苯乙烯生物催化氧化制环氧苯乙烷的研究

苯乙烯生物催化氧化制环氧苯乙烷的研究 ,甲烷单加氧酶在细胞中负责将甲婉转变成甲醇(图1,. 此外,甲烷单加氧酶能催化氧化相当多的化合物,其中许多反应都是化学上不易实理盼. Cs烷烃的羟化,C—C.烯烃的环氧化等等(1).该酶作为催化 例如,C— 荆突出前佑l点莲蠢 于它在催化氧化时表现出的高立体选择性,其酶促过程往往可以获得有光学活性_扮产晶.盛 应用角度考虑,甲烷单加氧酶可以通过微生物大规模发酵后固定化整细胞来实现其詹熊置童 的工业过程,无疑是很经济的. Ce11COnStituents f c”—cH.oH E. .,HcHo——兰十HcooH—_E’?c0I+Ht0 ,一,,.,厂,厂, CH’+0t+NADH+H++CHlOH+NAD++H2O 匝1甲烷在甲烷氧化菌中的促谢?甲烷单加氧酵负孟f第一步的氧化 FE.1Methaneoxidatirepathway—me?h4ne 丑,0nooxygenasecatalyzesthe firstoxidatio~stepinwhichOzisaetlvatedandOteoxypam isiasertedintoaC嘲l率_翠雌哥壁,现在m寄嚣口甫化工蕾司工作. O @/p竺,@常@_cH一cH. 图2.苯乙燥氧化懈取日一苯乙醉的斑程示意图 Fig.2Aschematicprocessforproductionofphenethy[alcoholfromstrene r,,.一一. ,一 , ,, 2.i料与 2.1试剩 苯乙烯,市售化学纯,上海试荆一厂产品.环氧苯乙烷,兰州大学化学系提供,经GC — Ms分析证明纯度太子99%无水苯,化学纯,经金属钠处理至加入二苯甲酮呈稳定蓝色 蒸出后使用. 2.2标样的配邾 取0.2ml环氧苯乙烷溶于4.8ml无水苯中,制成4(V/V)的溶液备用. 8菌种培养与细髓采寨 . 采用从甘肃玉1油田土样中筛选到的甲烷氧l化细菌ethvtomOnassp;GYJ3[]菌 株,以甲烷气lCHtA,r:1:1,v/v)作为唯一碳源和能源,在无机无碳培养基中静止 培养茸夫’H7.0,??,然后将所得培养物以2O%的体积比接种到1O个2Oml装有上述 培养基的密闭锥形瓶中.将各瓶中的空气用甲烷气置换,成为空气,甲烷各占5O前培养气 氛.pH调至7.0,在32?条件下于恒温摇床上以220rpm培养82h.在此生长过程中pH 不再控制 将上述培养好的菌液离心收集(1O,000×g,20min,4?),以0.05MPH7.0的磷酸 缓冲液(含5mMMg”)洗涤两次,再加入约5ml同样缓冲液制成细胞浓度为2mg/ml 的悬浮液,置4?冰箱中于24h之内使用. 2.4僵化环氯化反应一’. 取1ml细胞悬浮液殛:定量苯乙烯予rm1小瓶中,离口.在40?恒温水溶液中旋转反 应.然后在4?下冷却10min,并于4,000g下离心15min.取上清液做产物分析. 2.5产物分析 (a)环氧化产物及含量用SQ一204气相色谱仪(北京分析仪器厂)分析.色谱柱为内径 4nlin的不锈钢管,柱长2m,固定液为2O%PEG,担体为2000016201.柱温170?.氢 火焰离子化检测器,检测室22O?.载气(N:)流速为30ml/min.进样量0.51. (b,比旋测定:环氧化产物在/ASCO--J20C’日本和光株式会社)自动记录旋光仪 中作比旋制定.池长度0.5cm,灵敏度为5/z000(度lcm),温度23?. 5.结果与讨论 3.1环氯苯乙蟪的胞外累积 实验表明,甲基单胞菌(MethylomonasspG$j3,催化氧化苯乙烯曲反应珂墉在常温 3 ? ? ? ? ? ? ? ? 下进行,以空气中的分子氧为氧源直接得到环氧幕乙烷且产物在鲴匏外累积最适发应强 度和pH分别为4O?和7.0.图3给出了产物随反应时间变化的曲线.当反应进行约0.5hS~, 环氧苯五烷的累积量达到最大值(峰).随之开始下降,约在1.5h融降到最低点峰B), 最后趋于酶活力几乎全部丧失的状态(峰C).这可能一方面由于细胞内徽环境的变f嗡致酶 活力的下降和丧失,表明甲烷单加氧酶或其辅酶对有机底物的敏感}另一方面由于环氧苯己 烷发生了部分水解,产生了苯乙二醇所致.环氧苯乙烷中的三元环变易性较大,易发生开环 反应.在弱酸,弱碱条件下是很容易水解生成反式苯乙二醇的.在甲烷单加氧酶的酶促反应 过程中,因有辅酶I参与反应,体系呈弱酸性,故有水解反应的合适条件.图3的A,B与 C之同实际上反映了环氧苯乙烷的生成,水解以及产物掷制作用之间趋于平衡的动态过程. 图4给出了酶活力与反应时间的依赖关系.在反应的初始过程,钿胞吸扳和在细胞表面 聚集的有机底物尚不足以对酶蛋白分子的空间结构产生特别重要的影响.但随着反应时间的 增加,酶活力急剧下降.可能的解释是,有机溶剂的渗透改变了酶蛋内部的构象,引起酶 活力的丧失.-.-. 釜暑 害蚤 ;曼 言晷 罩 量占 喜吾 田8环氧荤己烷胞外累积蘑与反应对目的芙磊 Fig3Relationshipbetwee?theextraeeilular aecumulatitlgamount0fthestyrene oxideandreactiontime 3.2苯Z蜡氯化的动力学过程 图5给出了现行实验体系的莱因威弗一 伯克(Lineweaver-Burk)动力学曲线. 类似的关系Ce)在甲烷的MMO酶促氧化过 程中也被观察到.从图中可以很方便地求出 Km=0.24(在lolS上的截距为一t:/Km. 这个值比甲烷氧化的Km小得多.在假设 MMO与底物复合体分解形成产物的速率比 它从底物的形成慢得多的情况下,Km的倒 数就是度量甲烷单加氧酶和各种相关底物相 对亲和力大小的一种指标.在这里,甲烷单 加氧酶与苯乙烯的亲和力也就可能比与甲烷 的亲和力要大.这个结果还可从R.I.Gv0一 zdev等的数据c7)中得到支持,他们发现, I~cacfiontime【h1 圈4簿j野力与反应时间的接蘑关幕 Fig.4Effect0freacfionth . theMMO’actlvitY一’ ? 圈5苯己烯生物倦化氧化的茉园威弗一伯克曲线 Fig.5Lineweaves—Barkdependenceof styre~eoxidattonnth.~fesence ofmetbanemonooxygenase 39 在单囊?夔氧.匕藏应体系中添加少量有机辩剂’如苯)詹Km值下_k由此萄浒能得出,甲 烷单加氧醇的活性中心位于该酶的疏水部位? 实验还砑究了在此两相体系中甲烷单加氧酶的最适温度的PH(40?,7.0).寰l是酶 话盘与髑腻囊赦发的关系.可以看出,当苯乙烯在反应体系中的体积占总体积的10时可 以梅列最佳的羹活力. 寰l不同底秭浓度下的一活力 TaMeIEffectofstYreneconcentrstionOGstyreneepoxidationincell suspensJoasofMet]tylomonassp.GYJ3 产物耗旋穗为a.=O.4.将产物浓度1.2×10—8~glml,池长度:0.05cm和灵敏度 S=0.005度/cm代入下式得: [.=一=0, × 4 l ~ .2 0. × 005 i-I+33 R构型环氧苯乙丰,截生曲肇通报,仃(5),288(1990). Fox,B.G.Frohnd,W.A.Dt,J.E.a?dLipscomb,D.J.Bio1.Chern.斛(17).1?嚣 {19B9). ?)拳材车,彗于僵化2(2)t120(1987). b)Rosev~tf,A.J.Chem.Tech.Biote~leoi.,3??127’曲锚). c)薹一明t?麓新-生暂化学等生钉钉理进晨,18(1)?26(瑚1). C?)Mehta,P.K.Mishr~S.andGhose~T.tJ.GenApFI.Mlerebiel,33?221(19 87). EY3Gvozdev,R.I.,Shushenacbeva,E.V.,Belova,V.S.,Pyiyasaeako—Novochat~ii,AI.,Oxldatios C0mmunicatIOnI,7(8?4),249(1984). 3毒O ? ? 一 _ ? ? ? ? ? ? ? ? JOuRNAL0FMOLECULARCATALYSIS(CHINA)877~381 STERE0SELECTIVITY0FSTYRENE0XIDEFR0M STYRENEEPOXIDAT10NBYMETHYL0一 M0NASSP.GYJ3 LiuAirain,Lishubell.MiaoDexun,LiuPeiqillgand YuWeile (StateKeyLaboratoryforOxo$#nthesisandSelectiveOxidation, LanzhouInstituteofChemicalPhysics,ChineseAcademyof Sciences,Lanzhou,730000) ABSTRACT Themethalle—utilizingbacteriaiswidelyusedtooxidizegaseous alkelles,suchaspropylene,tocorrespolldillgepoxidesthroughall NAD(P)H-requiringmonooxygellase.Asfafasweafeaware,no reportshaveappearedonthestereospecificityofstyreneoxideforreed bythebactefia.Thepresentworkwas11ndertakelltOtryoutthedlrect epoxidatlollofstyrellebythewholeceIlsuspellslOllsofMethylomonas speciesGYJ3withmoIecularoxy’genastheoxygelldonor. TheepoxidatiOllteactionproceedsIillearlyforuPto30rainat 4O”Csthespecificactlvityofthebiocatalystsis2326mgS.O.perhour gproteilltalldtheproductsaccumulatedextracellularly.TheoptimuIll temperature,pHandsttbstratecollcentrationfortheepoxidatiollreac— tioilareabout40?,7.0and10,resPectively. TheexperimelltaIresuitsshowedthattheepoxideproducedby wholecellsofMethytomonassp.GYJ3isopticallyactivewithvcry highenantiomericpurity.Theproducthasapositiverotation,+33.3, indicatillgthattheproductCOlatalnedexcess(R)一stytelleoxide. ThevaItieofK4froillLineweavel”一Barkcorrelatio?is0.24.Accor- dingtothekineticdata,thebilldingslteofsubstrateseemstolie within8hydrophohieregionofmethane111012ooxygenase,abiocatalyst. 0譬