片段分析的常见故障排除

片段分析的常见故障排除FieldApplicationScientistTel:8008208982/4008208982E-mail:cntechsupport@lifetech.comTheworldleaderinservingscience1高质量的片段分析数据•峰形正常，合适峰高(峰高+峰形)•正确确定峰的大小(SizingQuality+SizeCurve)•基因分型结果准确(AlleleCalling)•结果重现性好2信号强度•信号强度是峰检测的一个重要标准•常见问•信号太低或没有信号•信号太高•信号不均匀或逐渐下降•症状•某个峰未被检测到•某个峰未被正确检测(被检测为多个峰)3信号过低•症状•低峰高•通过分析软件不能检测到峰•原因•信号弱或没有扩增•质量、浓度、PCR抑制•PCR仪故障•PCR试剂问题•电泳前PCR产物过度稀释•PCR产物浓度低或没有进样•孔里没有样品•孔里有气泡•自动取样器校准•激光问题•电泳4PCR抑制•样品•提取•血色素•氯仿•肝磷脂•苯酚•多酚(植物样品)•EDTA•多聚糖•清洁剂(SDS)•二甲苯•酒精•溴苯酚蓝设置一个阳性PCR对照!5信号过低PeakHeights~40-180rfus6样品和内标信号不平衡Sample:SizeStandard=3:17信号过高•症状•Pullup峰•Pull-down峰•Wideorflat-topped峰•原因•样品进样过多(样品没有充分稀释)•反应中模板过量*其他影响进样的因素8信号过高9信号不均一•症状•Marker或染料颜色之间信号强度不均一•原因•反应与样品制备问题•模板过量•进样太多•不同目标物扩增效率差异大•仪器运行RunModule设置(进样设置)•优先进样•毛细管电泳系统将优先进较短的产物,导致进样太多10信号不均一11信号逐步下降原因:模板过多解决办法:减少样品量并增加进样时间Checkrawdata!12峰形和样品迁移•当DNA片段在毛细管电泳系统上进行分离的时候,对于某种特定应用峰形应该是一致的。•样品迁移率将影响:•峰形和相邻峰的检测•预期片段大小系统分辨率•精度问题(runtorun,sampletosample)•等位基因分型(Mobilityshiftsandbins)13偏移问题/分辨率下降•症状•片段迁移比正常慢•峰形的变化(最常见的是峰变宽)•峰检测问题(检测不到或多峰)•分析结果与预期大小不一致•Runtorun,sampletosample之间的变异•原因•样品质量差•胶放置时间过长或冰冻•缓冲液放置时间过长•稀释缓冲液的水有污染•甲酰胺质量差•环境温度•毛细管使用次数过多•污染物14早期分辨率下降15泳动偏移(MobilityShift)16片段大小计算失败•内标的问题•比设定峰少•由于数据收集时间缩短•峰检测延迟•片段判读异常•内标降解•使用错误的内标参数•漏加内标•高背景噪音被误判为有效峰17SizeMatchEditor•检查已知峰•检查检测到的峰数,并与GeneMapper®管理器里内标大小设定进行对比。•在SizeMatchEditor里改变,增加或删除内标大小分型18基线问题•症状•峰高缺失(部分或全部)•原始图谱中的峰在分析窗口没有显示(峰丢失)•原始图中基线波动•原始图信号连续升高•原因•污染物•不正确的灌胶/漏的注射器•光谱校准•放电/电信号噪音•软件分析设置•使用过期试剂19基线问题20基线问题-瀑布峰21基线抬高22拔起(pull-up)峰•症状•在分析数据窗口,不同峰或者单一峰下面出现不同颜色的峰•原因•进样过多•光谱校准不合格•染料组合参数设置错误•此外,上样过多能产生负(pull-down)峰23其他常见数据问题•DataSpikes(钉子峰)•气泡•灰尘•过期的胶•所有样品信号突然下降•检查激光功率和电流•放电后CCD相机损坏24Spikes(钉子峰)25信号突然丢失—下胶块里有气泡26预防数据问题•正确的仪器操作和维护•按照建议更换胶和缓冲液•不要长期的重复使用septa•注意气泡•确认预期的运行条件(EPcurrent,Temperature)•样品制备•正确的分析设置27故障排除•利用软件去发现问题•Rawdata,Info,EPT(electrical,power,temperature)•PQVs•通过化学原理排查硬件问题•运行标准品(sizestandardsandinstallstandards)•为了更好地排除故障,注意下面几个问题:•同一Run所有样品是否都有同样的问题?•是否观察到典型的故障特征?•上次正常的Run是什么时候?•自从上次正常的Run更换过什么?•标准品对照有同样的问题吗?•重新进样得到同样的结果?28数据不好可能的原因样品反应样品板和仪器运行模板制备数据分析和(AssayWorkflows仪器运行和数据收(模板)解释+KitProtocols)设置集•样品•DNA提取:影响DNA质量和含有PCR抑制剂•PCR试剂:enzyme,buffer,Mg2+,dNTPs,primers的质量和用量•操作:pooling,resuspension,andcleanup(forsomeapplication)*阳性对照可以分析或排除试剂问题•仪器•试剂:有效期内正确使用和储存缓冲液和胶•耗材:胶泵、胶块、毛细管、注射器等•硬件:激光、CCD相机、加热炉等*使用对照(标准品或分子内标)可以分析或排除仪器问题29数据不好可能的原因•软件•使用错误的matrix、错误的内标以及应用分析软件(例如GeneMapper)设置错误•在数据收集软件中使用错误的运行模式和光谱组合等•实验室环境•温度变化超过2度影响样品迁移•实验室清洁度,灰尘可以在数据中产生钉子峰•试剂操作不当导致样品或仪器被污染•实验室设备•实验室常用设备校准,例如：移液器、PCR仪和纯水仪30Questions?31