8：6：E．coli Ol 57：H7—10：7：E．coli 0157：H7·7；图3-3 M：DL-2000 Marker：l：E．coli 0157：H7-l：2：E． coli 0157：H7．6-"3：E coli 0157：H7-7： 3．2．2多重PCR反应结果 对咖P(500 bp)、．∥fC(625 bp)、stx2(346 bp)三对基因单一PCR中都扩增出E1 的条带的菌株进行多重PCR扩增。其中,'ybe，stx2两对基因进行二重PCR扩增，退火 温度为54℃时，可出现单一且较亮的目的条带(如图3-4)；扩增咖e，∥，C基因时退火 温度为59。C，可出现明亮条带(如图3．5)：同时对于∥疋，stx2两对基因的退火温度为 53℃可出现清晰的目的条带(如图3-6)；PCR反应参数为95℃5 min，94℃30 S，58℃ 45 S，30个循环，72℃45 S，72℃10 min；rfbe(500 bp)、flic(625 bp)、stx2(346 bp) 三对基因同时被扩增出如图3．7的目的条带。 M l 2 3 4 500 bp 346 bp 625 bp 500 bp 图3．4 rybe，stx2基N--重PCR电泳图 图3-sflic，咖e基N--重PCR电泳图 19 万方数据 颓疆不同地区牛粪源大畅杆麓0157：H7分离签定及毒性研究 25 bp 625 bp ()0 bD 346 bp 46 bD 图3-6flic，stx2基因二重PCR电泳图 图3—7fliC，rfbe,stx2基因三重PCR电泳图 注：图3-4 1：E coli 0157：H7-1：2：E coli Ol 57：H7-6：M：DL．2000 Marker：3：E coli Ol 57：H7-7：图3-5 M：DL-2000 Marker：1：C1CC 21530；2：E coil0157：H7-8；3：E coli 0157：H7-2：4：E coli 0157：H7-9：图3-6 M：DL-2000 Marker；1：E coliOl57-H7．6：2：E coliOl57：H7．7：3：E．coil01 57：H7·1：图3—7M：DL-2000Marker：l：E coli0157：H7-7：2E coli Ol 57：H7-6：3：E coli 0157：H7-1 3．3讨论 对E coli 0l 57：H7常规分离常用到头孢克肟．亚碲酸钾．山梨醇麦康凯培养基 (Cefixime Potassium-tellurite Sorbitol-MacConkey Culture Medium，CT-SMAC)、MUG 培养基和5．溴．4．3吲哚．D．葡萄糖酸苷培养基(SMAC．BCIG)[sU等一系列选择性培养基。 但对于E coli 0l 57：H7的敏感性、特异性不是十分理想。单一PCR虽然能特异性检测E． coli 0157：H7，但仅能鉴别细菌的0157抗原或H7抗原，不能同时鉴别细菌是否携带其 他一些毒力基因，同时对于出现毒力基因缺失的情况，则会使E coli 0157：H7漏检152】。 本试验使用的多重PCR检测方法使多个目的基因同时被检测，检测结果特异性强，并 且能达到快速检测的目的。 选择特异的靶基因是多重PCR检测E coli 0157：H7环节中重要的一部分。1996年 Bilge等在编码0157抗原的基因簇研究中发现其中的rybe基因是E coli 0157血清型所特 异的基因，也是E．coli 0157的抗原基因【53】。E coli 0157的eaeA基因主要作用是编码紧 密素，是一种细菌紧密附着所必需的一种外膜蛋白，许多文献研究认为紧密素可能是一 种重要的黏附素，最新的研究机制表明eaeA紧密素不但能在Tir蛋白定殖，又有结合在 宿主细胞上的功能【541。有关研究表明E coli 0157一旦黏附到肠黏膜，就会定植在小肠黏 膜大量增殖，并分泌许多细胞外的产物，其中最主要的SL隋2种抗原性质不同的毒力因 20 万方数据 新疆农业大学硕±学位论文 子组成RPstxl和stx2[551。本试验以E coli 0157：H71构fliC基因、rfl,e基因、eaeA基因、stxl 基因和stx2基因五个基因片段为扩增对象，对E coli 0157：H7进行检测。 多重PCR的优化主要是优化引物浓度的合适配比、MgCl2浓度、退火温度、延伸时 间等。在体系的优化方面，通过对25和50皿的两个体系扩增结果对比，选用扩增条带 更清楚的25此体系；退火温度的选择是引物与模板DNA单链配对的关键影响因素，选 择比引物熔解温度低5℃进行梯度PCR摸索最佳温度；对于酶和M92+浓度配比个人认为 是比较难掌握的，建议使用Mix方便可行。 21 万方数据 新疆不同地区牛粪源大肠秆菌ols7：H7分离鉴定及毒性研究 第4章小鼠感染大肠杆菌0157：H7的临床症状及其 血液生化指标变化 病原菌的致病因子一直以来都是各国学者研究的核心问题，基因水平的研究也成为 了近些年关注的热点，相关毒力因子的基因(特征的DNA序列)也作为重要的分子生物 学检测目标。E coli 0157：H7的观隋2种不同的抗原形式，IiPstxl和stx2。对几次流行和 临床分离株统计后发现，单独产生stx2菌株的比例较大【56】，stx2毒素是由一个A亚单位(32 kD)、一个五聚体B亚单位(7．7 kD单聚体)组成的结构单位。其中B亚单位是受体结合 蛋白，主要介导与靶细胞膜的结合使毒素分子内化；而A亚单位酶解后可生成具有催化 活性的A1亚单位(27 kD)，A1亚单位具有的RNAN2活性糖苷酶在特异性裂解真核细胞 28 S r RNA后抑制细胞蛋白质合成过程，主要是肽链延伸这一过程，最终致使细胞死亡。 相对于其他机制，研究的关注度已移至距硪引起肠粘膜损伤的机制，大多数情况下E coli 0157：H7只产生stx2时毒力较强，而只产生stxl或产生stxl和stx2混合型毒素所引起的 疾病则较轻微【571。 机体炎症的发生是机体一种本能的防御反应，适当程度的炎症反应则对杀灭病原体 是有利的。炎症发生时组织受一系列防御机制保护，其中大部分免疫体系是由粒细胞和 可溶性免疫复合物．炎性递质和细胞因子构成引起非特异性免疫反应【58】，对机体实施保 护。当机体在对于外界抗原侵入开启自我防御系统时，白细胞的定向迁移则是先天性免 疫中必不可少的步骤。当细菌或病毒侵入机体后，可在身体某个部位造成局部炎症，这 时粒细胞收到机体炎症信号后开始向炎症部位进军，亲临战斗第一线。首先将细菌吸附 粘在细胞膜上，其次细胞膜在细菌附着处向内凹入，将细菌卷入粒细胞内，最后细菌被 粒细胞所包裹。这一过程医学上称为吞噬作用。在完成吞噬过程后，粒细胞通过自身一 系列处理后杀灭所吞噬的细菌病原体。本试验通过小鼠感染E coli 0157：H7 stx2后的临 床表现及各项血液生化指标之间的差异，初步分析E coli 0157：H7 stx2毒性及致病机制。 4．1材制汲方法 4．1．1标准菌株及来源 标准E coli 0157：H7菌株(菌号：CICC 21530；中国工业微生物菌株保藏中心提供)； 万方数据 颞疆农业大学硕士学位论文 詈皇詈暑詈i i, , =,I m m．mu[ i- im I詈昌 E coli 0157：H7．1，E coli 0157：H7．6，E coli 0157：H7．7三株菌株经本实验室对E coli 0157：H7毒力因子鉴定后确定其携带stx2基因；E coli 0157：H7．3菌株经本实验室对E coli 0157：H7毒力因子鉴定后确定其未携带six2基因。 4．1．2主要仪器及试剂 全自动血细胞分析仪(深圳市普康电子有限公司)；空气浴振荡培养箱(型号 MODEL：ST．F160AC)：SW-CJ-2F双人双面垂直洁净工作台(上海博讯实业有限公司 医疗设备厂)；MOTIC显微镜；手术器械(高压灭菌后使用)；一次性注射器：载玻片； 1．5 mL离心管；生理盐水；瑞氏染液：抗凝剂(肝素钠，厂家：Wako，批号：072．04881) 4．1．3试验动物 昆明白雌小鼠21-23 g，购于新疆医科大学试验动物中心，SCXK(新)2014．0001 4．1．4方法 4．1．4．1菌液的制备 挑取4℃斜面保存的E coli 0157：H7菌株在SMAC培养基上划线培养，待长出圆 形、光滑、较小的无色菌落时，再挑取单个菌落于LB液体培养基中37℃、180 r／min 震荡过夜培养。待细菌OD600nrn值达到0．6时，37℃存放备用。 4．1．4．2动物攻毒试验 取40只23-25 g小鼠(早)空腹12 h后。平均分为4组，每组lO只，分别为空白 对照组；菌①组(注射携带stx2 E coli 0157：H7菌液)；菌②组(注射未携带six2 E coli 0157：H7菌液)；菌③组；(注射携带标准E coli 0157：H7菌液)。菌液剂量为0．5 mL／ 只，空白对照组小鼠以0．5 mL腹腔注射生理盐水。各组别小鼠腹腔注射菌液或生理盐 水后4小时进行尾静脉采血0．5 mL于事先加好抗凝剂的离心管内，血液4℃存放待检。 同时观察小鼠临床症状及死亡情况并做好详细，对死亡小鼠剖检观察其内脏病理变 化。 4．1．4．3制作血涂片及镜检 配置磷酸缓冲液：磷酸氢二钠配法：磷酸氢二钠9．465 g，蒸馏水1000 mL磷酸二 万方数据 颟疆不商地区午粪源大酾轷萄ols7：H7分离鉴定及霉性研究 氢钾配法：磷酸二氢钾9．07 g，蒸馏水1000 mL将两种溶液按3：2比例混合，配成pH 为6．98的缓冲液待用【59】。 血涂片制作步骤：(1)取一干净载玻片，用载玻片尖角蘸取一滴血滴在另一干净载 玻片右端。(2)用边缘光滑平齐的载玻片作为推片，推片与载玻片约成45。，使推片与 血滴接触直至血滴在载玻片边缘散开成一条线，这时迅速将推片推向左方，血膜呈现“火 箭尾”状即可，自然风干。(3)涂片在空气中干燥后置于染色架上，滴加瑞氏染色液， 尽量滴加量使涂片被染色液全部覆盖，浸染约3 rain左右。(4)加入等量的磷酸盐缓冲 液于染色液上，浸染约10 rain，此时涂片表面呈现一层古铜色。(5)用大量蒸馏水迅速 冲洗，涂片呈现粉红色后，自然晾干后可放于显微镜下观察。 4．1．4．4血常规检测 对4℃保存加入抗凝剂的血液进行血常规指标的检测，分析血液生化指标的变化。 4．2结果 动物试验结果(表4．1)，菌①组小鼠死亡率高于菌②组、菌⑨组小鼠死亡率。 表4．1动物试验结果 注：菌①组(注射携带stx2 E coli0157：H7菌液)；菌②组(注射未携带stx2 E coli 0157：H7茵液)；菌③组；(注 射标准E coli 0157：H7菌液)。 菌①组小鼠注射菌液后10 rain内立刻表现出精神沉郁、腹痛、反应迟钝等明显症 状；菌②组、菌③组小鼠均在30 rain后表现出相同症状，并同时伴有轻度的腹泻症状， 尿液呈明显的黄色，有少数在攻毒后有稀便。菌①组、菌②组、菌⑨组小鼠剖检结果如 图4．2：腹腔脏器有出血现象，肠黏膜出血严重，并伴有明显肠鼓气(图4．3)。 24 万方数据 叛疆农、监大学硕士学位论文 I黪 曛 图4．1正常小鼠剖检图 图4．2菌株组小鼠剖检图 图4．3肠鼓气 4．2．2血涂片镜检结果 血涂片放于40x显微镜下观察后，在空白对照组的血液涂片中可观察到桔红色的红 细胞和被染成蓝紫至紫红色的白细胞，在空白对照组小鼠的血涂片一个固定视野中大约 可找到3-4个白细胞；菌①组、菌②组、菌③组小鼠的血涂片镜下观察，白细胞个数极 为少见，转换1．2个不同视野，可见1．2个白细胞。 4．2．3血常规结果 血液生化指标检测结果如表4．1，菌①组、菌②组、菌③组小鼠体内白细胞数、粒 细胞数均呈骤降趋势，与空白对照组小鼠相比差异极显著(P<0．01)；菌①组、菌②组、 菌③组小鼠红细胞数相比空白对照组小鼠无明显变化；菌②组小鼠淋巴细胞数相比空白 对照组小鼠差异显著(尸