紫苏子药材质量标准研究

紫苏子药材质量标准研究 谷丽华 1, 2, 林晨 3, 吴弢 1, 2, 侴桂新 1, 2, 王峥涛1, 2* ( 1�上海中医药大学 中药研究所 中药标准化教育部重点实验室, 中药新资源与质量标准 综合评价国家中医药管理局重点研究室, 上海 201210; 2�上海中药标准化研究中心, 上海 201210; 3�湖北中医学院 药学院, 湖北 武汉 430065) [摘要 ] � 目的: 制定紫苏子药材质量标准。方法: 采用生药学研究, 水分测定法, 薄层色谱法及 H PLC色谱法。结果: 对 紫苏子的显微特征进行了描述;对 15个不同产地的紫苏子活性成分迷迭香酸、木犀草素和芹菜素进行了薄层定性鉴别, 并对 迷迭香酸进行了 H PLC定量研究。结论 :通过研究制定了紫苏子的质量控制标准。 [关键词 ] � 紫苏子; 质量标准;迷迭香酸; 木犀草素;芹菜素; TLC; HPLC [稿件编号 ] � 20090618002 [基金项目 ] � 国家药典委员会项目 ( YD�192 );上海市教委科研基金 项目 ( 07CZ037) ;上海市重点学科建设项目 (Y0301 ); 上海市科委中 药现代化专项基金 ( 08DZ1970103) [通信作者 ] � * 王峥涛, E�m ai:l w angzht@ hotm ai.l com [作者简介 ] � 谷丽华, 助理研究员,主要从事中药活性成分与质量 标准研究, E�m ai:l gu lihua2008@ hotm ai.l com � � 紫苏子为唇形科植物紫苏 P erilla fru tescens ( L�) B ritt�的干燥成熟果实。具有降气消痰, 平 喘,润肠的功效。用于痰壅气逆,咳嗽气喘, 肠燥便 秘 [ 1]。现有文献多限于对紫苏子脂肪酸类成分如 ��亚麻酸或三萜类成分如熊果酸和齐墩果酸的含量 测定 [ 2�4]。而现代药理研究表明紫苏子中的酚酸类 成分可能是其祛痰、平喘等药理作用的主要物质基 础 [ 5�7]。迷迭香酸为紫苏子中含量较高的一类酚酸 类成分。紫苏子为 �中国药典 2005年版一部收载 品种,但对紫苏子药材并未作定性和定量测定要求。 为了更好地控制紫苏子药材的质量, 本试验对 15个 不同产地紫苏子样品的药材进行了显微鉴别和水分 测定研究, 采用 TLC及 HPLC进行了定性、定量研 究, 为制定紫苏子的质控标准、开发新药奠定了 基础。 1� 仪器与试药 薄层色谱自动点样器 ( Automat ic TLC Sampler 4, 瑞士 CAMAG公司 ) ; HP1100高效液相色谱仪 (美 国 Ag ilent公司 ) ; BX41型显微镜 (日本 O lympus公 司 ) ; AE200电子天平 (瑞士 M ett ler公司 ) ; KQ� 250DB数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公 司 ); DK�S26型恒温水浴锅 (上海精宏实验设备有 限公司 ); 硅胶预制板 ( DC�Fertigp la tten SIL G�25 UV254板 20 cm ! 20 cm, 德国 MN, 批号 501027 ); HPLC级甲醇 (美国 F isher公司 ) ; HPLC级甲酸 (美 国 F isher公司 ) ;水为超纯水;其他试剂均为分析纯; 对照品芹菜素、木犀草素和迷迭香酸由上海中药标 准化研究中心提供,纯度 > 98%;紫苏子药材 15批, 经上海中药标准化研究中心吴立宏副研究员收集并 鉴定为紫苏 P� f rutescens干燥成熟果实,凭证标本保 存在上海中药标准化研究中心。 2� 方法与结果 2�1� 显微特征 � 粉末灰棕色, 油性黏腻。种皮表皮 细胞断面观细胞极扁平,具钩状增厚壁;表面观呈类 椭圆形。外果皮细胞黄棕色,皱缩。断面观细胞扁 平, 外壁呈乳突状; 表面观呈类圆形,壁稍弯曲。内 果皮组织断面观主为异形石细胞, 呈不形;顶面 观呈类多角形,界限不分明, 胞腔星状。内胚乳细胞 大小不一,含脂肪油滴; 有的含细小草酸钙方晶。子 叶细胞呈类长方形,充满脂肪油滴,见图 1。 2�2� 薄层色谱鉴别 2�2�1� 对照品溶液的制备 � 取芹菜素、木犀草素和 迷迭香酸,用甲醇溶解, 制成每 1mL各含 0�2mg对 照品的混合溶液。 2�2�2� 供试品溶液的制备 � 取紫苏子粉末 1 g, 加 甲醇 25mL, 超声 30 m in,滤过,滤液蒸干, 残渣加甲 醇 1mL溶解, 作为供试品溶液。 2�2�3� 薄层色谱条件及结果 � 吸取上述两种溶液 各 2 �L, 分别点于同一硅胶 G薄层板上,置干燥器 ∀2087∀ 第 35卷第 16期 2010年 8月 � � � � � � � � � � � � � � � � � � � V ol�35, Issue� 16 August, 2010 � � 1�种皮表皮细胞; 2�外果皮细胞; 3�内果皮组织; 4�子叶细胞; 5�内胚乳细胞。 图 1� 紫苏子显微图 (比例尺每格 10�m ) 干燥 2 h,以正己烷 �甲苯�乙酸乙酯�甲酸 ( 2#5#2�5# 0�5)为展开剂,展开,取出, 晾干,喷以 1%三氯化铝 乙醇溶液,置紫外光灯 ( 365 nm )下检视。供试品色 谱中,在与对照品色谱相应的位置上,分别显相同颜 色的斑点,见图 2。 S�对照品 (自上而下:芹菜素、木犀草素和迷迭香酸 ); 1 ~ 15�样品 [ 1�浙江; 2�安徽; 3�安徽; 4�河北; 5�四川; 6�贵州; 7�河北; 8� 福建; 9�重庆; 10�成都; 11�江苏; 12�黑龙江; 13�江苏; 14�云南 (白 ) ; 15�云南 ]。 图 2� 15批紫苏子样品薄层色谱图 2�3� 含量测定 2�3�1� 色谱条件 � Ag ilent ZORBAX SB�C18色谱柱 ( 4�6mm ! 250 mm, 5 �m, 美国 Ag ilent公司 ) , 流动 相甲醇 �0�1%甲酸 ( 40#60), 检测波长 330 nm, 流速 1�0 mL∀ m in- 1,柱温 30 ∃ ,见图 3。 1�迷迭香酸。 图 3� 对照品 ( A )和紫苏子样品 ( B)H PLC图 2�3�2� 提取溶剂的选择 � 为了尽可能将药材中的 目标成分提取完全, 取紫苏子样品 ( ZSZ�080829)粉 末 0�5 g,分别考察甲醇、80%甲醇、60%甲醇、40% 甲醇、乙醇、80%乙醇、60% 乙醇、40%乙醇、丙酮、 80%丙酮、60%丙酮、40%丙酮 12种溶剂, 结果由迷 迭香酸含量数据分析, 80%甲醇、80%丙酮、60%丙 酮提取效率较高并相当。考虑丙酮更容易挥发, 实 验操作较难控制, 所以选择 80% 甲醇作为提取溶 剂,见表 1。 表 1� 不同提取溶剂提取浸膏中迷迭香酸质量分数 ( n = 3) % 提取溶剂 迷迭香酸 甲醇 0. 064 80%甲醇 0. 241 60%甲醇 0. 212 40%甲醇 0. 107 乙醇 0. 000 80%乙醇 0. 199 60%乙醇 0. 208 40%乙醇 0. 118 丙酮 0. 000 80%丙酮 0. 251 60%丙酮 0. 249 40%丙酮 0. 189 分别以温浸、超声和回流 3种不同提取方法进 行了比较实验, 迷迭香酸的质量分数分别为 0�225% , 0�226 0%和 0�251% ( n = 3) , 表明回流 提取方法提取效率最高。在此基础上,对溶剂倍量 进行考察, 分别选择 30, 50, 100倍溶剂, 即 15, 25, 50 mL, 计算迷迭香酸的含量分别为 0�234%, 0�245% , 0�251% ( n= 3) , 表明以 100倍量,即 50 ∀2088∀ 第 35卷第 16期 2010年 8月 � � � � � � � � � � � � � � � � � � � V ol�35, Issue� 16 August, 2010 mL提取效率最高。 在确定提取溶剂、提取方法和溶剂倍量的基础 上对提取时间进行考察,选择 1, 2, 3 h 3个水平,迷 迭香酸的含量分别是 0�230%, 0�248% , 0�251% ( n = 3) ,表明 2 h和 3 h提取效率较高, t检验无显 著性差异,因此选择回流提取 2 h。 2�3�3� 检测限 � 按信噪比 ( S /N )为 3时计算, 迷迭 香酸的检测限为 4�86 ng。 2�3�4� 定量限 � 按信噪比 ( S /N )为 10时计算,通 过重复测量 5次求得平均值 ( RSD 2�7% ), 迷迭香 酸的定量限为 9�71 ng。 2�3�5� 标准曲线的制备 � 取迷迭香酸对照品适量, 精密称定,加甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 制成含 迷迭香酸 0�194 g∀ L- 1的贮备溶液。储备溶液依次 稀释为 155�4, 116�5, 77�7, 48�6, 38�8, 24�3, 19�4 g ∀ L- 1,进 HPLC分析, 进样量 10 �L, 在上述色谱条 件下检测峰面积,以进样量为横坐标 (X ),以峰面积 为纵 坐标 ( Y ) 进行 线性 回归, 回 归方 程为 Y= 24 589X - 236�08, R 2 = 0�999 9, 迷迭香酸在 19�4~ 194�2 g∀ L- 1线性关系良好。 2�3�6� 供试品溶液的制备 � 取本品粉末 (过 2号 筛 )约 0�5 g,精密称定,置 100mL圆底烧瓶中,精密 加入 80%甲醇 50 mL, 称定质量, 80 ∃ 回流提取 2 h,放冷,再称定质量, 用 80%甲醇补足失重, 摇匀, 过滤,初滤液 1mL弃去,再取续滤液,即得。 2�3�7� 对照品溶液的制备 � 精密称取迷迭香酸对 照品,加甲醇制成每 1mL含迷迭香酸 80 g的溶液, 摇匀,即得。 2�3�8� 精密度试验 � 取同一紫苏子样品 ( ZSZ� 080829)提取溶液, 在上述色谱条件下连续进样 5 次,测得迷迭香酸色谱峰的峰面积,计算相对标准偏 差, RSD 0�46% ,表明其日内精密度良好。连续 3 d 测试,计算日间精密度结果, RSD 0�65%,表明其日 间精密度良好。 2�3�9� 重复性试验 � 取同一紫苏子样品 ( ZSZ� 080829)粉末 6份,精密称定, 按 %供试品溶液制备 & 项下操作,在上述色谱条件下进样测定,计算迷迭香 酸含量及其相对标准偏差, RSD 1�1%。 2�3�10� 稳定性试验 � 取紫苏子 ( ZSZ�080829)粉末 0�5 g,精密称定,按 %供试品溶液制备&方法制备,进 行 HPLC测定, 结果表明, 样品在 72 h内稳定, RSD 2�1%。 2�3�11� 回收率试验 � 取已知含量的紫苏子 ( ZSZ� 080829)粉末各 9份, 精密称定, 分别按已知含量的 50% , 100% , 150% 3个水平加入迷迭香酸对照品, 按 %供试品溶液的制备&项下操作,在上述色谱条件 下进样测定,见表 2。 表 2� 迷迭香酸加样回收率 称样量 / g 样品中量 /m g 加入量 /m g 测得量 /m g 回收率 /% RSD /% 0. 251 6 0. 662 1 0. 341 6 0. 990 9 96. 3 0. 252 0 0. 663 4 0. 341 6 0. 993 4 96. 6 0. 250 9 0. 658 2 0. 341 6 0. 982 7 95. 1 0. 252 8 0. 665 6 0. 683 2 1. 335 9 98. 1 0. 253 7 0. 668 5 0. 683 2 1. 380 4 104. 2 3. 6 0. 254 2 0. 669 9 0. 683 2 1. 386 3 104. 9 0. 253 3 0. 667 3 1. 024 8 1. 723 9 103. 1 0. 253 6 0. 666 2 1. 024 8 1. 683 2 99. 3 0. 252 3 0. 664 3 1. 024 8 1. 670 2 100. 6 2�3�12� 含量测定 � 称取不同来源的 15份紫苏子 样品粉末约 0�5 g, 精密称定, 按 %供试品溶液的制 备&项下操作,制成供试品溶液。分别精密吸取对 照品溶液 10 �L与供试品溶液各 20 �L, 注入高效 液相色谱仪,测定, 见表 3。 表 3� 不同产地紫苏子药材迷迭香酸质量分数 ( n = 2) � % No� 产地 批号 水分 迷迭香酸 1 安徽 zsz�080522 7. 69 0. 298 2 浙江 zsz�080514 7. 23 0. 290 3 福建 zsz�070930 6. 89 0. 227 4 四川 zsz�080331 7. 44 0. 296 5 重庆 zsz�080829 6. 92 0. 270 6 河北 zsz�070901 6. 30 0. 280 7 黑龙江 zsz�080902 6. 54 0. 287 8 江苏 zsz�081020 5. 73 0. 284 9 贵州 zsz�080813 6. 78 0. 462 10 江苏 zsz�080328 7. 27 0. 267 11 四川 zsz�081107 7. 03 0. 250 12 河北 zsz�081017 5. 84 0. 362 13 安徽 zsz�080515 6. 20 0. 288 14 云南 zsz�070901 6. 32 0. 251 15 云南 zsz( b sz)�070901 6. 97 0. 283 3� 讨论 薄层色谱结果表明, 15批不同产地的紫苏子样 品中,其中 14批均可检出木犀草素、芹菜素和迷迭 香酸 3种成分, 斑点清晰且方法简便、快速、可行, 故 ∀2089∀ 第 35卷第 16期 2010年 8月 � � � � � � � � � � � � � � � � � � � V ol�35, Issue� 16 August, 2010 此方法可用作紫苏子药材的定性鉴别。 含量测定研究中, 对色谱条件的耐用性进行了 考察。首先考察了不同色谱柱如 Age la V enusil�MP C18 ( 4�6 mm !250mm, 5 �m); Shise ido Capcell Pak C18 ( 4�6 mm !250mm, 5 �m )和 Ag ilent Zorbax SB� C18 ( 4�6 mm ! 250 mm, 5 �m)的分离情况, 按含量 测定色谱条件进样分析, 测得迷迭香酸含量以及相 对标准偏差, 并计算分离度。结果 RSD< 3�0% ,分 离效果理想,表明 3类色谱柱均适合分离。同时考 察了不同流速 ( 0�9, 1�0, 1�1 mL∀ m in- 1 )和不同柱 温 ( 25, 30, 35 ∃ ), 测得迷迭香酸含量以及相对标准 偏差,结果 RSD< 3% ,分离效果理想。因此,紫苏子 中的迷迭香酸含量测定色谱条件较宽, 具有较好的 耐受性。通过紫外进行全波长扫描, 迷迭香酸的最 大吸收波长为 330 nm 附近, 故设检测波长为 330 nm。在上述条件下, 能够在 20m in之内测定紫苏子 中迷迭香酸的含量。此方法简便、快速、可靠, 适用 于紫苏子药材的质量控制。 [参考文献 ] [ 1] � 中国药典 �一部 [ S] � 2005. 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Shanghai R esearch and D evelopm ent Center for Standardization of Ch inese M ed icines, Shanghai 201210, China; 3�H ubei University of ChineseM edicine, Wuhan 430065, China ) [ Abstract] � To im prove the qua lity contro l specification o f Per illae F ructus, the identification m ethods and assay were deve l� oped. Rosm ar in ic ac id, luteo lin and apig en in in the samp le w ere identified byTLC� The content o f ro sm ar in ic ac id w as determ ined by HPLC. The linear ca libration curve o f rosm ar inic ac id w as obta ined in the ranges o f 19�4�194�2 g∀ L- 1 (R 2= 0� 999 9) . The arerage cover iy ( n= 9) fo r the assay w as 99� 8% ( RSD 3�6% ). The established m ethods are accuracy, sensitiv ity and reproduc ib le, and can be used fo r the qua lity contro l o f P erillae F ructus� [ Key words] � Pe rillae F ructus; qua lity spec ification; ro sm ar in ic ac id; lu teo lin; apigen in; TLC; H PLC do:i 10�4268 / cjcmm20101610 [责任编辑 � 王亚君 ] ∀2090∀ 第 35卷第 16期 2010年 8月 � � � � � � � � � � � � � � � � � � � V ol�35, Issue� 16 August, 2010