生物化学经典实验DNA琼脂糖凝胶电泳的原理、步骤、试剂配制、结果分析分析PPT课件

DNA琼脂糖凝胶电泳*实验原理琼脂糖为链状多糖→绳状琼脂糖束→大网孔型凝胶——分离、鉴定、纯化DNA在pH值为8.0～8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。*实验原理当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。*影响DNA迁移率的因素影响DNA迁移率的因素：DNA分子的大小、构象，凝胶浓度，电压，电泳缓冲液的组成等缓冲液pH>DNApI，DNA带负电荷，迁移率与分子量对数成反比DNA分子构象影响迁移率：共价闭环DNA>线状DNA>开环DNADNA片段越长，泳动速度越慢在低电压时，泳动速度与电场强度成正比*不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围琼脂糖浓度（W/V,%）分离范围（kb）0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-3DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。*嵌入染料的存在　　荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。离子强度影响　　电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在无离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动;在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。*琼脂糖凝胶中DNA的观察溴化乙锭（EB）—DNA：紫外光下桔红色荧光*主要实验器材电泳仪电泳槽缓冲液琼脂糖凝胶槽梳子取液器溴酚蓝*电泳槽结构*缓冲溶液配制表*电泳指示剂核酸电泳常用的指示剂有两种:溴酚蓝(bromophenolblue,Bb)呈蓝紫色；二甲苯腈(xylenecyanol,Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。胶浓（%）溴酚蓝二甲苯腈0.61kb10.6kb2kb1.40.2kb1.6kb20.15kb*操作步骤琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB凝胶板的制备：加梳子，倒胶样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝加样：加样端为负极（黑）电泳：5V/cm观察：紫外灯下观察，照相*溶胶*准备胶槽*凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml*铺胶*凝胶凝固后取出梳子*加电泳缓冲液*准备样品*点样*电泳*注意观察溴酚蓝染液的迁移*紫外灯下观察电泳结果*照相**