紫杉醇提取工艺的研究进展 --毕业论文

紫杉醇提取工艺的研究进展 --毕业论文 【标题】紫杉醇提取工艺的研究进展 【作者】林 涛 【关键词】 紫杉醇 分离 纯化 提取 研究进展 【指导老师】梁 姗 【专业】生物科学 【正文】 1引言 紫杉醇(paclitaxel，商品名Taxol)是从红豆杉科红豆杉属(Taxus spp.)植物中分离出的具有紫杉醇烷独特骨架的二萜类化合物，外观为白色结晶粉末、不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂，是一种具有独特抗癌机制的天然产物。分子式:C47H51NO14，分子量:853.90，化学名:5β, 20-环氧-1, 2α, 4, 7β, 10β, 13α-六羟基紫杉醇烷-11-烯-9-酮-4, 10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-[(2'R. 3'S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯][1]，其结构式如图1-1所示: 图1-1 紫杉醇化学结构 紫杉醇具有独特的抗癌作用机制，能诱导与促进微管蛋白聚合、微管装备以及微管稳定，从而阻止肿瘤细胞的生长。正常情况下，微管与微管蛋白二聚体之间存在动态平衡，紫杉醇可以使两者之间失去动态平衡，导致细胞在有丝分裂时不能形成纺锥体和纺锥丝，抑制了细胞的分裂和增殖，从而发挥抗肿瘤作用。体外实验研究明，紫杉醇依赖性、可逆性地结合到微管上，尤其是结合到N端微管蛋白的β-亚蛋白上，这一作用降低聚合所需的微管蛋白浓度，是动态平衡向着微管装备的方向移动，增加聚合的速率与产量。紫杉醇诱导形成的微管较短，并且比不用紫杉醇时正常形成的微管屈回性约大10倍。另外，紫杉醇抑制有丝分裂所必需的微管网的正常状态再生，会防止正常的有丝分裂纺锥体的形成，导致染色体断裂并抑制细胞复制与转移，紫杉醇改变了细胞有丝分裂过程，使有丝分裂持续时间从0.5h增加到15h，并抑制细胞质分裂。这导致形成多核细胞，这些多核细胞继续回复到G1期，然后试图再次进行有丝分裂，但在有丝分裂中没有阻止细胞(Arresting cells)，在许多细胞中还观察到微核。抑制纺锥体的形成似乎与这种不正常的有丝分裂有关[2]。 紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。其药用效果非常显著，从总体上看，在没有一种植物抗癌新药能取代其位置之前，紫杉醇在世界各国均为医院首选的抗肿瘤药物。由于它特异的临床疗效，1992年被美国FAD批准为治疗晚期乳腺癌的特效药而上市。但是，在实际药物生产中，紫杉醇的大规模制备仍存在许多的问题。首先，紫杉醇来源匮乏，其主要存在于珍稀植物红豆杉树皮中，紫杉醇在植物体中含量很低，平均为0.0015% [3]。其次，存在大量紫杉醇类似物，这些类似物在植物化学结构和极性等方面又极为相似，要将它们完全分离困难很大。目前国际市场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮提取及半合成,迄今为止尚未见有第三种形式形成大规模工业化生 产的报道。 图1-2 08年1-10月紫杉醇价格变化 紫杉醇的工业生产受到了原料和技术两方面的制约，短期内难以突破[4]。目前从红豆杉中分离紫杉醇及半合成前体的过程一般是用甲醇或乙醇浸出(或超临界提取)，然后经己烷脱脂，二氯甲烷或氯仿萃取得粗提物，经多次硅胶柱色谱后再用制备型高效液相色谱(HPLC)、高速逆流色谱(HCSSS)纯化后重结晶得到产品[5,6]。 由于紫杉醇的资源短缺，加之分离时存在得率低，成本高，生产周期长等问题，导致紫杉醇价格昂贵(见图1-2)。为解决这些问题，国内外学者围绕增加得率，提高纯度，简化步骤等对紫杉醇的提取和纯化技术开展了一系列研究。因此，对紫杉醇的提取纯化技术进行深入细致的研究，建立高效、快捷、经济、实用的提取纯化方法就显得尤为迫切。 本课题主要探讨紫杉醇的提取和纯化工艺，从紫杉醇基本提取工艺入手，探讨国内外最新的生产、提取、纯化工艺，并对紫杉醇提取工艺存在的问题作出了探讨及对未来发展方向进行展望，以期为紫杉醇的生产提供一些有用的信息。 2 紫杉醇提取工艺 目前，工业生产中制备紫杉醇还局限于植物提取法。因此研制出一套操作简单、提纯高、提取率高的紫杉醇规模制备技术无疑对改善紫杉醇原料药产业现状发挥积极作用。 一般来说，从红豆杉中提取紫杉醇的分离工艺可以分为粗提和纯化两个阶段，随着科学技术的不断发展，紫杉醇分离工艺有了很大改进，紫杉醇的纯度和回收率都有较大的提高，分离时间也进一步缩短。其分离纯化过程可用图2-1表示: 图2-1 紫杉醇的提取纯化流程 目前用于浸提紫杉醇的最普通溶剂是甲醇和水，Xu和Liu [10]采用的是甲醇-二氯甲烷(95: 5)混合物，浸提时间为35-60min，而Hoke[11]和Powell [12]都选择的是纯甲醇，浸提时间则为16-48h。在大多数情况下还需对甲醇浸提液进行有机溶剂萃取，一般是在浸提液中加入二氯甲烷和水的混合物，即液液萃取。因为该方法可以有效的除去浸提液中约50%(质量比)的非紫杉烷类物质。 Cardellina[13] 曾采用一个较为复杂的分离系统，包括正己烷和氯仿之间的分相以及后来乙酸乙酷和水的分相。他发现所有的紫杉醇都在氯仿相中。这被后来的研究者[14]所证实，并使氯仿成为从生物体中提取紫杉烷类物质的提取液。 紫杉醇粗提阶段的目的在于从原料液中尽可能多的提取目标化合物，所得物料再进行后续提纯直至获得纯品。粗提过程可分为初级萃取和次级萃取，两种过程因所用溶剂不同而除去不同的杂质。将粗提物进一步纯化是获得纯品紫杉醇的关键步骤，通常用色谱法完成。在最后获得医用级纯品之前，色谱过程也必不可少。用色谱法分离纯化紫杉醇时，柱色谱被用于紫杉醇的预分离和最终分离，而薄层色谱则被用于紫杉醇的检测和纯化。目前，随着分离工艺的不断完善，除了柱色谱法以外，还有高效液相色谱[7]、高速逆流色谱[8]等。 目前不同工艺中各个步骤的纯度、回收率见表2-1[9]。 表2-1 紫杉醇提取纯化工艺中各个步骤所得纯度和回收率 方 法 纯度 / % 回收率 / % 提 取 甲醇 乙酸乙酯:丙酮(1:1) 固相提取法 0.0058 0.0065 115.8 + 5.3 萃 取 二氯甲烷 己烷脱脂 CH2Cl2-H2O(1:1) C18硅胶固相萃取 硅胶固相萃取 Al2O3固相萃取 0.27-0.31 1.0-1.28 1.23 8.3 6.44 9.6 99.3 99.1 98.2 101 色 谱 法 中压硅胶柱色谱 常压硅胶柱色谱 苯基硅胶介质色谱 氧化铝柱色谱 优化氧化铝柱色谱 大孔吸附树脂 大孔交换树脂 制备型TLC 40.6 14.63 77.4 26.3 ,27 2.15 62.6 13.91 98.9 92.0 140.5 ,170 99.6 99.7 精 制 C18制备型RP-HPLC C18硅胶常压反相柱色谱 SW-Taxame正相柱 Murry改良法 Kingston氧化法 溴加成 硅胶吸附柱色谱 98 95.1 98 97.5 95 99.21 80 96 78 3 紫杉醇的粗提方法 3.1固液萃取(SLE) 红豆杉的粗提浸膏中往往含有一些无极性或低极性的物质如油脂、蜡、叶绿素、精油、甾醇和树脂等，常采用一些低极性的有机溶剂进行去除。李春斌等人[15]采用石油醚对浸膏进行固液萃取，发现随着石油醚用量的增加浸出的杂质的数量也在增加，但当石油醚用量达到浸膏的5倍时，浸出的杂质数量不再有明显的增加。惠俊峰[16]采用正己烷对浸膏进行除杂，并发现，和原始浸膏的量相比，6倍体积的正己烷是一个优化值。 3.2液液萃取(LLE) 红豆杉的粗提浸膏中也含有一些强极性物质如鞣质、氨基酸、糖和盐等，常采用液液萃取的方式进行去除。Rao等人采用了三氯甲烷和水体系[17] ;With—erup采用二氯甲烷和水体系[18] ;EP553780采用了环己烷和二氯甲烷体系[19] ;Ramesh等人采用亚甲基氯和三氯甲烷或乙烯和水(体积比1:1)体系[20];周浩然等人采用甲醇和正己烷及甲醇和乙酸乙酯体系[21] ;郭立佳采用甲醇和正己烷及三氯甲烷0.5mol ,L的Na2CO3溶液体系[22] 。 液液萃取简单易行，不需要特殊设备;但提取物杂质含量高，回收率低、分离效果差，还常常伴随着难以消除的乳化现象。 3.3 固相萃取(SPE) 尽管在对红豆杉属植物进行粗提时大量使用了液液萃取法，而且技术也相当成熟，但固相萃取法与其相比仍具有某些独特的优点，此方法应用于紫杉醇的纯化可以快速除去浸膏中与紫杉醇极性相差较大的脂、蜡及色素等杂质。它利用固相吸附剂去掉浸提液中的某些杂质，相当于首先进行了一次色谱纯化。因而可达到节省时间，降低有机溶剂用量，提高选择性和回收率等目的。固相萃取法使用的主要设备是滤筒。滤筒的使用是从1978年开始，目前已有部分学者将其用于紫杉烷类物质的分离与纯化。通常的做法是将含有紫杉烷类物质的原料加入滤筒，然后进行梯度洗脱。这种方法除能达到液液萃取之效果，还能从一定程度上达到初级色谱分离的效果。 Matina等人[23]比较了三种不同的固相萃取方法，第一种方法是用C18萃取柱作为滤筒，第二种方法是将C18吸附剂装入聚丙烯过滤柱制成滤筒，第三种方法使用的设备是C18 Empore滤板和MilliPore玻璃过滤器。无论使用何种装置进行萃取，都能从粗提物中大量分离收集紫杉烷类化合物，取得良好效果。 韩丽萍等[24]选择中性氧化铝进行固相萃取，有效的去除了紫杉浸膏和紫杉口服液制剂中的杂质和干扰物，使其中的待测成份紫杉醇得到了准确有效的定量分析。 张志强等[25]依次使用三氧化二铝和C18作为固相萃取的固定相。在三氧化二铝SPE中，依次用甲醇、氯仿各1OmL活化固相柱，然后将溶于氯仿的红豆杉浸膏溶液0.5mL加入柱中，用100%、98%、95%氯仿-甲醇各lOmL洗脱，紫杉醇集中在95%氯仿溶液中;在C18SPE中，依次用lOmL乙酸乙酷、甲醇活化固相柱，然后将溶于40%-60%甲醇乙酸铵水溶液中的红豆杉浸膏溶液0.5mL加入柱中，分别用20%、60%、75%甲醇乙酸铵水溶液(0.01mol/L)各10ml洗脱，紫杉醇集富集在75%梯度中。最后使用HPLC方法定量，比较两种固定相的实验结果，发现C18效果较好，但该固定相价格昂贵。总体而言，使用固相萃取结合HPLC对紫杉醇及其类似物进行定量有很多优点。具有很大的发展潜力。 3.4 超临界流体萃取法(SFE) 超临界流体萃取是利用处于临界压力和临界温度以上的流体具有特异增加的溶解能力而发展起来的化工分离新技术。超临界流体萃取技术用于紫杉醇的提取纯化过程，可以减少含氯有机溶剂的使用，避免了对环境的污染，近年被逐渐应用于紫杉醇的纯化过程中。SFE中最常用的超临界流体是二氧化碳，它本身无毒且易于从提取物中分离，是一种环保、安全的新技术。 Jennings等人进行了超临界流体萃取法的研究，发现短叶红豆杉(Taxus brevifolia)树皮中的紫杉醇大部分都能得到有效的提取，回收率达85,以上，对紫杉醇的选择性也比传统的单纯乙醇溶剂好得多[26] 。 Nair等人报道使用0.001%-15%的丙酮或乙腈的超临界CO2，在43.4MPa，35?下也可以有效的提取东北红豆杉中的紫杉醇[27] 。 Caster等人以红豆杉枝叶和嫩芽作原料，用超临界技术提取紫杉醇时，先以纯CO2作溶剂，以除去原料中的脂类，然后加入乙醇调节溶剂的极性，使紫杉醇的产率达到0.04%[28]。 Chun等人利用超临界CO2，分别在加入或不加入助溶剂的情况下，对东北红豆杉的树叶中提取紫杉醇和三尖杉宁碱作了研究，结果表明这种方法比传统的溶剂具有更高的选择性[29]。 Vandana等人利用超临界的N2O以及N2O与乙醇的混合物，从短叶红豆杉树皮中提 取紫杉醇[30] 。李华等人用甲醇为修饰剂的CO2流体，在27.6 MPa，31?下萃取红豆杉枝叶，萃取率高达96.7% [31]。Aurillola 等人[32]将超声技术引入到初级萃取，可以在低温下进行操作，这样可以避免紫杉醇在温度较高时可能发生的异构化，并使提取时间大大缩短。 虽然SFE技术在紫杉醇的提取中具有收率高、节省时间和有机溶剂等优点，但该方法对仪器设备要求较高，限制了其应用。 4 紫杉醇的纯化方法 无论是从天然的红豆杉植物还是从培养的植物细胞组织及微生物发酵液中提取紫杉醇，都涉及到如何能分离并去掉与紫杉醇结构相似的其他紫杉烷类化合物。因此，如何分离紫杉醇及其类似物，无论在基础研究还是在实用价值上都是一项非常有意义的工作。目前，国际上一般的紫杉醇纯化方法主要有碱性氧化铝作柱层析法、正、反相层析法、薄层色谱法，高速逆流色谱法，胶束电动毛细管色谱法。其中反相层析法运用较多，胶束电动毛细管色谱法是近几年发展起来的纯化方法，其运用虽不广泛，但有很大的发展潜力。 4.1 碱性氧化铝作柱层析法 红豆杉提取液中含有很多杂质且紫杉烷类的含量较紫杉醇类大，必须经过纯化处理以提高紫杉醇的纯度。纯化紫杉醇的方法很多，但是在使用碱性氧化铝作柱层析时会出现一些化学反应，导致紫杉烷类转化为紫杉醇，使紫杉醇的含量和纯度均增加,使紫杉醇的回收率有可能大于100%。 用氧化铝作柱层析的材料与步骤:甲醇及三氯甲烷等溶剂用分子筛脱水，层析用Al2O3，在190oC下干燥6h，用三氯甲烷充分浸泡，超声波脱气5min，装柱。三氯甲烷清洗柱后进料，用三氯甲烷淋去未被吸附的杂质，然后采用不同浓度的甲烷/ 三氯甲烷进行洗脱，收集洗脱出来的紫杉醇，用旋转蒸发器蒸干，从所得的固体中取样，HPLC测定其纯度，层析柱用100,的甲烷再生备用。 4.2 正相色谱法 正相色谱是紫杉醇分离纯化过程中普遍采用的方法，在早期分离纯化的研究中占有主导地位，至今仍在广泛使用。正相色谱一般是使用一些极性较小的有机溶剂作流动相,硅胶作固定相，将紫杉烷类化合物洗脱出来。正相色谱的突出优点是固定相价格低廉，用普通的硅胶即可，而且洗脱用的流动相多为挥发性很强的有机溶剂，溶剂回收简单。 陈建民等[33] 以50-300目硅胶做固定相，在常压下梯度洗脱含10-48%的紫杉醇粗品，用无毒性的正构烷烃、乙醋为洗脱剂，常压下分离纯化紫杉醇，洗脱所得馏分经真空冷冻干燥，得到99%-99.5%的紫杉醇。该方法工艺简单，成本低，溶剂、洗脱剂容易回收，但回收率较低。 4.3 反相色谱法 由于正相色谱所使用的固定相大多为硅胶，而硅胶的不可逆吸附使样品损失增大，并且硅胶固定相只能使用一次，操作十分不便，因而反相色谱的使用越来越广泛。在紫杉醇研究初期，反相色谱的应用主要体现在高效液相色谱方面，多用于样品的分析检测。一般情况下，反相色谱使用极性较大的有机溶剂作为流动相，先将一些杂质及色素洗脱下来，然后再增大梯度将紫杉烷类化合物洗脱出来。 张志强等[34]选择了廉价的大颗粒C18烷基硅胶层析柱纯化紫杉醇粗品，并对层析操作条件进行了优化，使紫杉醇的含量提高到98%，回收率在85%以上，并且采用该固定相可以降低紫杉醇的生产成本和提高回收率。目前，作为反相色谱固定相的还有五氟基苯、双苯基、氰基硅胶等[35]。 刘开录等[36]报道了一种用多孔型聚苯乙烯-二乙烯基苯高分子微球作固定相反相分离纯化紫杉醇的工艺过程，选择的流动相为丙酮-水或甲醇-水，梯度洗脱，用三步柱色谱过程能够使紫杉醇和其它一些类似物质如巴卡亭III和三尖杉宁碱等得到纯化。该高分子微球廉价，化学稳定性好，效率高，可以反复使用，适合于紫杉植物各部分的提取。 相对于正相色谱工艺，反相色谱有很多优点。首先，它不消耗大量的有机溶剂，对环境污染较小;其次，人们在开发反相填料时专门引入的一些特定的键合相使反相填料有更好的选择性，在克服正相硅胶的不可逆吸附造成目标产物回收率低方面也很有价值。 近几年来，很多显示，将正相色谱分离和反相色谱分离相结合，可以取得较好效果。卢立晃等[37]在将原料经混合溶剂浸提后，浓缩，溶剂提取，正相硅胶柱层析得到紫杉醇粗产品，将其重结晶后， 使用反相硅胶高效液相色谱仪进行最后分离，用甲醇-水作为洗脱剂，得到了纯度大于98%的紫杉醇晶体，得率为十万分之七点二。 洪承绪等[38]首先使用甲醇浸提原料粉末，浸提液中加入合成吸附剂，如活性白土、活性木炭和活性炭等，搅拌10-40min，过滤所得滤液用二氯甲烷洗涤后浓缩，浓缩液加入到1000%体积的己烷中得到沉淀物，过滤得到粗紫杉醇，将该粗品再溶于乙醇-水中，静放置沉淀，得到纯度大于85%的紫杉醇，最后使用两种HPLC色谱法进一步分离:ODS(C18)色谱柱除去非极性杂质，硅胶色谱柱除去极性杂质。得到了纯度大于99%的紫杉醇晶体，回收率大于90%。虽然该方法结果非常满意，但使用制备HPLC法，成本太高，不适用于工业化生产。 现在，尚有待于开发一种可以用于大规模工业化生产的正相色谱结合反相色谱分离紫杉醇及其类似物的方法，以便从有限的红豆杉资源中分离纯化出更多的紫杉醇。 4.4 层析法 层析法有很多种类，可以用于紫杉醇的提取和纯化。其中国内多采用硅胶、氧化铝正相层析法，国外多采用大孔吸附树脂或反相层析法。前者因负载纯化量小、纯化步骤多而使生产效率难以提高，且耗费大量溶剂;后者克服了前者的不足，但因大孔吸附树脂或反相填料介质价格昂贵，且易被杂质污染，导致使用寿命很短，再生十分困难，且耗费大量溶剂，很难在大规模生产中重复使用。而我国采用的技术利用特殊色层分离介质，不仅提高了回收率，且可使部分非紫杉醇结构物转化为紫杉醇。该技术具以下优点:分离纯化量大，载体可反复使用，并且有良好的重复性，综合成本降低40,以上，整个生产纯化工序仅2-3步。提高了紫杉醇与其类似物(尤其是三尖杉宁碱)的分离效率，用同样规摸的设施可使紫杉醇的生产量比用其他方法高3-5倍之多。 4.5 薄层色谱法 薄层色谱(thin-layer chromatography,TLC)也是分离紫杉醇的常用方法。一般先把提取液浓缩，然后在TLC硅胶板上平行点样，用丙酮、氯仿、甲醇、庚烷、乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯等展开，再进行紫杉醇的定位。定位的方法有:与样进行对照，在254 nm紫外线下进行定位标记，刮下每一部位，装入小柱。用甲醇洗脱，将洗脱液蒸干，从而使紫杉醇得到分离。 Matysik等[39]用TLC进行的2梯度展开法分离紫杉醇也取得成功，结果可使紫杉醇峰得到满意的分离。Stasko等[40]采用双向薄层色谱技术从紫杉烷类物质中分离紫杉醇和三尖杉宁碱，其优点在于可从大量紫杉烷类物质中分离出紫杉醇。刘晓兰等[41]用TLC的方法对紫杉醇进行定性分析，以氯仿:甲醇(7:1)为展开剂，显 色采用l,香草醛浓硫酸溶液，Sigma公司产的紫杉醇标准品作对照， 也取得了可喜的效果。 4.6 胶束电动毛细管色谱法 胶束电动毛细管色谱法(micelar electrokinetic capillary chromatography，MECC)是近年发展起来的一种新的分离提纯技术。胶束电动毛细管色谱法具有分离效率高、溶剂消耗小、速度快等优点。Chart等[42]采用胶束电动色谱体系分离紫杉醇、三尖杉宁碱、巴可亭-?以及它们的去乙酰衍生物。同时，他们还比较了高效液相色谱和MECC的分析效果，发现MECC对红豆杉的粗提物中的紫杉醇、三尖杉宁碱和巴可亭-?得到很好的分离，而在HPLC中则有很多干扰，达不到基线分离，且MECC所用的溶剂比HPLC少，但其处理量小、操作复杂的缺点限制了它的应用 4.7 药理作用靶点法 药物的作用靶点是指药物在生物体内发生作用时进攻或结合的组织。紫杉醇的药理作用结果表明，紫杉醇的药理作用靶点是体内的微管。微管是微管蛋白的聚合态，微管蛋白的最主要特征是高温下聚合成微管，低温下解聚成微管蛋白，而与紫杉醇最难分离的三尖杉宁碱不具有这种特性，在一定的条件下，利用药理作用靶点法处理后，可以使紫杉醇的纯度达到95%以上。 4.8 柱切换技术法 柱切换技术是色谱分析中用于极其复杂样品分析方法之一。利用切换阀改变不同的色谱系统，达到在线样品的净化、组分富集等目的。它对生物样品的药物分析具有很大的潜力。液相色谱柱切换法实为一种在线的固相分离技术，常用一个长3-5cm，填以粒径25-40cm填料的预处理柱。选择一个低溶剂强度的预处理流动相使生物样品净化，切换阀启动后，流动相将组分带入分析柱分离测定。比较其他的提取方法，其优点是可以获得高纯度的样品，广泛用于紫杉醇的提取。 4.9 高速逆流色谱法(HSCCC) HSCCC技术是当前国际上较为新型的一种液液分配技术，具有分离效率高、制备量大、回收率高、 溶剂用量少，分离周期短，操作简单的优点，同时还具有无固体载体逆流色谱的内在优点，有望成为一种新的大规模制备紫杉醇的方法。Chiou等人使用循环的高速逆流色谱分离紫杉醇和三尖杉宁碱的混合物，循环2次后，2种物质谱峰的分离度由0.7上升到1.27[43]。但是，到目前为止，HSCCC技术还不够成熟，还有许多理论和技术问题需要进一步研究解决，也没有稳定可靠的商业化仪器，限制了HSCCC在工业化方面的应用。 5(紫杉醇提取工艺存在的问题及展望 5.1 紫杉醇提取工艺存在的问题 (1)紫杉醇在原料中的含量很低。在植物体中为0.0001%-0.0069% ，平均0.0015%。人工种植红豆杉虽已经有一定规模，但生长周期过长。细胞组织培养法对培养的各种条件已经研究得比较透彻，也经行了小试和中试，但离工业化大规模生产还有很大的距离。要真正应用于工业生产来获取紫杉醇，还有很多具体问题需要解决。 (2 )紫杉醇类似物很多。紫杉醇类似物是在自然界中存在的或者在细胞培养过程中诱导产生的结构、性质比较接近的紫杉烷类化合物。几种常见的紫杉醇类似物有三尖杉宁碱(Cehalomannine)，巴卡亭III，10-去乙酞巴卡亭III(10-DAB), 7-表-紫杉醇(7-epi-taxol)等。由于结构与性质比较接近，使得紫杉醇与其它类似物的分离十分困难，这也是研究者们面临的一个重要难题。 (3) 紫杉醇在分离过程中很容易转化。紫杉醇受温度、有机溶剂、酸、碱等环境条 件的影响，容易降解或异构生成其它紫杉烷类物质。这个问题不解决好将浪费相当一部份本来就宝贵的紫杉醇。而在氧化铝作柱层析中却把其他紫杉醇类似物转化为紫杉醇，为我们今后的研究提供了方向，寻找转化率能力更加强的纯化方法。 (4 )实际应用对紫杉醇的纯度要求很高，必须大于98.5%，甚至更高，并且紫杉醇只有达到一定浓度时才能结晶析出。使紫杉醇的纯化工作的生产能力得不到较大的提高，提取成本得不到很好的降低。 (5) 对于紫杉醇的半合成，通常条件较为苛刻，反应步骤较多，制备成本也较昂贵，如通过三尖衫宁碱结构修饰制备紫杉醇，反应分多步进行，路线复杂，从而影响了紫杉醇的产率。这些都给紫杉醇半合成的工业化带来很大挑战。 (6)缺乏良好的适合于发酵的工业菌株，由于发酵条件的限制，单位培养液中紫杉醇的含量低[47] 。 5.2 紫杉醇提取工艺展望 5.2.1人工合成 紫杉醇分子结构复杂,具有特殊的三环[6+8+6]碳架和桥头双键以及众多的含氧取代基。其全合成引起国内外许多有机化学家的兴趣。先后共有30多个研究组参与研究，经20多年的努力，于1994年才由美国的R.A.Holton与K.C.Nicolaou两个研究组同时完成紫杉醇的全合成。百时美施贵宝公司也在1994年，成功地利用红豆杉树的细枝、叶等可再生材料，提取初级原料，再人工半合成生产紫杉醇。其半合成生产方法获得了美国FDA的批准。 后来,S.T.Danishefsky(1996年)、P.A.Wen-der(1997年)、T.Mukaiyama(1998年)和I.Kuwaji-ma(1998年)4个研究组也完成这一工作。 目前生物合成这一领域的首要问题是:详细阐述紫杉醇的生物合成途径，确定紫杉醇生物合成途径中的速度限制步骤，再运用现代生物基因技术来改变关键基因以增加它们的速率，增强其衍生酶的效率[44]。研究紫杉醇在天然红豆杉属植物中的生物合成路线及条件，对于未来紫杉醇的生产具有重要意义。 5.2.2 真菌生产 利用生物的方法大规模生产紫杉醇是使用生物工程手段，培育、筛选出可大量产生紫杉醇的菌株，通过对菌株的培养，不用再人工种植和砍伐红豆杉树。 Strobel等人[45]发现，寄生于某种红豆杉上的真菌能产生紫杉醇。到目前为止,人们已发现20 多种内生真菌可以产紫杉醇,其寄主也不仅限于红豆杉属植物, 从秃柏、Wollemi松及Torreya grandifolia等非红豆杉属植物中也分离到了可产紫杉醇的内生真菌，充分证明了紫杉醇产生菌及其宿主的生物多样性。但利用内生真菌发酵培养生产紫杉醇仍未能达到中型或大型工业化生产规模[46] (要达到工业化生产表达率至少为毫克级,而现在普遍产量仅仅为几百微克)。 另据报道，2001年Huang Q 等[48]获得紫杉醇生物合成的重要中间产物紫杉二烯(Taxadiene ,产量达113mg/L) ,成为基因工程菌合成紫杉醇中间体的先例;西安一枝刘制药公司的研究人员从中国红豆杉树皮中分离出一种内真菌，进行重组诱变后通过菌种优化培养，紫杉醇及Baccatin?在培养液中的浓度分别达到2mg/L，有望实现产业化[49]。 5.2.3 植物组织培养 利用植物细胞来生产紫杉醇是目前紫杉醇研究的另一热点，细胞组织培养法就是将红豆杉植物的茎、形成层或树皮的愈伤组织诱导，进行继代培养，再建立细胞的悬浮培养，进而扩大培养生产紫杉醇。由于根是除树皮外紫杉醇含量较高的器官，人们利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染红豆杉植物外植体诱导生根， 通过此培养系统进行紫杉醇生产的尝试，因为这一培养系统无需外援激素、发根生产迅速、遗传性状稳定而受到重视。 该方法不受病虫害、季节的影响，在生物反应器中大规模生产并通过控制培养条件诱导出大量的紫杉醇，这与从植物体内直接提取得到的紫杉醇相比，可简化分离、纯化的步骤，同时还可以生产紫杉醇的半合成前体及其他有抗癌活性的原植物体内不含有的化合物。目前对于组织细胞培养的一些工艺条件，如外植体、光照、培养基组成等因素对细胞培养及紫杉醇生产的影响已基本摸清，正在研究反应器的放大技术和新的技术生长点，可望实现由红豆杉细胞培养生产紫杉醉的突破。有望实现红豆杉细胞培养生产紫杉醇的突破。 规模化、集约化营造红豆杉人工原料林是目前解决紫杉醇原料短缺的主要途径。随着研究的不断深入，紫杉醇原料将随着真菌发酵和组织培养等技术的发展实现原料的供给，逐步会解决目前困扰着各国科学家的紫杉醇产业原料紧张的局面。进行真菌发酵和细胞组织培养生产紫杉醇，将是今后紫杉醇产业发展的方向，要继续从自然界中筛选更好的适合发酵的原始出发菌株，并对现有高产紫杉醇产生菌进行遗传改造，使其能够产生大量菌丝体来提高紫杉醇的产量。 紫杉醇提取纯化技术不断进步，新的技术和手段不断出现并应用，并显示来良好的发展前景，这些技术将推动紫杉醇生产的低成本、高效率的产业化进程，为人类医疗和攻克癌症做出更大的贡献。