微生物学实验技术指导书

微生物学实验技术指导书 实验须知 普通微生物学实验课的目的是，训练学生掌握微生物学最基本的操作技能;了解微生物学的基础知识;加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验;培养学生观察、思考、分析问题、解决问题和提出问题的能力;养成实事求是、严谨认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神;树立勤俭节约、爱护公物的作风。 为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项: 1.每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。 2.认真、及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。 3.实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。 4.实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导老师，及时处理，切勿隐瞒。 5.实验过程中，切勿使乙醇、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。 6.使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。 7.每次实验完毕后，必须把所有仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石碳酸液覆盖0.5小时后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具(如吸管、玻璃刮棒等)在洗涤前需浸泡在3%来苏尔液中进行消毒。 8.每次实验需进行培养的材料，应标明姓名、组别及处理方法，放于教师指定的仪器内培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。 9.每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告中，力求简明准确，认真回答思考题，并及时汇交教师批阅。 10.实验结束后，整理桌面，物归原处，留人打扫室内卫生。 11.离实验室前，将手洗净，注意关闭火、煤气、灯、水管等。 微生物学实验室常用器皿 微生物学实验所用的器皿，大多要进行消毒、灭菌后用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。玻璃器皿一般要求硬质玻璃，才不受高温和短暂的烧灼而不至破裂;玻璃器皿的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度;玻璃器皿的形状和包装方法要求能防止污染杂菌为准;洗涤玻璃器皿的方法不当，也会影响实验的结果。目前国外微生物学实验室中，有些玻璃器皿(如培养皿、吸管等)已被一次性塑料制品所代替，但玻璃器皿仍是重要的实验室用具。本节将主要对玻璃器皿做详细介绍，同时也对接种或转移微生物工具做相应的说明。 一、器皿的种类、要求与应用 1.试管(test tube) 微生物学实验室所用玻璃试管，其管壁必须比化学实验室用的厚些，这要在塞棉花塞时管口才不会破损。试管的形状要求没有翻口(图?-1，A)，不然，微生物容易从棉塞与管口的缝隙间进入试管造成污染，也不便于盖试管帽。有的实验要求尽量减低蒸发试管内的水分，则需要使用螺口试管，盖以螺口胶木塞或塑料帽(图?-1，B，C)。培养细菌一般用金属(如铝)帽或棉塞(图?-1，D，E)。也有的用泡沫塑料塞。 试管的大小可根据用途的不同，准备下列三种型号:(1)大试管(约18mm?180mm)，可盛倒平板用的培养基;亦可作制备琼脂斜面用(需大量菌体时用)和盛液体培养基用于微生物的振荡培养;(2)中试管(约13-15mm?100-150mm)，盛液体培养基培养细菌或作琼脂斜面用，亦可用于细菌、病毒等的稀释和血清学试验;(3)小试管(10-12mm?100mm)，一般用于糖发酵或血清学试验，和其他需要节省材料的试验。 2.德汉氏小管(Durhamtube) 观察细菌在糖发酵培养基内产气情况时，一般在小试管内再套一倒置的小套管(约6mm?36mm)，(图?-2，A)。此小套管即为德汉氏小管，又称发酵小套管。 3.小塑料离心管，又称Eppendorf管(图?-2，B)。有1.5ml和0.5ml两种型号，主要用于微生物分子生物学实验中，小量菌体的离心、DNA(或RNA)分子的检测、提取等。 4.吸管(pipette) (1)玻璃吸管(glass pipette)和吸气器(aspirator) ?玻璃吸管 微生物学实验室一般要准备1、5、10ml的刻度玻璃吸管。这种吸管一般有两种类型，一种是称之为血清学吸管(serological pipette)，这种吸管刻度指示的容量包括管尖的液体体积，使要将所吸液体吹尽(图?-3，A);另一种类型 称之为测量吸管(measuring pipette)，这种吸管刻度指示的容量不包括管尖的液体体积，使用时不能将所吸液体吹尽，而是到达所设计的刻度为止(图?-3，B)。 除有刻度的吸管外，有时需用不计量的毛细吸管，又称滴管(图?-3，C)来吸取动物体液和离心上清液以及滴加少量抗原、抗体等。 ?吸气器 在使用刻度玻璃吸管时，一般可采用几种不同的吸气器。图?-4中的三种类型目前都有市售。使用时，将吸管插入吸气器下端，通过旋动转盘键(图?-4，A中的a)，或按图?-4，B中的不同部分(b、c、s)，或按图?-4，C中的d、e键来吸取或释放液体。如果嘴吸，则一定要在吸管上端塞有棉花。 用刻度吸量管取液体的体积时，以液体的凹面为准(图?-3，D)。 (2)微量吸管(micropipette)又称微量加样器，主要用来吸取微量液体，规格型号很多，图?-5表示其中的一种型号。每个微量吸管在一定范围内可调节几个体积，并都标有使用范围，例如:0.5,10μl、2,10μl、10,100μl、100,1000μl等。使用时:?将合适大小的塑料嘴(tip)牢固地套在微量吸管的下端;?旋动调节键(图?-5，A)，使数字显示器上(图?-5，B)显示出所需要吸取的体积;?用大拇指按下调节键(图?-5，C)，并将吸嘴插入液体中;?缓慢放松调节键，使液体进入吸嘴，并将其移至接收试管中;?按下调节键，使液体进入接收管;?按下排出键，以去掉用过的空吸嘴或直接用手取下吸嘴。 除了可调的微量吸管外，也有不可调的，即一个吸管只固定一种体积。因应用范围受到限制，所以一般用得较少。 5.培养皿(petri dish) 常用的培养皿(图?-6)，皿底直径90mm，高15mm，皿底皿盖均为玻璃制成，但有特殊需要时，可使用陶器皿盖，因其能吸收水分，使培养皿表面干燥。例如测定抗生素生物效价时，培养皿不能倒置培养，则用陶器皿盖为好。 在培养皿内倒入适量固体培养基制成平板，可用于分离、纯化、鉴定菌种，活菌计数以及测定抗生素、噬菌体的效价等。 6.三角烧瓶(erlenmeyer flask)与烧杯(beaker) 三角烧瓶有100、250、500和1000ml等不同的大小，常用来盛无菌水、培养基和振荡培养微生物等。常用的烧杯有50、100、250、500和1000ml等，用来配置培养基与各种溶液等。 7.注射器(injector) 一般有1、2、5、10、20、25ml不同容量的注射器。注射抗原于动物体内，可根据需要使用1、2、5ml的;抽取动物心脏血或绵羊静脉血可采用10、20、50ml的。 微量注射器有10、20、50、100μl等不同的型号。一般在免疫学或纸层析、电泳等实验中滴加微量样品时应用。 8.载玻片(slide)与盖玻片(coverslip) 普通载玻片大小为75mm?25mm，用于微生物涂片、染色、做形态观察等。盖玻片为15mm?18mm。 凹玻片是在一块较厚玻片的当中有一圆形凹窝(图?-7)，做悬滴观察活细菌以及微室培养用。 9.双层瓶(double bottle) 由内外两个玻璃瓶组成(图?-8)，内层小锥形瓶放香柏油，供油镜头观察微生物时使用，以瓶盛放二甲苯，用以擦净油镜头。 10.滴瓶(dropper bottle) 用来装各种染料、生理盐水等(图?-9)。 11.接种工具 接种工具有接种环(inoculating loop)、接种针(inoculating needle)、接种钩(inoculating hook)、接种铲(inoculating shovel)、玻璃涂布器(glass speader)等(图?-10)。制造环、针、钩、铲的金属可用铂或镍，原则是软硬适度，能经受火焰反复灼烧，又易冷却。接种细菌和酵母菌用接种环和接种针，其铂丝或镍死直径以0.5mm为适当，环的内径为约2-4mm，环面应平整。 图?-11表示一个简易地制作接种环的方法。接种某些不易与培养基分离的放线菌和真菌有时用接种钩或接种铲，其丝的直径要粗一些约1mm。用涂布法在琼脂平板上分离单个菌落时需用玻璃涂布器，是将玻璃棒弯曲(图?-12)或将玻璃棒一端烧红后压扁而成。 二、玻璃器皿的清洗方法 清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，因此，玻璃器皿的清洗是实验前的一项重要准备工作。清洗方法根据实验目的、器皿的种类、所盛的物品、洗涤剂的类别和玷污程度等的不同而有所不同。现分述如下: 1.新玻璃器皿的洗涤方法 新购置的玻璃器皿含游离碱较多，应在酸溶液内先浸泡数小时。酸溶液一般用2%的盐酸或洗涤液(见附录?)。浸泡后用自来水冲洗干净。 2.使用过的玻璃器皿的洗涤方法 (1)试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯等可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。热的肥皂水去污能力更强，可有效地洗去器皿上的油污。洗衣粉和去污粉较难冲洗干净而常在器壁上附有一层微小粒子，故要用水多次甚至十次以上充分冲洗，或可用稀盐酸摇洗一次，再用水冲洗，然后倒置于铁丝框内或有空心格子的木架上，在室内晾干。急用时可 盛于框内或搪瓷盘上，放烘箱内烘干。 玻璃器皿经洗涤后，若内壁的水均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净，若挂有水珠，则还需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水充分冲洗。 装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤。带菌的器皿在洗涤前先浸在2%煤酚皂溶液(来苏水)或0.25%新洁尔灭消毒液内24小时或煮沸0.5小时，再用上法洗涤。带病原菌的培养物应先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。 盛放一般培养基用的器皿经上述方法洗涤后，即可使用，若需精确配置化学药品，或做科研用的精确实验，要求自来水冲洗干净后，再用蒸馏水淋洗三次，晾干或烘干后备用。 (2)玻璃吸管 吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液的玻璃吸管(包括毛细吸管)，使用后立即投入盛有自来水的量筒或标本瓶内(量筒或标本瓶底应垫有脱脂棉花，否则吸管投入时容易破损)，免得干燥后难以冲洗干净，待实验完毕，再集中冲洗。若吸管顶部塞有棉花，则冲洗前先将吸管尖端与装在水龙头上的橡皮管连接，用水将棉花冲出，然后再装入吸管自动洗涤器内冲洗，没有吸管自动洗涤器的实验室，可用冲出棉花的方法多冲洗片刻，必要时再用蒸馏水淋洗。洗净后放搪瓷盘中晾干，若要加速干燥，可放烘箱内烘干。 吸过含有微生物培养物的吸管亦应立即投入盛有2%煤酚皂溶液，或0.25%新洁尔灭消毒液的量筒或标本瓶内，24小时后方可取出冲洗。 吸管的内壁如果有油垢，同样应先在洗涤液内浸泡数小时，然后再行冲洗。 (3)载玻片与盖玻片 用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油，要先用皱纹纸擦去或浸在二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，再在肥皂水中煮沸5-10分钟，用软布或脱脂棉花擦拭，立即用自来水冲洗，然后再稀洗涤液中浸泡0.5-2小时，自来水冲去洗涤液，最后用蒸馏水换洗数次，待干后浸于95%乙醇中保存备用。使用时在火焰上烧去乙醇。用此法洗涤和保存的载玻片与盖玻片清洁透亮，没有水珠。 检查过活菌的载玻片与盖玻片应先在2%煤酚皂溶液或0.25%的新洁尔灭消毒液中浸泡24h，然后按上述洗涤与保存。 三、空玻璃器皿的包装 1.培养皿的包装 培养皿常用旧报纸密密包紧，一般以5-8套培养皿作一包，少于5套工作量太大，多于8套不易操作。包好后行干热或湿热灭菌。如将培养皿放入金属(不锈钢)筒内进行干热灭菌，则不必用纸包，金属筒有一圆筒型的带盖外筒，里面放一装培养皿的框架(图?-13)，此框架可自圆筒内提出，以便装取培养皿。 2.吸管的包装 准备好干燥的吸管，在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段约1.5cm长的棉花，以免使用时将杂菌吹入其中，或不慎将微生物吸出管外。棉花要塞得松紧恰当(过紧吹吸液体太费力;过松吹气时棉花会下滑)，然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的近左端，与报纸约成45?(图?-14)，并将左端多余的一段纸覆折在吸管上，再将整根吸管卷入报纸，再将右端多余的报纸打一小结。如此包好的很多吸管可再用一张大报纸包好，进行干热灭菌。 如果有装吸管的铜或不锈钢筒(图?-15)，亦可将分别包好的吸管一起装入筒内，进行灭菌;若预计一筒灭菌的吸管可一次用完，亦可不用报纸包，而直接装入筒内灭菌，但要求吸管尖朝筒底。使用时，将筒卧放在桌上，用手持粗端抽出。 3.试管和三角烧瓶等的包装 试管管口和三角烧瓶瓶口塞以棉花塞(做棉塞的方法见实验十六)或泡沫塑料塞，然后在棉花塞与管口和瓶口的外面用二层报纸以细线包扎好(如果能用铝箔则更好，可省去用线扎且效果好)。进行干热或湿热灭菌，试管塞好塞子后也可一起装在铁丝篓中，用大张报纸或铝箔将一篓试管口做一次包扎，包纸的目的在于保存期避免灰尘侵入。 空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若用湿热灭菌，则要多用几层报纸包扎，外面最好加一层牛皮纸或铝箔。 实验一、显微镜的构造及使用方法 一、目的要求 (1)了解显微镜的构造、性能及成像原理。 (2)掌握显微镜的正确使用及维护方法。 二、实验器材 (1)显微镜、擦镜纸。 (2)酵母菌示教标本。 三、普通光学显微镜简介 对于微生物，使用肉眼难以直接观察其形态结构，只有借助于显微镜，才能对它们进行研究和利用。因此显微镜是必不可少的工具。为了充分发挥显微镜的工作性能，首先必须了解每一部件的结构和功能，通过反复使用，熟练地掌握其操作技术。 显微镜可分为电子显微镜和光学显微镜两大类。后者包括:明视野显微镜、暗视野显微镜、差相显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜、紫外显微镜及立体显微镜等。其中以明视野显微镜常用，其它显微镜都是在此基础上发展而来的，基本结构相同，只是在某些部分做了一些改变。明视野显微镜简称显微镜。 (一)显微镜的构造 光学显微镜的基本构造可分为机械系统和光学系统两大部分(图1-1)。 1.机械系统 (1)镜座(Base):在显微镜的底部，呈马蹄形、长方形、三角形等。 (2)镜壁(Arm):连接镜座和镜筒之间的部分，呈圆弧形，作为移动显微镜时的握持部分。 (3)镜筒(Tube):位于镜壁上端的空心圆孔，是光线的通道。镜筒的上端可插入接目镜，下面与转换器相连。镜筒的长度一般为160mm。显微镜分为直筒式或斜筒式，有单筒式的也有双筒式的。 (4)转换器(Nosepiece):位于镜筒下端，是一个可以旋转的圆盘。有3-4个孔，用于安装不同放大倍数的接物镜。 (5)载物台(Stage):是支持被检标本的平台，呈圆形或方形。中央有孔可透过光线，台上有用来固定标本的夹子和标本移动器。 (6)调焦旋钮:包括粗调焦旋钮(Coarse adjustment knob)和细调焦旋钮(Fine adjustment knob)，是调节镜筒或载物台上下移动的装置。 2.光学系统 (1)接物镜(Objective lens)，常称为镜头，简称为物镜，是显微镜中最重要的部分，由许多快透镜组成。其作用是将标本上的待检物进行放大，形成一个倒立的实像，一般显微镜有3-4个物镜，根据使用方法的差异可分为干燥系和 油浸系两组。干燥系物镜包括低倍物镜(4-10X)和高倍物镜(40-45X)，使用时物镜与标本之间的介质是空气;油浸系物镜(90-100X)在使用时物镜和标本之间加有一种折射率与玻璃折射率几乎相等的油类物质(如香柏油)作为介质，在物镜上经常标有两组数字(图1-2)。 (2)接目镜(Eyepiece lens):通常称为目镜，一般由2-3块透镜组成。其作用是将由物镜所造成的实像进一步放大，并形成虚像而反映于眼帘。目镜上也刻有表示放大倍数的标志，如8X、10X、16X，一般显微镜的目镜是10X，小于10X的目镜用得不多。 (3)聚光镜(Condenser)位于载物台的下方，有两个或几个透镜组成，其作用是将由光源来的光线聚成一个锥形光柱。聚光器可以通过位于载物台下方的聚光器调节旋钮进行上下调节，以求得最适光度。聚光器还附有虹彩光圈(Iris diaphragm)，借此调节锥形光柱的角度和大小，以控制进入物镜的光的量。 (4)反光镜:反光镜是一个双面镜，一面是平面，另一面是凹面。起着把外来光线变成平行光线进入聚光镜的作用。使用内光源的显微镜就不需反光镜。 (5)光源:日光和灯光均可，以灯光较好，其光色和光强都比较容易控制，有的显微镜采用装在底座内的内光源。 (二)显微镜的成像原理 显微镜的放大作用是由物镜和目镜共同完成的。标本S经物镜L放大后，O在目镜L的焦平面上形成一个倒立的实像I，再经目镜L的进一步放大形成一E1E 虚像I，被人的眼睛E所观察到(图1-3)。 2 (三)显微镜的性能 1.分辨力和数值口径 显微镜的分辨力(Resolving power)是指显微镜将样品中相互接近的两点清晰的分辨出来的能力。它主要取决于物镜的分辨率，物镜的分辨率是所用光的波长和物镜的数值口径的函数。分辨力用镜头所能分辨出的两点间最小距离表示，距离越小分辨能力越好，其关系如下: D=λ/(2 N.A) 其中λ-入射光的波长 N.A -物镜的数值口径 D-显微镜的分辨率 从式中可见，减少入射光的波长可以提高分辨能力，但由于可见光波长范围比较窄(约为0.38-0.77μm)，利用紫外光源只适用于显微摄影而不能用于直接观察。因此提高分辨率的最好方法是增加数值口径。 物镜的数值口径(Numberical aperture)简写为(N.A):表示从聚光器发出的锥形光柱照射在观察的标本上，能被物镜所聚集的量。它由下式决定: N.A=n?sinθ 式中n-标本和物镜之间介质的折射率 θ-由光源投射到透镜上的光线和光轴之间的最大夹角(图1-4)。 光线投射到物镜的角度越大，数值口径就越大。该角度的大小取决于物镜的直径和焦距。以空气为介质时(n=1.00)，数值口径不超过1，如果采用一些高折射率的物质作介质，如使用油镜时采用香柏油作介质，则数值口径增大，从而提高分辨能力。各种物质的折射率见表(1-1)。 表1-1 介质 空气 水 石蜡油 香柏油 玻璃 香脂 溴化萘 折射率(21?) 1.00 1.33 1.46 1.51 1.52 1.53 1.60 物镜上标有数值口径。低倍镜(10X)为0.25，高倍镜(40X)为0.65，油浸镜(100X)为1.25。 这些数值是在其他条件都适宜的情况下的最高值，实际使用时往往低于所标的值。 聚光镜也有一定的数值口径。常用的阿贝聚光器的N.A值是1.25，有的可达1.40。在聚光器和标本之间加香柏油，也能将数值口径提高。聚光器的N.A可用虹彩光圈来调节，此值和所用的物镜的N.A值相配合，最好是等于或稍大于物镜的N.A值，以便使进入物镜的光柱的角度达到正好能够均匀照满物镜背面透镜的程度。 2.放大倍数、焦距和工作距离 显微镜的放大倍数是物镜放大倍数和目镜放大倍数的乘积。放大倍数一样时，由于物镜和目镜搭配不同，其分辨力也不同。如数值口径大的40X物镜和5X的目镜相搭配，其分辨率比数值口径小的10X物镜和20X目镜相搭配时要高些。一般说，增加放大倍数应该是尽量用放大倍数高的物镜。物镜的放大倍数越大焦距就越短，物镜和样品之间距离(工作距离)便缩短。在观察时必须注意防止损坏样品或透镜。 (四)显微镜的使用指南 (1)移动显微镜时，要一手握持镜臂，一手托着镜座。 (2)使用时，应通过调整凳子高度，以便能舒适地观察，勿将显微镜倾斜。 (3)在观察标本时，应两眼同时睁开，这样既能同时绘图，又能减少疲劳。 (4)调焦应细心，应采取将物镜调离标本的方法。 (5)用低倍镜时，光圈要适当缩小，以获得较好的对比度。随着放大倍数的增大，所需要光的量也要加大。 (6)镜检时，应首先用低倍镜进行调焦，再换高倍镜，最后用油浸镜进行观察。 (7)保持载物台清洁、无油。除油浸镜外，其他物镜不得接触香柏油。 (8)所有透镜应保持清洁，只能用擦镜纸擦拭镜头，不得用手触摸透镜。 (9)结束后，取下标本片，将油浸镜上的浸油擦拭干净，盖上防尘罩放回箱中。 (10)显微镜发生故障，应及时向指导老师汇报，未经同意，不得随便更换显微镜。 (五)操作步骤 (1)将显微镜平稳地置于实验台上，使其与镜检者间的距离适中，镜检者姿势要端正，一般用左眼观察，右眼用于绘图或记录。 (2)采光:直射的阳光光线过强，会影响物象的清晰，刺激眼睛，反射热会损坏光学装置。一般以间接日光为宜。采用白炽灯为光源时，应在聚光镜下加一蓝色滤光片，除去黄色光。 转动反光镜，使光线集中于聚光器。升降聚光器和调节光圈，以获得合适的光量。用低倍镜观察时，应下降聚光器，缩小光圈;如为染色标本，用高倍镜或油浸镜观察时，应上升聚光器，扩大光圈，以获得最大的光量。 (3)固定标本:将标本固定在载物台上，将预检部位移至物镜正下方。 (4)待检标本须先用低倍镜观察，因低倍镜视野较大，易发现目标和确定观察的位置。转动转换器，将低倍镜转入光路，在转动粗调焦旋钮，使镜筒下降至物镜与标本片之间距离小于工作距离，调节聚光器和光圈，以获得合适的光量，由目镜观察同时用粗调焦旋钮慢慢的升起镜筒，直至物象在视野中出现后，再用细调焦旋钮调节至物象清晰为止，绘图记录，或将合适的目的物移至视野中心，准备用高倍镜观察。 (5)高倍镜观察:显微镜的所有物镜一般是共焦点的，因此用低倍镜对准焦点后将高倍镜转入光路，基本上也是对焦点的，只要稍转动细调焦旋钮即可获得清晰图像。勿忘调节光量。有些简易的显微镜不是共焦点的，或者由于物镜的更换而不能达到共焦点，就要采取上述调焦方法，待获得清晰物象后，观察绘图记录或继续用油浸镜观察。 (6)油浸镜观察:具体操作方法见实验五。 (7)显微镜使用完毕，取下标本片，用绸布擦净显微镜的金属部件，用擦镜纸擦拭镜头。 (8)将各部分复原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成八字形，将镜筒下降至最低位置，同时把聚光器降下。以免与物镜相碰。 (9)罩上显微镜防尘套，将显微镜放回箱中。 四、实验内容 (1)根据讲义内容，对照实物熟悉显微镜的构造。 (2)按显微镜的使用方法，分别用低倍镜和高倍镜对酵母菌示教标本进行 观察。 五、思考题 (1)哪个物镜的工作距离最短,哪个最大, (2)哪些部件控制着到达物镜的光量, (3)有哪些方法可以提高显微镜的分辨力, (4)为什么在高倍镜和油浸镜观察标本之前要先用低倍镜观察, 实验二、酵母菌细胞形态观察、死活细胞的染色鉴别 一、目的要求 1.通过观察了解酵母细胞的形态结构。 2.掌握鉴别酵母细胞死活的染色方法。 二、实验材料 1.菌种:酵母菌菌悬液 2.染料:0.1%的美兰染色液 3.其他:显微镜、载玻片、盖玻片、滴管、擦镜纸、吸水纸等。 三、基本原理 酵母菌细胞较大，不必染色即可用显微镜观察其形态。 用美兰染色液可对酵母细胞进行死活细胞染色鉴别。美兰是一种弱氧化剂，氧化态呈蓝色，还原态呈无色。活的酵母细胞，因新陈代谢的不断进行，具有一定的还原能力，能将进入细胞的美兰还原，而细胞不被染色。因此，用美兰对酵母细胞染色一定时间后，无色的为活细胞，呈蓝色的则为死亡细胞。需要注意的是，一个活酵母菌的还原能力是一定的，必须严格控制染料的浓度和染色时间。 四、方法与步骤 1.酵母菌细胞形态的观察 取洁净的载玻片一块，用滴管取酵母悬浊液滴于载玻片中央，取盖玻片一块，小心的将盖玻片一端与菌液接触，然后缓慢的将盖玻片放下，以避免产生气泡。至此，一片酵母菌水浸标本就制成了。(如图2-1) 先用低倍镜观察，再用高倍镜观察。观察时注意酵母细胞的形状及出芽情况。 2.死活酵母细胞的染色鉴别 取0.1%美兰液一滴，滴在一块洁净的载玻片中央，加一滴酵母菌悬液，混合均匀，染色3-5分钟后加盖玻片制成水浸标本片，镜检。 五、实验内容 1.制片观察所给酵母菌的细胞形态。 2.用美兰液对酵母菌死活细胞进行染色鉴别。 六、实验结果与思考题 1.绘图表示所观察的酵母，注明菌名和放大倍数。 2.用美兰对酵母菌死活细胞进行染色鉴别时，为什么要控制染料的浓度和染色时间, 实验三、酵母菌细胞大小的测定 一、目的要求 了解测量微生物大小的原理，学习并掌握接目测微计的校正方法及微生物大小的测定方法。 二、材料 菌种:啤酒酵母菌悬液 1. 2.其他:显微镜、接目测微计、镜台测微计、载玻片、盖玻片。 三、基本原理 微生物细胞个体较小，其大小的测量一般是在显微镜下用专用的测量工具—接目测微计来进行。 接目测微计是一块圆形玻片，其中央刻有精确的等分线。测量时，将其放入目镜的隔板上，也有专用的目镜，里面已安放好接目测微计。由于接目测微计所测量的是微生物经过显微镜放大后所成像的大小，而接目测微计每一小格所代表的实际长度随目镜和物镜的放大倍数而改变，所以，在测量前必须用镜台测微计对接目测微计进行校订，确定此时接目测微计每小格所代表的实际长度，镜台测微计是中央部分刻有精确等分线的载玻片。刻度总长为1mm，被等分成100格，每小格长是1μm，镜台测微计专用于对接目测微计进行标定。 四、方法和步骤 1.接目测微计的标定 (1)取出目镜，旋开其上的透镜，将接目测微计放在目镜的光阑上(有刻度一面向下)，然后旋上透镜，插入镜筒。 (2)将镜台测微计固定在显微镜的载物台上，使有刻度的一面向上，不可放反。 (3)将低倍镜转入光路，调准焦距后，转动接目测微计，使两个接目测微计的刻度线相平行，调节镜台测微计，使接目测微计的一条刻度线与镜台测微计的一条刻度线相重合，再寻另一重合线(见图3-1)，分别数出其间接目测微计及镜台测微计的格数。计算接目测微计每小格所代表的实际长度。例如:若在两条重合刻度线之间，接目测微计为45格，镜台测微计为10格，那么，此时接目测微计每小格所代表的实际长度=(10格?10μm)/45格=2.2μm。 (4)再以高倍镜按上述方法对接目测微计进行标定。 2.酵母菌细胞大小的测定 取下镜台测微计，换上菌体水浸片。用接目测微计测量菌体细胞的长和宽各占几格，然后计算其实际大小。为了尽量减少实验误差，应在同一标本片上进行测量5-10个菌体，取其平均值作为该菌的大小。 五、实验结果 1.接目测微计校正的结果填入下表 两条重合刻度线之间格数 接目测微计 放大倍数 每小格代表的 目镜?物镜 接目测微计 镜台测微计 实际长度(μm) 10?10 10?40 16?10 16?40 2.将酵母菌细胞大小值填入下表 细胞序号 长(μm) 宽(μm) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均值 六、思考题 为什么随着显微镜放大倍数的改变，接目测微计每格代表的实际长度也会改 变,你能找出这种变化的规律吗, 实验四、酵母菌细胞总数及出芽率的测定 一、目的要求 了解血球计数板的构造，掌握利用血球计数板进行微生物计数的方法。 二、材料 1.菌种:啤酒酵母菌悬液 2.其他:显微镜、血球计数板、滴管、吸水纸、擦镜纸 三、基本原理 利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数法。此法是将经过适当稀释的菌体细胞或孢子悬液，注入血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数的。由于加盖盖玻片之后的血球计数板的计数室的容积是一定的，所以可根据在显微镜下观察到的菌数或孢子数换算成单位体积试样中的菌数。此法所计得数值为死菌与活菌的总和，故又称为总菌计数法。 血球计数板由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成(见图4-1)，玻片上有4条凹槽，构成三个平台，中间的平台较宽，其中央又被一短槽分割成两半，每个半边上面各刻有一个方格网。每个方格网被划分为九个大格，其中央大格再划分为若干中格，每个中格的四周刻有双线，作为中格的界限，在显微镜下便于区分。中央大格又称为计数室，微生物计数就在此计数室中进行。 计数室的规格有两种:目前常用的是25?16型，其计数室被分成25个中方格，每一中方格又分成16个小方格。另一种是16?25型，其计数室被分成16个中方格，每一中方格又分成25个小方格。无论哪种规格，计数室的小方格数都是相同的，即16?25=400个小方格。 2中央大格的边长为1mm，面积为1mm，计数室与盖玻片间的深度为0.1mm， 3所以计数室的体积为0.1mm。 计数时，如用25?16型计数板，通常数对角线上的5个中方格(即左上、右上、左下、右下、中央共80个小方格)的细胞总数。如用16?25型的计数板，通常数对角线上的4个中方格(即左上、右上、左下、右下共100个小方格)的细胞总数，然后根据下列公式求得菌液的浓度: 25?16型: 细胞总数/ml=(80小方格内的菌数/80)?400?1000?10?稀释倍数 16?25型: 细胞总数/ml=(100小方格内的菌数/100)?400?1000?10?稀释倍数 三、方法与步骤 1.取一块洁净的血球计数板，在计数室上面加盖一块专用的厚盖玻片。 2.用滴管吸取菌悬液滴于盖玻片的边缘，让菌液靠毛细作用渗入计数室，注意不能有气泡产生。将计数板置显微镜的载物台上，静止5min，使细胞全部沉 降到计数板的表面。 3.分别统计5个中方格(25?16型)或4个中方格(16?25型)中酵母菌细胞总数及芽体数。酵母菌的芽在未脱离母细胞前，若已达母细胞的1/2大小，则不作为芽体，而作为成熟的细胞计数。 在计数时，若遇到位于中方格间线上的细胞，一般是只统计位于右线及上线上的细胞。为了尽量减少实验误差，应注意以下两点: ?一般以每个小方格中平均4-6个细胞为宜，过多时应对样品进行稀释。 ?对同一样品要重复计数两次，取其平均值;若两次统计数据相差太多，则应重复计数。 4.使用完毕后，应将计数板用清水清洗干净(绝对不能用硬物洗刷)，待自行晾干或用电吹风吹干后装入盒中。 五、实验结果 将实验结果填入下表 5个或4个中方格中 菌液浓度 重复实验 稀释倍数 出芽率(%) (个/ml) 酵母菌总数 芽体总数 1 2 平均值 六、思考题 1.为什么计数室内不能有气泡,试分析产生气泡的原因。 2.试分析影响本实验结果的误差来源及提出改进。 3.能不能用血球计数板在油浸镜下对细胞计数,为什么, 实验五、显微镜油浸镜的使用方法 一、 目的要求 1. 熟练掌握低倍镜和高倍镜的使用技术 2. 掌握油浸镜的使用技术及观察细菌形态的基本方法。 二、 实验材料 1.菌种:细菌染色标本。 2.其他:显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸等。 三、基本原理 根据显微镜物镜与载玻片之间的介质的不同，可将物镜分为两组，即干燥系物镜和油浸系物镜。进口显微镜的油镜标有一黑圈“?I”或“HI”等字样，国产显微镜的油镜多以一红黑或一白黑表示。在油浸系中，载玻片与镜头之间多用香柏油作介质，因香柏油的折射率(n=1.51)与玻璃的折射率(n=1.52)几乎相等，故透过载玻片的光线通过香柏油后，直接进入物镜，而不发生折射。与干燥系物镜相比，油浸镜的数值口径N.A值较大，分辨力较高。两组物镜光线通路的区别如图5-1所示。 细菌是单细胞原核微生物，形体很小，大多直径或宽度小于1μm，必须借助于油浸镜方能观察清楚。 四、方法与步骤 1.将细菌染色标本放在显微镜的载物台上，先通过低倍镜和高倍镜观察，将待检部位(即细菌较分散的部分)移至视野中央。 2.升高镜筒，将油镜转入光路。 3.将聚光器上升至最高点，并适当开放光圈，以获得较强的光线。 4.在标本片的待检部位，滴加一滴香柏油。 5.从侧面注视，用粗调旋钮将镜筒小心缓慢地降下，使镜头浸润在香柏油内。 6.从目镜观察，用粗调节旋钮上升镜筒，直至视野内出现物象，再用细调节旋钮较准焦距至物象清晰为止。 如果油浸镜已离开油面仍未见物像，则应重复上述操作，至看到物象为止。 为了充分发挥油镜的分辨力，也可在聚光器与载玻片之间滴加香柏油，使由聚光器射出的光不受折射而直接进入物镜。 7.观察完后，将镜筒升起，取下标本片，用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾取少量的二甲苯，擦去镜头上的残余油渍。再用擦镜纸擦去二甲苯。二甲苯能渗入物镜，溶解胶粘透镜的物质而损坏镜头。 8.使用完毕，用洁净的绸布把显微镜各部位擦拭干净，放入箱中。 五、实验内容 用油浸镜观察所给的细菌染色标本，记录各菌特征。 六、实验作业 1.绘出所观察到的细菌形态图，注明菌名，放大倍数。 2.在使用油镜时，应特别注意什么问题, 3.对同一微生物制片，用油镜观察比用低倍镜观察有何优、缺点, 实验六、细菌的涂片及简单染色法 一、目的要求 掌握细菌的涂片和简单染色技术。 二、材料 1.菌种:大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌。 2.染料:吕氏美兰、番红 3.其他:显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、生理盐水、香柏油、二甲苯 三、基本原理 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能清楚的观察到其形态和结构。 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合，因细菌蛋白质的等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性溶液中时，常常带负电荷，所以通常采用碱性染料(如美兰、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质相结合，当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物，又称复合染料。如伊红美兰、伊红天青等。 简单染色法即只用一种染料使细菌着色。此法虽手续简便，但一般只能显示其形态，不能辨别其构造。 染色前必须先固定细菌。其目的有三:一是杀死细菌，固定其细胞结构。二是保证菌体能牢固地黏附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉。三是改变菌体对染料的通透性。一般死细胞原生质容易着色。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。 四、方法与步骤 1.涂片:在洁净无油渍的载玻片中央滴一小滴生理盐水，用无菌操作(见 2图6-1)挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜，涂布面积约1cm。 2.干燥:涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使其干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心的在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿仅靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。 3.固定:涂片面朝上，在酒精灯火焰外层快速地来回通过3-4次，共约3-4秒。要求玻片温度不超过60?(用手背触涂片反面，以不烫手为宜)。待玻片冷却后再加染料。 4.染色:在已固定的涂片上加适量染色液，以盖满菌膜为度，染色1-3min。 5.水洗:倾去染色液，用细流水冲洗涂片的背面，直至流下的水无染色液 的颜色为止。 6.干燥:自然干燥，也可用吸水纸轻轻吸取水分(注意勿擦去菌体)。或微微加热，以加快干燥速度。 7.镜检:以低倍镜找到着色良好的部位，再用油浸镜观察。 五、实验结果 绘出大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图，注明放大倍数、染色方法及观察到的颜色。 六、注意事项 1.玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。 2.挑菌量宜少，涂片宜薄，厚则不易观察。 七、思考题 涂片为什么要固定,固定时应注意什么问题, 实验七、细菌的革兰氏染色法 一、目的要求 学习并掌握革兰氏染色的方法。 二、实验材料 1.菌种:枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。 2.染料:草酸铵结晶紫液、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液。 3.其他:显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌生理盐水、香柏油、二甲苯等。 三、基本原理 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。1884年由丹麦医师Gram创立。 细菌先经碱性染料结晶紫染色，再经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌紫色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫 +-做革兰氏阳性菌(G)，后者为革兰氏阴性菌(G)。为观察方便，脱色后再用一种红色染料，如碱性番红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。有芽孢的杆菌和绝大多数球菌，以及所有的放线菌和真菌都成革兰氏正反应;弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都成负反应。 革兰式阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度低，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。另外，与细菌细胞壁的化学组成及结构有关。革兰氏阳性细菌由于细胞壁肽聚糖含量高，脂类含量低，乙醇处理使细胞壁脱水，肽聚糖层孔径变小，通透性降低，结晶紫碘复合物被保留在细胞内，细胞不被脱色。革兰氏阴性菌细胞壁脂类物质含量高，肽聚糖含量较低，乙醇溶解了脂类物质，使细胞壁通透性增加，结晶紫——碘复合物易被抽出，于是被脱色。 再有阳性菌菌体等电点较阴性菌低，在相同pH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料较多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。 四、方法与步骤 操作过程如下:涂片?干燥?固定?草酸铵结晶紫染色(1min)?水洗?路哥氏碘液媒染(1min)?水洗?95%乙醇脱色(30s)?水洗?番红复染(1min)?水洗?干燥?镜检。 革兰氏染色的关键在于严格掌握乙醇脱色程度，如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌;而脱色不够时，阴性菌被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间很长，或已死亡及部分自行溶解了，都常呈阴性反应。 五、实验内容 1.对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌分别进行革兰氏染色。 2.对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌混合涂片进行革兰氏染色。 六、实验作业 1.绘出大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的形态图，注明放大倍数及颜色。 2.为什么革兰氏染色所用细菌的菌龄一般不能超过24小时, 3.你的实验结果与课本中所述是否一致,如果不一致，试分析原因。 4.当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样才能确保你的操作正确，结果可靠, 实验八、细菌芽孢染色法 一、目的要求 掌握细菌的芽孢染色法。 二、材料 1.菌种:枯草芽孢杆菌。 2.染料:5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液。 3.其他:显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、生理盐水、香柏油、二甲苯。 三、基本原理 细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色。若用一般的染色法只能使菌体着色而芽孢不着色(芽孢呈无色透明状)。芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽孢染色法都基于同一个原则:除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色，再使菌体脱色，而芽孢上的染料难以渗出，故保留原有的颜色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现不同的颜色，因而能明显衬托出芽孢，便于观察。 四、方法和步骤 1.将培养了24小时左右的枯草芽孢杆菌作涂片、干燥、固定。 2.将孔雀绿染色液加3-5滴于已固定的涂片上。 3.用试管夹夹住载玻片在火焰上加热，使染料冒蒸汽(但不沸腾)，切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。加热时间从冒蒸汽时开始计算约5-7分钟。 4.倾去染色液，等玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。 5.用番红染色液复染1-3分钟。 6.水洗、吸干。 7.镜检:用油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。 五、实验结果 如实地、按比例地绘图说明枯草芽孢杆菌菌体的形状、芽孢的形状及其着生位置。 实验九、霉菌的形态观察 一、目的要求 学习霉菌的标本制备方法，观察根霉、毛霉、青霉、曲霉的形态构造。 二、实验材料 1.菌种:根霉、毛霉、青霉、曲霉平板。 2.染料:乳酸石炭酸棉蓝液。 3.其他:显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、解剖针、培养皿、玻璃棒、滤纸、20%甘油。 三、基本原理 霉菌菌丝较粗大，细胞容易收缩变形，孢子容易飞散，在制备霉菌标本时，常用乳酸石炭酸溶液作为介质，具有不使细胞变形，可杀菌防腐，不易干燥，能保持较长时间等优点。若加入棉蓝，又具有一定染色效果。 霉菌的有些结构在制片过程中易被破坏，影响观察，可采用载片培养法。此法便于直接在显微镜下观察，尤其适用于根霉的假根，曲霉的足细胞及分生孢子链等结构的着生和生长情况的观察。并且还可在同一标本上观察到微生物发育的不同阶段的形态。 四、方法和步骤 1.一般观察法:加一滴乳酸石炭酸棉蓝液于洁净的载玻片中央，用解剖针从菌落的边缘处挑取少量带有孢子的菌丝，放入乳酸石炭酸棉蓝液中，再细心地把菌丝挑散开，加盖玻片，注意不要有气泡产生。置于显微镜下观察，菌丝呈蓝色，颜色的深度随菌龄的增加而减弱。 观察根霉时，注意观察其菌丝(无横隔)、假根、孢子囊柄(与假根相对着生)、孢子囊、囊轴、囊托、孢子囊孢子及厚垣孢子。 观察毛霉时，注意观察其菌丝(无横隔)，孢子囊柄、囊轴、孢子囊孢子及厚垣孢子。 观察曲霉时，注意观察其菌丝(有横隔)，足细胞、分生孢子梗、顶囊、小梗(形状、层数及在顶囊上的着生情况)，分生孢子的着生情况。 观察青霉时，注意观察其菌丝(有横隔)，分子孢子梗、帚状枝(小梗的轮数及对称性)，分生孢子的着生情况。 2.载片培养法: (1)湿室准备:在培养皿底部先放一张圆形滤纸，在滤纸上依次放上“Z”形玻璃棒、载玻片和盖玻片(两片)，盖上培养皿盖，用纸包扎好，高压(9.8 4?10Pa)灭菌20分钟。 (2)用接种环挑取少量霉菌孢子，置于湿室的载玻片中央，用无菌滴管滴加少量冷却至45?左右的察氏培养基。 (3)将镊子在火焰上灼烧灭菌后，取无菌盖玻片盖在培养基上，然后轻轻压一下。用滴管取融化的石蜡将盖玻片三边密封，如图9-1(1)所示。 (4)将3-5ml 20%甘油倒于湿室内，以保持湿度，在培养皿上写上菌名、日期、姓名。将制备好的载玻片放入湿室内，盖上皿盖(如图9-1(2))，置于28?恒温箱中培养2天。 (5)将培养好的载玻片取出，置于显微镜下观察。 五、实验内容 1.观察根霉、毛霉、青霉及曲霉的外观形态，并制片观察其形态结构。 2.对根霉、青霉、曲霉作载片培养，观察其形态构造。 六、实验作业 1.绘出所观察到的各种霉菌的形态图，注明各种结构的名称。 2.列表比较根霉、毛霉、青霉、曲霉形态结构及繁殖方式的异同点。 3.为什么在实验室的一般培养条件下难以观察到霉菌的有性孢子, 实验十、放线菌的形态观察 一、目的要求 学会放线菌制片方法，观察其形态特征。 二、实验材料 1.菌种:泾阳链霉菌(5406) 2.染料:石炭酸复红染液，吕氏美兰液。 3.其他:显微镜、载玻片、接种针等。 三、基本原理 放线菌是单细胞原核微生物，其菌落在培养基上着生牢固，不易被接种针挑取，由于孢子的存在，常使菌落表面呈粉末状。放线菌由纤细的丝状细胞组成菌丝体，菌丝内无隔膜。菌丝体分为两部分，即潜入培养基中的营养菌丝和由营养菌丝向上生长生成的气生菌丝。气生菌丝上部分化成孢子丝，呈螺旋状、波浪状或分支状等，其着生形式有丛生、互生和轮生三种。菌丝有各种颜色，有的还能分泌水溶性色素到培养基内。孢子的表面光滑或粗糙、圆或椭圆，孢子有各种颜色，这些形态特征都是鉴定放线菌的重要依据。放线菌菌丝的宽度与细菌类似，必须染色后才能进行观察。 四、操作步骤 1.营养菌丝的观察 (1)用接种铲连同培养基挑取5406菌菌苔置载玻片中央。 (2)用另一载玻片将其压碎，弃去培养基，制成涂片，干燥固定。 (3)用美兰或石炭酸复红染色液染色半分钟到一分钟，水洗。 (4)干燥后，用油镜观察营养菌丝的形态。 2.气生菌丝、孢子丝及孢子的观察 (1)将培养3-4天的5406放线菌的培养皿打开，放在显微镜低倍镜下寻找菌落的边缘，直接观察气生菌丝和孢子丝的形态(分支情况、卷曲情况等)。 (2)取洁净的盖玻片一块，在菌落上面轻轻按压一下，然后将印有痕迹的一面朝下，放在滴有一滴美兰染液的载玻片上，将孢子等印浸在染色液中，制成印片，用油镜观察孢子的形态、孢子丝等。 (3)去干净载玻片一片，在玻片中央加一小滴加拿大树胶，使树胶摊成一薄层，放置数分钟，使略微晾干(但不要过分干燥)。然后用小刀取5406菌培养体一块(带培养基切下)。将培养体表面贴在涂有树胶的玻片上，用另一玻片轻轻按压(不要压碎)，然后将放线菌培养体小心弃去，注意不要使培养体在玻片上滑动，否则印痕模糊不清。将制好的印片通过火焰固定，用石炭酸复红染液染色1min，水洗晾干(不能用吸水纸吸干)。用油镜观察孢子丝的形态及孢子排列情况。 五、实验内容 按上述方法制片观察5406菌的营养菌丝、气生菌丝、孢子丝、孢子链及孢子的形态。 六、实验作业 1.将观察结果绘图，并注明各部分名称。 2.比较各种方法的优缺点;在何种情况下，适宜用何种制片方法来观察，效果最好, 3.放线菌的菌体为何不易挑取, 实验十一、酵母菌子囊孢子的培养及染色观察 一、目的要求 1.掌握酵母菌产生子囊孢子的特殊方法 2.学会子囊孢子的染色方法 二、材料 1.菌种:啤酒酵母2399 2.染料:石炭酸番红液、酸性酒精、美兰液 3.培养基:醋酸钠琼脂斜面，麦汁液体培养基 4.其他:显微镜、载玻片、接种环、无菌带凹穴石膏块、生理盐水等 三、基本原理 子囊孢子的生成应具有下列条件: 1.供试验的酵母需营养好，活力旺盛。 2.培养时，需接触大量空气，促进细胞氧化作用，使其剧烈老熟而进入休眠状态。 3.不能有充分的营养，需处于饥饿状态。 子囊孢子用普通的染色方法难以着色，应先用石炭酸番红液在加热的情况下染色，染料不仅可以进入子囊，也可进入子囊孢子。当用酸性酒精脱色时，进入子囊的染料被脱色，而子囊孢子应保持红色，用美兰液复染后，孢子呈红色，而菌体呈蓝色。 四、方法与步骤 1.子囊孢子的培养 (1)在无菌培养皿内放置灭过菌的石膏块，并在石膏块外注入1.5Bx稀释麦汁，以浸没石膏块高度一半为宜。向石膏块的凹穴内加2-3滴无菌水。 (2)在经48h麦汁培养的菌液，倾去上清液，将沉淀于底部的菌体接入石膏块的凹穴内，盖上皿盖。 (3)于25-28?培养5-8天后镜检。 2.醋酸钠琼脂培养法 (1)将斜面菌种接入麦汁三角瓶，摇床培养24h，离心分离，洗涤后得到菌株。 (2)将菌体大量涂布于醋酸钠琼脂斜面上，于25-28?培养3天以上即可产生子囊孢子。 3.子囊孢子的染色观察 (1)滴一滴蒸馏水于洁净的载玻片上，加菌体，涂片固定。 (2)滴加石炭酸番红液，在火焰上方加热约5min，至冒气为止。必要时可补加染料，冷却后，水洗。 (3)加酸性酒精脱色30s，水洗。 (4)加美兰液复染1min，水洗，干燥后镜检。 五、实验内容 1.分别用上述两种培养法培养啤酒酵母2399，使之产生子囊孢子。 2.对子囊孢子和子囊进行染色观察。 六、实验作业 1.绘图说明实验结果。 2.如果不产生子囊孢子，试分析其原因。 实验十二、假丝酵母假菌丝的培养及观察 一、目的要求 掌握假菌丝的培养及其形态观察的方法。 二、实验材料 1.菌种:热带假丝酵母 2.培养基:玉米粉琼脂培养基，马铃薯浸出汁琼脂培养基 3.其他:显微镜、培养皿、盖玻片、凹玻片、接种环、固体石蜡、镊子等 三、基本原理 假菌丝的生成与培养基的种类、培养条件等因素有关。一般在厌氧条件下，在马铃薯浸出汁或玉米粉琼脂培养基上较容易形成。 四、方法与步骤 1.平板培养法 取新鲜的酵母菌在薄层培养基平板上划线接种2-3条，取无菌盖玻片盖在接种线上，于25-28?培养4-5天后打开皿盖，置于显微镜下直接观察划线的两侧所形成的假菌丝的形状。 2.凹玻片培养法 (1)将洁净的凹玻片和18?18mm盖玻片各一块放在一只培养皿中，灭菌 4(9.8?10Pa，20min)后，在干燥箱内烘干。 (2)将已融化的培养基用无菌滴管滴加在盖玻片的中央，凝固后，用接种环从斜面上取菌种，点接在培养基表面，将接种面盖入凹玻片的凹穴内，盖玻片四周用融化的石蜡封固，于25-28?培养4-5天。镜检，观察假菌丝的形状。 五、实验内容 分别用两种方法、两种培养基培养，并观察热带假丝酵母的假菌丝。 六、实验作业 1.绘图并记录实验结果。 2.试述假菌丝与真菌丝的区别。 实验十三、培养基的配制及灭菌 一、目的要求 1.掌握培养基的配制方法。 2.掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的操作方法。 二、材料 根据实验需要确定。 三、基本原理 培养基是人工配制的适合于微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等。并需调整在一定的酸碱度范围之内。 灭菌是指杀死一定环境中所有微生物。微生物实验室常用的灭菌方法包括直接灼烧、恒温干燥箱灭菌、高压蒸汽灭菌、间歇灭菌、煮沸灭菌等方法。这些方法的基本原理是通过加热使微生物体内的蛋白质凝固变性，从而达到杀菌的目的。 四、方法和步骤 1.培养基的配制 (1)称药品:取少于总量的水于烧杯中，称取培养基成分(琼脂除外)，逐一加入水中。对于牛肉膏、酵母膏等原料，在称量后要连同称量纸一起投入水中，待原料被洗下后，再将称量纸取出。 (2)加热溶解:将烧杯放在石棉网上，用文火加热，并不断搅拌，待各药品完全溶解后再补充水分至所需容量。 (3)调节pH:培养基的酸碱度可用精密pH试纸或酸度计等进行测定。调整可用10%NaOH或10%HCl溶液进行，调整时应避免调整过头再回调，因为这样容易影响培养基的体积和渗透压。 (4)过滤:液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基则可用4层纱布趁热过滤。但是供一般使用的培养基，这步可省略。 (5)分装: A(分装三角瓶:将液体培养基倒入三角瓶中，其装量以不超过三角瓶总容量的3/5为宜，然后每瓶中加入1.5-2.5%的琼脂(视培养基的要求和琼脂的质量而定)，用这种方法可使融化琼脂和灭菌同步进行，以节省融化琼脂的时间。另一种方法是先称取琼脂于液体培养基中，待烧杯内的琼脂完全融化后再分装三角瓶。 B(分装试管:将融化的固体培养基趁热加至漏斗上(装置见图13-1)。分装时左手并排地拿数根试管，右手控制弹簧夹开关，将培养基依次加入各试管。用于制作斜面培养基时，装量不超过试管高度的1/5。分装时谨防培养基沾在管 口上，以免使棉塞沾上培养基而造成染菌。 (6)加棉塞:试管口和三角瓶口塞上用普通棉花制作的棉塞，棉塞的形状、大小和松紧要合适，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。加塞时应使棉塞总长的3/5塞入试管口或瓶口内，以防止棉塞脱落。若三角瓶口较大，而棉花纤维又短，则可在制好的棉塞外包一层纱布，这样的棉塞既耐用又便于操作。 (7)包扎:在棉塞外包一层牛皮纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把试管扎成捆后，再于棉塞外包一层牛皮纸，然后贴上标签，注上培养基名称、日期及组别后进行灭菌。 2.灭菌(高压蒸汽灭菌锅的操作过程) (1)使用前先在灭菌锅内加入适量的水，然后把要灭菌的物品放入锅内，盖上锅盖，对称的拧紧螺栓，以防漏气。 (2)在灭菌锅底部加热，同时打开排气阀，待自排气阀冒热气3-5min后关闭。至压力表所示压力升至所需压力时开始计时。通过调整热源而维持一定的压力。达到灭菌时间后停止加热。 (3)待锅内蒸汽全部排完后，方可打开排气阀打开锅盖，取出灭菌物。如需制成斜面，则最好待试管内培养基降至50-60?时再摆。摆得过早会产生过多的冷凝水(见图13-2)。 特别应注意的是，如不待压力降至零点，便打开排气阀或锅盖，轻则会使容器内的培养基因突然减压而剧烈沸腾，沾污棉塞，重则会造成严重的人身伤亡事故。 (4)使用完毕后，应及时将锅内的水放出，以防生锈。 高压蒸汽灭菌锅种类和规格很多，以上操作步骤适用于手提式高压蒸汽灭菌锅。其他种类的灭菌锅在使用时应严格按操作说明书操作。 附录: 恒温干燥箱灭菌的操作过程: (1)把要灭菌的物品放在箱内，堆积时要留有空隙，勿使接触器壁、铁壳，关闭箱门。 (2)接通电源，把位于箱顶的通气口适当打开，使箱内湿空气能溢出，至箱内温度达到100?时关闭。 (3)调节温度控制器旋钮，直至箱内温度达到所需要的温度为止。观察温度是否恒定。若不稳定，再行调节，稳定后不可再拨动调节旋钮和通气孔，保持140-160?，2-3h。 (4)灭菌结束后切断电源，待箱内温度降至60?时，才能打开箱门，取出灭菌物品，同时应将温度调节旋钮调到零点，并打开通气孔。 实验十四、微生物的纯培养技术 一、目的要求 掌握无菌操作的基本环节及各种分离、接种方法。 二、材料 根据实验需要确定 三、基本原理 分离微生物最常用的有三种方法:平板划线法、涂布平板法和倾注平板法。在划线过程中随着接种环在琼脂表面往返划动，微生物细胞从接种环上转移到平板上，可使每个细胞在培养基表面形成一个菌落。平板划线法是目前使用最广泛的一种分离技术。而平板涂布技术和倾注平板法则都是先将样品进行稀释，而后用固体培养基使合适稀释液中的菌体定位。 在微生物的研究工作中，为了使微生物不断延续其生命，需一次次的将其接种到新培养基上。接种操作决不允许不需要的微生物进入培养基而造成污染。将污染降到最低限度的接种技术称为无菌操作技术。它是微生物工作中的一种最重要而又最基本的操作。 四、方法和步骤 1.接种的操作方法 (1)斜面接种: A(操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后，才能点燃酒精灯。 B(用斜面接种时，将菌种管和培养基管握在左手的大拇指和其他四指之间，使斜面向上，并处于水平位置。 C(先将两支试管的棉塞旋转一下，以便于接种时拔出，并把棉塞握住，不得任意放在台子上，或与其他物品相接触，再以火焰烧管口。 D(将上述在火焰上灭过菌的接种环伸入菌种管内，接种环先在试管内壁上或未长菌苔的培养基表面接触一下，使接种环充分冷却，以免烫死菌种。然后用接种环在菌苔上轻轻接触，刮出少许培养物，将接种环自菌种管中抽出，抽出时勿与管壁相碰，也勿使再通过火焰。 E(迅速的将沾有菌种的接种环伸入培养基试管口，在斜面上划线(波浪或直线)，使菌体粘附在培养基上。划线时勿用力，否则会划破培养基表面。 F(将接种环抽出，灼烧管口，塞上棉塞。 G(接种环放回原处前，要经火焰灼烧灭菌，同时需将棉塞进一步塞紧，以免脱落。 以上操作过程参见图14-1。 (2)液体接种: A(由斜面菌种接入液体培养基:基本操作方法与前相同，但使试管口略高 一些，以免培养基流出。接入菌体后，使接种环与管口壁轻轻地研磨使菌体擦下。接好种后，塞上棉塞。将试管在手掌中轻轻敲打，使菌体充分分散。 B(由液体菌种接入培养基平板 菌种为液体时，接种除用接种环外，还可用无菌吸管或滴管。只需在火焰旁拔去棉塞，将试管口通过火焰灭菌，用无菌吸管吸取菌液0.1-0.2ml，注入平板后，用无菌的玻璃棒在平板表面均匀涂布(图14-2)。 (3)穿刺接种: 穿刺接种系把菌种用穿刺的方法接种到固体深层培养基中，此法用于厌氧性细菌接种，或为鉴定细菌时观察生理性能用。 A(操作方法与上相同，但使用的接种针要挺直。 B(将沾有菌种的接种针自培养基中心刺入，直至接近管底，但勿穿透，然后按原穿刺线慢慢拔出(图14-3)。 2.分离的操作方法 (1)平板划线分离: A(倒制平板:将融化的琼脂培养基冷却到45?左右，在酒精灯火焰旁以右手的无名指与小手指夹持棉塞，左手打开打开无菌培养皿的盖的一边，右手持三角瓶向皿里注10-15ml培养基。将培养皿稍加旋转摇动后，置于水平位置待凝。 B(划线分离:在酒精灯火焰上灼烧接种环，待其冷却后，以无菌操作取一环待分离的菌液。 划线时，琼脂平板可放在台子上，也可持在手中(图14-4)。左手握琼脂平板，在火焰附近稍抬起皿盖，右手持接种环伸入皿内，在平板上第一区域“之”字形来回划线。划线时，使接种环与平板表面成30-40度角轻轻接触，以腕力使接种环在琼脂表面作轻快地滑动，勿划破表面。 灼烧接种环，待其冷却后，将手中培养皿旋转70?角，用接种环在划过线的第一区域接触一下，然后在第二区域进行划线，并依次对第三和第四区域进行划线(图14-5)。 划线完毕后，在皿底用记号笔注明样品名称、日期、姓名(或学号)，将整个培养皿倒置放入28-30?恒温培养箱中培养。 48-72小时后，观察并记录单菌落的生长和分布情况。 (2)倾注平板法: -1A(编号:取6支盛有4.5ml无菌水的试管排列于试管架上，依次标上10，-2-3-4-5-610，10，10，10，10字样。 -1B(稀释:以1ml无菌吸管按无菌操作从样品管中吸取0.5ml菌液于10试管 -1-1中，然后用另一吸管在10试管中来回吹吸三次，使其混合均匀，制成10稀释 -1-2-2-3液。再用此吸管从10管中吸取0.5ml稀释液注入10管中，依次制成10，10， -4-5-610，10，10稀释液。 -4-5-6C(加样:用1ml无菌吸管分别吸取10，10，10稀释液1ml注入已编好 -4-5-6号的10，10，10号无菌培养皿中(图14-6)。 D(倾注平板:将融化后冷至45?左右(以手持三角瓶，不觉烫手为宜)的琼脂培养基，向加有稀释液的各培养皿中分别倒入10-15ml，迅速旋转培养皿，使培养基与稀释液充分混合，水平放置，待其凝固后，倒置于28-30?恒温箱中培养。 48-72小时后，观察并记录各平板上菌落生长和分布情况。哪个稀释度最合适, (3)涂布平板法: -4-5-6A(平板制备:制备三套无菌平板，并分别写上10，10，10。 B(稀释:同倾注平板法。 -4-5-6C(加样:用无菌吸管分别吸取10，10，10稀释液0.2ml对号注入编好号的琼脂平板中。 D(涂布:用无菌涂棒在各平板表面进行均匀涂布。待涂布的菌液干后，将培养皿倒置于28-30?恒温箱中培养。 E(48-72小时后，观察并记录菌落生长和分布情况。 五、思考题 1.为什么要把培养皿倒置培养, 2.接种前和接种后为什么要灼烧接种环, 3.为什么要待接种环冷却后才能用其与菌种接触?是否可以将接种环放在台子上待其冷却,你怎样才能知道它是否已经冷却, 附一、无菌操作环节 (1)接种室应保持清洁，用煤酚皂液擦洗台面和墙壁，定期用乳酸或甲醛熏蒸。每次使用前，均应用紫外灯灭菌。定期对接种室作无菌程度的检查。 (2)进入接种室前，应先做好个人卫生工作，在缓冲间内要更换工作鞋帽、工作衣、戴口罩。工作衣、工作鞋、口罩只准在接种室内使用，不准穿到其他地方去，并要定期更换、消毒。 (3)接种的试管、三角瓶等应做好标记，注明培养基、菌种的名称、日期。移入接种室内的所有物品，均须在缓冲间用70%酒精擦拭干净。 (4)接种前，双手用70%酒精或新洁尔灭消毒，操作过程不离开酒精灯火焰，棉塞不乱放;接种工具使用前后均需火焰灭菌。 (5)培养箱应经常清洁消毒。 附二、接种室的消毒方法 1.紫外线灭菌 接种室使用前打开紫外灯照射约30min，就能使空气和室壁表面基本上无菌。为了加强灭菌效果，在开灯以前可以在接种室内喷洒石炭酸溶液，使空气中附有微生物的尘埃降落，并杀死一些微生物。接种室的台面等，可以用2-3%的来苏尔擦洗。 紫外线对人体皮肤，尤其对眼睛具有杀伤力，因此不要直视开着的紫外灯，也不能在开着灯的情况下工作。 2.喷洒石炭酸 将石炭酸水浴，稍热，使之溶解。用吸耳球通过吸管吸取该溶液，配成5%溶液。对于小房间，可用喷雾器由上至下、由里到外顺序进行喷雾，关门，稍等片刻即可使用。石炭酸对皮肤有较强的毒害作用，使用时不要接触皮肤。 3.福尔马林熏蒸 (1)用量:市售福尔马林是37-40%的甲醛水溶液。常用量按每立方米空间2-6ml计算。 (2)熏蒸方法:用福尔马林熏蒸有两种方法: A(加热熏蒸:按熏蒸空间计算，量取甲醛溶液，放在酒精灯上方的小铁桶或烧杯中，点燃酒精灯，关闭室门。酒精灯最好在甲醛蒸发完后即自行熄灭。 B(氧化熏蒸:在一瓷杯里铺一张报纸，放入高锰酸钾(其用量为1/2甲醛量)，再取定量的甲醛溶液，倒在盛有高锰酸钾的容器里，立即关门。几秒后，由高锰酸钾氧化甲醛反应所产生的热将其余的甲醛蒸为气体。 由于甲醛对人眼、鼻有强烈的刺激作用，熏蒸后相当长时间内不能进入室内工作。因此，接种室至少在使用前24h进行熏蒸，房间应密闭，保持12h。之后可取与甲醛等量的氨水，倒在以瓷碗中，放入熏蒸过的接种室内，以减少甲醛对人的刺激作用。用氨水中和，至少应在工作前2h进行。 4.过滤除菌 近几年来，多采用一种称之为超净工作台的接种室，其原理是借助于一鼓风机将普通空气鼓入，通过粗滤、超滤纤维过滤后，进入工作台内的空气即为无菌空气。整个工作室内要求清洁无尘，这样可延长超净工作台的使用寿命。 新的超净工作台使用前，要进行无菌试验，确定合格方可使用。接种前，应先将工作台开启5-6分钟。 附三、接种室无菌程度检查 取无菌的营养琼脂平板，在接种室内台上和台下各放一套。把皿盖打开15min，然后盖好，倒置37?恒温培养24-28h，如果每个皿内菌落不超过4个，则可以认为无菌程度良好，若菌落很多，则应对接种室进一步灭菌。 实验十五、空气中微生物的测定和计数 一、目的要求 1.通过实验了解一定环境空气中微生物的分布情况。 2.学习并掌握检定和计数空气中微生物的基本方法。 二、仪器和材料 盛50ml无菌水的三角瓶，蒸馏水瓶，肉汤蛋白胨培养基，查氏培养基，高择氏培养基，平皿，吸管等。 三、操作步骤 1.滤过法:检查一定体积的空气中所含细菌的数量。 (1)先将仪器按图15-1装置。 (2)将下面的瓶装满水。 (3)开放塞子，使水缓缓流出，这时外界的空气被吸入，经喇叭口进入盛有50ml无菌水的三角瓶中，至4公升水流完后，则4公升体积空气中的微生物被滤过在50ml水中。 (4)自三角瓶中吸取1ml水于无菌培养皿中(重复三皿)，然后加入已融化而冷却至45?的肉汤蛋白胨琼脂培养基、摇匀、凝固后置28?培养。 (5)培养48h后，按平皿上菌落数计算出每公升空气中细菌的数目。 菌数/公升空气=(1ml水中培养所得菌数?50)/4 2.沉降法 (1)将肉汤蛋白胨琼脂培养基、查氏琼脂培养基、高泽氏琼脂培养基融化后，各倒四个平板。 (2)将上述三种培养皿各取2个，在室外打开皿盖，分别暴露于空气中5min，10min，另两个培养皿在实验室空气中分别暴露5min，10min。 (3)置28?温箱中培养48h后计算其菌落数，观察菌落形态、颜色。 四、结果与计算 1.记录空气中微生物种类和数量 菌落数 细菌 霉菌 放线菌 环境 5min 室外 10min 5min 室内 10min 2.计算每公升空气中微生物数目。 实验十六、样品中菌落总数的检验 一、目的要求 学习掌握样品中菌落总数(平板菌落计数)的原理和方法。 二、实验材料 1.样品:市售鲜啤酒 2.培养基:营养琼脂培养基 3.设备仪器:10ml无菌吸管1支、1ml无菌吸管4支、无菌带塞空试管3支、无菌空培养皿9套、酒精灯、试管架、无菌生理盐水、玻璃珠、温箱36??1?、天平等。 三、基本原理 菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落的总数。 菌落总数主要作为制定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。 每种细菌都有它一定的生物特性，培养时，应用不同的营养条件及其他生理条件(如温度、培养时间、pH、需氧性质等)去满足其要求，才能分别将各种细菌都培养出来。但在实际工作中，一般都只用一种常用的方法去作细菌菌落总数的测定。所得结果，只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温性需氧菌的菌落总数。 四、检验程序 菌落总数的检验程序如下 检样?做成几个适当倍数的稀释度?选择2-3个稀释度各以1ml的量加入灭菌平皿内?每皿内加入适量营养琼脂培养基?计数菌落(36??1?，24?2h)?报告 五、操作步骤 1.检样稀释及培养 (1)以无菌操作，将检样25g(或25ml)剪碎放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内放置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。 固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000-10000r/min的速度处理1min，做成1:10的均匀稀释液。 (2)用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，振摇试管混合均匀，做成1:100的稀释液。 (3)另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递 增稀释一次，即换用一支灭菌吸管。 (4)根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。 (5)稀释液移入平皿后，应及时将凉至46?营养琼脂培养基(可放置于46??1?的水浴中保温)注入平皿约20-25ml，并转动平皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液(不含样品)的灭菌皿内作空白对照。 (6)待琼脂凝固后，翻转平板，置36??1?恒温箱内培养24?2h(肉、水产、乳和蛋品为48?2h)取出，计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克(或毫升)样品所含菌落总数。 2.菌落计数方法 作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。 3.菌落计数的报告 (1)平板菌落数的选择 选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。 (2)稀释度的选择 A(应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之(见表例1) 稀释度选择及菌落数报告方式 例稀释液及菌落数 两稀释 菌落总数 报告方式 -1-2-3次 液之比 个/g(ml) 个/g(ml) 10 10 10 41 多不可计 164 20 —— 16400 16000或1.6?10 42 多不可计 295 46 1.6 37750 38000或3.8?10 43 多不可计 271 60 2.2 27100 27000或2.7?10 54 多不可计 4650 313 —— 313000 310000或3.1?10 25 27 11 5 —— 270 270或2.7?10 6 0 0 0 —— <1?10 <10 47 多不可计 305 12 —— 30500 31000或3.1?10 B(若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间，则视二者之比如何来决定，若其比值小于2，应报告其平均数;若大于2则报告其中较小的数字(见 表例2及例3)。 C(若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表例4)。 D(若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表例5)。 E(若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之(见表例6)。 F(若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表例7)。 (3)菌落数的报告 菌落数在100以内时，按其实有数报告;大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示(见表“报告方式”栏)。 实验十七、样品中大肠菌群的检验 一、目的要求 学习大肠菌群菌数的检测原理和方法。 二、实验材料 1.仪器:恒温箱36??1?、天平、显微镜、平皿、水浴44??0.5?、试管、吸管、载玻片。 2.培养基及试剂:乳糖胆盐发酵管(单料及双料)、伊红美兰琼脂培养基(EMB)、乳糖发酵管、革兰氏染色液、芽孢染色液。 三、基本原理 大肠菌群系指一群在37?，24小时能发酵乳糖、产气需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。 食品中大肠菌群数系以每100ml(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 四、检验程序 大肠菌群检验程序如图17-1: 五、操作步骤 1.检样稀释 (1)以无菌操作，将检样25g(或25ml)剪碎放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内放置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000-10000r/min的速度处理1min，做成1:10的均匀稀释液。 (2)用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，做成1:100的稀释液。 (3)另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用一支1ml灭菌吸管。 (4)根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管。 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管;1ml及以下者，用单料乳糖发酵管。每一稀释度接种三管，置36??1?温箱内，培养24?2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。 3.分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美兰琼脂平板上，置36??1?温箱内，培养18-24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和芽孢染色以及证实试验。 4.证实试验 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1-2个，进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36??1?温箱内培养24?2h。观察产气情况。凡乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。 5.报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml(g)大肠菌群的最可能数。 大肠菌群最可能数(MPN)检索表 阳性管数 MPN 100ml(g) 1ml(g)?3 0.1 ml(g)?3 0.01 ml(g)?3 0 0 0 <30 0 0 1 30 0 0 2 60 0 0 3 90 0 1 0 30 0 1 1 60 0 1 2 90 0 1 3 120 0 1 0 30 0 1 1 60 0 1 2 90 0 1 3 120 0 1 0 30 0 1 1 60 0 1 2 90 0 1 3 120 0 2 0 60 0 2 1 90 0 2 2 120 0 2 3 160 0 3 0 90 0 3 1 120 0 3 2 160 0 3 3 190 1 0 0 40 1 0 1 70 1 0 2 110 1 0 3 150 1 1 0 70 1 1 1 110 1 1 2 150 1 1 3 190 1 2 0 110 1 2 1 150 1 2 2 200 1 2 3 240 1 3 0 160 1 3 1 200 1 3 2 240 1 3 3 290 2 0 0 90 2 0 1 140 2 0 2 200 2 0 3 260 2 1 0 150 2 1 1 200 2 1 2 270 2 1 3 340 2 2 0 210 2 2 1 280 2 2 2 350 2 2 3 420 2 3 0 290 2 3 1 360 2 3 2 440 2 3 3 530 3 0 0 230 3 0 1 390 3 0 2 640 3 0 3 950 3 1 0 430 3 1 1 750 3 1 2 1200 3 1 3 1600 3 2 0 930 3 2 1 1500 3 2 2 2100 3 2 3 2900 3 3 0 2400 3 3 1 4600 3 3 2 1100 3 3 3 >24000 注:?本表采用三个稀释度[1ml(g)、0.1ml(g)和0.01ml(g)]每稀释度三管。 ?表内所列检样量如改用10ml(g)，1ml(g)，0.1ml(g)时，表内数字应相应降低10倍;如改用0.1ml(g)，0.01ml(g)，0.001ml(g)时，则表内数字应相应增加10倍，其余可类推。 ?10ml以上用双倍乳糖胆盐发酵管，50ml以上用三倍乳糖胆盐发酵管。 ?可疑菌落 a:紫红色具有金属光泽的菌落。 b:深红色，不带或略带金属光泽的菌落。 c:淡红色，中心色较深的菌落。 实验十八、酵母菌对糖类的发酵和对氮源的利用 一、目的要求学习测定酵母菌对糖类的发酵和对氮源的利用的方法 二、实验材料 1菌种:啤酒酵母 2:培养基豆芽汁或无氮基础培养基，无氮基础培养基，葡萄糖，半乳糖，麦芽糖，蔗糖，乳糖，棉子糖，硫酸铵，硝酸钾，尿素等。 三、基本原理 酵母菌对各种糖类的发酵能力差别很大，这是酵母菌分类鉴定的重要依据，也是酿造工业中鉴别培养酵母和野生酵母的一种方法。由于酵母菌发酵糖类能产生乙醇和CO2，因此可以在加糖的培养基中培养酵母菌，通过观察有无气体生产来判断酵母菌能否发酵该糖。不同的酵母菌，由于其体内的酶系不同，对不同氮源物质的利用能力也不同。了解酵母菌对氮源物质的要求，不但有助于对酵母菌进行分类鉴定，而且对发酵培养基的设计也可提供依据。在无氮的基础培养基中添加一种氮源物质作唯一氮源，并接种酵母菌进行培养。根据酵母菌能否生长及生长的程度如何可以判断酵母菌对该氮源物质能否利用及利用能力如何。 四、方法和步骤 1.酵母菌对糖类的发酵 (1) 取杜氏发酵管7支。每支加豆芽汁或无碳基础培养基5ML加被测糖2,棉 子糖4,，对照管不加糖，分别标明糖类的名称，加塞，在6，8610的压 力下，灭菌20分钟。 (2) 接种各管，置于25度下培养5,7天。 (3) 观察结果。若有气泡形成，说明能发酵该糖;反之，说明不能发酵该糖。 记录实验结果。 2.酵母菌对氮源的利用 (1) 取试管5支，每支加固体无氮基础培养基5毫升，加被测氮源0。5,分 别标明添加的氮源的名称，对照管不加氮源，加塞。在6.86的压力下灭 菌20分钟后摆成斜面。 (2) 接种各管。接种时不要将原培养基带入，以免影响结果。必要时可将菌体 进行离心洗涤，制成菌悬液后再接入。 (3) 将上述各管置于25度恒温培养5~7天。 (4) 观察结果。生长状况与对照管一样的，说明酵母菌不能利用该种氮源物质。 五、实验内容 1.测定啤酒酵母对葡萄糖，半乳糖，蔗糖，麦芽糖蜜二糖，棉子糖的发酵情况。 2.测定啤酒酵母对硫酸铵，硝酸钾，尿素的利用情况。 六、实验作业记录实验结果，你实验所得结果能否与理论上的解释统一起来。 实验十九、厌氧微生物的培养 一、目的要求 学习几种厌氧微生物的培养方法。 二、实验材料 菌种:丁酸菌丙酮丁醇梭菌巴氏芽孢梭菌巴氏固氮梭状芽孢杆菌 培养基:丁酸菌培养基TYA培养基焦性没食子酸即邻苯三酚10,NAOH溶液，0，5%美兰，6,葡萄糖水溶液，钯粒A型。 带塞或塑料帽玻璃管(直径18,20mm,长180,200mm)，100ml和250ml 血浆瓶，20ml和50ml针筒，250三角瓶，试管，厌氧罐，培养皿，真空泵，带活塞干燥器，氮气钢瓶。 三、操作步骤 (一)真空干燥器厌氧培养法 此法不适用于培养需要CO的微生物。该法是在干燥器内使焦性没食子酸与2 氢氧化钠溶液发生反应而吸氧，形成无氧的小环境而使厌氧菌生长。 1. 培养基准备与接种 将装有液体培养基的大试管放在水浴中煮沸10min, 以赶出其中溶解的氧气，迅速冷却后(切勿摇动)接种，(同时做好好氧 菌对照实验)。 2. 干燥器准备与抽气 在带活塞的干燥器内底部，预先放入焦性没食子酸 粉末20g和斜放盛有200ml10,NAOH溶液的烧杯。将接有厌氧菌的培养 基和对照管放入干燥器内。在干燥器口上涂抹凡士林，密封后接通真空 泵，抽气3,5分钟，关闭活塞，轻轻摇动干燥器促使烧杯中的NAOH溶 液倒入焦性没食子酸中，两种物质混合发生吸氧反应，使干燥器中形成 无氧小环境。 3. 观察结果 将干燥器置于37度恒温箱中培养约7天，取出培养管，分别 制片观察菌体特征。 (二)深层穿刺厌氧培养法 此法操作简单，适用于一般厌氧微生物的活化和分离培养，但不能用于扩大培养。 1. 接种培养 将玻璃管一头塞上橡胶管，装入培养基的高度为管长的2/3， 套上塑料猫或橡皮赛，灭菌并凝固后将实验菌恋情接种针穿刺接种，置 37恒温箱中培养6,7天。 2. 观察结果 观察菌落形态特征并制片于显微镜下观察菌体的细胞形态， 并记录结果。 (三)针筒厌氧培养法 此法适用于活化厌氧菌和小体积的扩大培养。 1. 培养基准备 将灭菌的装有培养基的血浆瓶放在沸水浴中加热10min，在瓶口 胶塞上插上2枚医用针头排气，以赶出残留在培养基中的氧气，随后将血浆 瓶从沸水浴中取出，在用氮气瓶中的 高纯氮气通过胶塞上的一枚针头引入血 浆瓶中，使血浆瓶中充满氮气，平内培养基在令却过程中保持无氮状态。 2. 针筒装灌培养基 将灭菌的 针筒接上胶塞刺入血浆瓶中，先用平内氮气的压 力将针筒的推杆慢慢推开，待吸入一定的氮气后取下针筒，排尽针筒内气体， 按此重复操作3次，以排尽针筒内的 残留空气而维持无氧状态。使血浆瓶口 朝下倾斜，利用瓶内压力将培养基缓慢灌入针筒瓶内然后取下针筒，用灭菌 的带孔橡皮塞迅速把针筒头部塞住。。 3. 接种培养，采用无菌操作以菌种液针筒将菌穿刺接入培养液针筒中，置37 恒温度恒温培养。用于菌种活化可培养16,18h，用于菌体生长可培养6,7h。 4. 观察结果 取菌制片观察 (四)厌氧罐培养法 此法利用透明的硬质塑料制成的一种小型罐状密封容器，采用抽气换气法冲入氢气，利用钯作催化剂于罐内氧气发生作用以达到去除氧气的目的，同时充入10,(v/v)的CO以促进幕些革兰氏阴性厌厌氧菌的生长。 2 其操作过程如下: 1. 制备厌氧度指示剂 取30ml0.5%美兰溶液用蒸馏水稀释至 100ml;6ml0.1mol/LnaOH溶液用蒸馏水稀释至100ml，6g葡萄糖加蒸馏水至 100ml。将上述3种溶液等体积混合，并用针筒注入1ml安錇管内，沸水浴加 热至无色，立即封口制成，取一根直径1cm长8cm的 无毒透明塑料软管，将 装有美兰指示剂的安棓瓶置于软管中，制成美兰厌氧度指示管。 2. 培养基准备与接种 将制成无菌无氧的 培养基平板，在无菌操作中迅速划线 接种，并立即将平皿倒置放入已准备好的厌氧罐中，同时放入已准备好的厌 氧罐中，同时放入一支美兰厌氧指示剂管。 3. 抽气换气 将真空泵接通厌氧罐抽气接口(图14-4)，抽真空至表指针 0.09~0.093Mpa时，关闭抽气口活塞，用止血钳夹住抽气橡皮管。打开氮气 钢瓶气阀向厌氧罐内充入氮气，当真空表指针返回到零位终止充氮。再按上 述步骤抽气和充入氮气，如此重复2,3次，使罐中氧的含量达最彽度。最后 充入的氮气使真空表指针达0.02mpa时停止充氮气。再开启CO，钢瓶阀门，2 向罐内充入CO直至真空表指针达到0.011mpa时停止。为除尽罐内残留的氧，2 以氢气袋气管连接向厌氧罐内充入氢气直至真空表指针回到零位为止。充气 完毕，封闭厌氧罐。 4(恒温培养 将厌氧罐置于37恒温箱中培养6d，注意罐中厌氧指示剂的颜色变 化。 5.观察结果和镜检 从罐内取出平皿，观察菌落特征。并挑取菌落作涂片，用结晶紫染液染色，镜检，比较不同菌的菌体细胞形态特征，并作记录。 四、作业 菌落形态特征 菌体形态特征 菌种 液体培 菌落大小、形状颜色、 菌体形态、有无芽孢、 名称 养特征 光滑度、透明度、气味 芽孢形状、革兰氏染色 五、思考题 请设计一个实验，如何从土壤中分离，纯化和培养出厌氧菌。 实验二十、微生物的生理生化特性试验 一、目的: 掌握细菌鉴定中常用的生理生化反应及其原理 二、材料: 1. 菌种:大肠杆菌 ;枯草杆菌 ;变形杆菌;产气杆菌。 2. 培养基:葡萄糖蛋白胨水培养基;柠檬酸盐培养基;硫化氢试验用培养 基;蛋白胨水培养基;淀粉培养基;明胶培养基;硝酸盐培养基。 3. 试剂:吲哚试剂;格里斯氏试剂A,B;碘液;二苯胺试剂。 三、基本原理: 由于各种微生物的新陈代谢类型不同，因此对各种物质利用后所产生的代谢产物也不同，我们可以用化学反应来测定微生物的代谢产物，这种反应称之为生理生化反应。生理生化反应常用来鉴别再形态或其他方面不易区分的微生物，例如肠道细菌中，大肠杆菌和伤寒杆菌，二者在形态上不易区分，但前者能发酵乳糖，后者不能。因此可以从他们能否发酵乳糖来区别它们，所以微生物的生理生化反应是微生物分类鉴定的重要依据之一。 四、方法和步骤: 1. 淀粉水解试验 莫些细菌可以产生能水解培养基中淀粉的淀粉酶(胞外 酶)，使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，再被细菌吸收利用。淀粉水解后， 遇碘不再变蓝色。其步骤如下: (1) 淀粉培养基在水浴中融化后，冷至50，以无菌操作制成平板。用接种环 取少量枯草杆菌在平板的一边“，”字形接种，另取少量试验菌在平板的 另一边接种。置37温箱中培养16,20小时。 (2) 观察结果:打开皿盖，滴加少量碘液于培养基上，轻轻旋转培养皿，使碘 液均匀铺满整个平板。如果在菌周围出现无色透明圈，说明淀粉被水解。 透明圈大小说明该菌水解淀粉能力的大小。 2. 产硫化氢试验: 某些菌能发酵含硫的有机物或无机物产生的硫化氢，H2s遇重金属盐类，如铅盐。铁盐等，则形成黑色的硫化铅或硫化铁的沉淀物。从而可以断定的产生与否。其测定方法有两种，一种是用柠檬酸铁胺的培养基穿刺培养，看是否有黑色沉淀;一种是在盛有液体培养基的试管中接种菌以后，在试管的棉塞下吊一片醋酸铅溶液，经培养后看醋酸铅试纸是否变黑。(醋酸铅试纸的制法:将普通滤纸在1,醋酸铅溶液中，取出晾干，加压灭菌后，105 烘干备用)。其步骤如下: (1) 取H2S试验用培养二支(内含有柠檬酸铁铵)，分别用穿刺法接种大 肠杆菌和变形杆菌，试管上注明菌名，置37 培养24小时。 (2) 培养后取出观察，看有无黑色沉淀产生。 附:穿刺接种法:将已挑有菌的接种针(针必须很挺直),自培养基的中心垂直地刺入培养基中，然后沿原穿刺线将针拔出，塞上棉塞，将接种针上残留的菌在火焰上烧掉。穿刺接种法见图20-2。 3.吲哚试验 某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚(靛基质)，吲哚与对二甲基氨基苯甲醛作用后可产生红色的玫瑰吲哚。其反应式如下: 其步骤如下: (1) 取蛋白胨水培养基试管两支，分别接种大肠杆菌、产气杆菌，并在上注明 菌名，置37培养48小时。 (2) 在培养中先加入乙醚约1毫升(使呈明显的乙醚层)，充分振荡，使吲哚 溶于乙醚中，静置片刻，使乙醚层浮于培养的上面，这时再沿管壁慢慢加 入吲哚试剂5,10滴，观察有无红色出现。注意，加入试剂后不可再摇动， 否则被混合，红色不明显。 4、甲基红试验 某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能产生大量的酸，使PH降低至4,5，它先产生丙酮酸，丙酮酸再被分解成分解甲酸、乙酸、 乳酸等。酸的产生右由加入甲基红指示剂的变色而指示(有效PH范围为4.2~6.3)。细菌分解葡萄糖产酸，则培养液由原来的桔黄色，变为红色，即为甲基红正反应。其步骤如下: (1) 取葡萄糖蛋白胨水培养试管两支，一支接入大肠杆菌，另一支接入产气杆 菌，置 37培养48小时。 (2) 培养48小时后取出，沿管壁加入甲基红指示剂3,4滴，上层呈红色者为 阳性。 5.V(P试验 某些细菌生长于葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，而丙酮 酸又可缩合、脱羧而转变成乙酰甲基醇，如加入强碱液，即与空气中的氧起 作用产生二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的含胍基成分作用生成红色化合物，称 阳性反应，没有红色化合物产生则称阴性反应。 操作步骤: (1) 取葡萄糖蛋白胨水培养基两支(每支盛有5毫升培养液)，一支接入 大肠杆菌，一支接入产气杆菌。注明菌名，置37培养。 (2) 培养24小时后取出，在培养液中加入40,KOH10,20滴(约0.5ml)。 再加等量的萘酚溶液，拔出棉塞，用力振荡，然后放到37水浴或保 温箱中保温15,30分钟。如培养液出现红色，V.P反应阳性，如无反 应，即为阴性。 6.柠檬酸盐利用试验 许多细菌不能分解酸钠，但有些细菌能分解柠檬酸钠作为碳源，分解后产生碱性化合物，使培养基由微酸变碱，培养基中的指示剂则由绿色变为深蓝色。 (1) 取柠檬酸盐斜面两支，一支接种大肠杆菌，一支接种产气杆菌， 注明菌名，置37培养48小时。 (2) 48小时后观察，培养基顔色由绿色变深蓝色者为阳性，不变者为 阴性。 7.明胶液化试验 明胶是一种动物性蛋白，明胶的水解是由于细菌所产生的蛋白酶的作用，明胶培养基本身低于20凝固，高于24则自动液化。明胶分解后其分子变小，虽在低于20的温度下，亦不再凝固。以无菌操作，穿刺接种大肠杆菌和枯草杆菌于明胶培养基中，置37温箱中培养48小时。置冰箱中速冷后观察其液化吸胶的情况。如图20,30) 8.硝酸盐还原试验 有些细菌具有硝酸还原能力，将硝酸盐还原为亚硝酸或氨和氮等，当加入格里斯氏试剂后，亚硝酸盐与其中的醋酸作用生成亚硝酸与对氨基苯磺酸作用成为重氮苯磺酸，后者与萘胺萘成为红色的N萘胺偶氮磺酸，此为阳性反应。 硝酸盐还原作用包括如下变化: 阴性反应的原因，有两种可能性存在: (1) 细菌不能还原硝酸盐，则培养后的培养液中仍有硝酸盐存在。 (2) 亚硝酸盐继续分解生成氨和氮，则培养基中没有硝酸盐存在。 硝酸盐的存在与否可用二苯胺试剂检查。如果有硝酸盐存在，当向溶液加入 1,2滴二苯胺试剂检查。如果有硝酸盐，以无亚硝酸盐存在，当向溶液加入 1,2滴二苯胺试剂时，培养液如果呈蓝色反应，则表示培养物中有硝酸盐， 又无亚硝酸反应，表示 无硝酸盐还原作用。如不呈蓝色反应表示硝酸盐和 新生成的亚硝酸盐都已还原成其他物质，故仍为硝酸盐还原阳性反应。 其步骤如下: (1) 分别接种大肠杆菌、枯草杆菌于硝酸盐液体培养基中，每菌株作两个 重复，另外留一管不接种作对照，试管上注明菌名，置37培养48, 96小时。 (2) 取两支干净的空试管或在比色瓷盘小窝中倒入少许培养了48,96小 时的培养液，再滴一滴格里斯氏试剂A液及B液。在对照管中同样加 入A、B液各一滴。 (3) 观察结果:培养液中滴入A、B液后，溶液如变为红色，玫瑰红色、 橙色、棕色等表示有蓝色反应，亚硝酸盐存在，务硝酸盐还原阳性。 如红色出现，则可加1,2滴二苯胺试剂，此时如呈蓝色反应，则为 阴性反应。如不呈则仍为阳性反应。 五、实验结果 将实验结果填于表 细菌生理生化反应试验结果 试验名称 菌 名 结 果 H2S产生 变形杆菌 大肠杆菌 吲哚试验 产气杆菌 大肠杆菌 硝酸盐还原 枯草杆菌 大肠杆菌 淀粉水解 枯草杆菌 大肠杆菌 明胶液化 枯草杆菌 大肠杆菌 VP反应 产气杆菌 大肠杆菌 甲基红试验 产气杆菌 大肠杆菌 柠檬酸盐利用 产气杆菌 大肠杆菌 附:试验结果:“，”——阳性反应;“,”——阴性反应。 六、思考题 1.细菌的生理生化反应试验意义何在, 2.吲哚是如何产生的,做吲哚试验可用怎样的含成培养基代替蛋白胨水, 3.如果NO2-反应是负的，反应也是负的，这种细菌有没有硝酸盐还原能力, 实验二十一、土壤中微生物的分离、纯化及无菌操作技术 一、实验目的和内容 目的:学习从土壤中奋力微生物的方法，学习无菌操作技术。 内容:1。用稀释法分离细菌、放线菌和霉菌。 2(用平板划线方法分离微生物。 3(学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。 二、实验材料和用具 以灭菌的牛肉膏、高氏一号、土豆蔗糖固体培养基各一瓶，49.5ml无菌水(带玻璃珠)一瓶、4.5ml无菌水6管、80%乳酸、10%酚液、95%乙醇。 无菌培养皿12套、1ml无菌移液管10支、土壤样品、天平、称量纸、药勺、试管架、玻璃铅笔、橡皮头(用75%乙醇浸泡)、涂布器。 三、操作步骤 (一)土壤稀释分离 1.取土壤 取表层以下5~10厘米的土样，放入灭菌的袋中备用，或在4?冰箱中暂存。 2.制备稀释液(要无菌操作) (1) 制备土壤悬液:称土样0.5克，迅速倒入带玻璃珠的无菌水瓶中(玻璃珠 -2用量以充满瓶底为最好)，振荡5-10分钟，使土样充分打散，即成为10 的土壤悬液。 -2-3(2) 稀释:用无菌移液管吸10的土壤悬液0.5ml，放入4.5无菌水中即为10 -3-7稀释液，如此重复，可一次制成10-10稀释液(图16-1)。注意:操作 时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后， 要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少 稀释中的误差。 3.混菌法测定菌落的方法 -7-6(1) 细菌:取10、10两管稀释液各1ml，分别接入相应标号的平皿中，每 个稀释度接两个平皿。然后取冷却至50?的牛肉膏琼脂培养基，分别倒 入以上培养皿中(装量以铺满皿底的2/3为宜)，迅速轻轻摇动平皿，使 菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板。 倒平板时要注意无菌操作，见图16-2。 -2-3(2) 放线菌:取10、10两管稀释液各1ml，分别接入相应标号的平皿中， 每个稀释度接两个平皿。在熔好的土豆蔗糖培养基中，每100ml加入灭菌 的乳酸1ml，轻轻摇匀，然后用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成 霉菌的平板。 4.培养 将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放置，于 28-30?中恒温培养，细菌培养1-2d，放线菌培养5-7d，霉菌培养3-5d。可用于观察菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面。 (二)平板划线分离微生物 1. 到平板 按无菌操作要求，在火焰旁操作(图16-2)，取融化并冷却至不烫手的固体培养基(约50?)，倒入无菌培养皿中，倒量以铺满皿底为限，平放桌上待其充分凝固，备用。 2. 划线分离 使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种中沾取少量菌样，在相应培养基平板中分离，划线的方法多样，目的是获得单个菌落，主要方法参见图16-3. 3.培养 方法同“土壤稀释分离”。 (三)斜面接种和穿刺接种 1.斜面接种 (1)取新鲜固体斜面培养基，分别做好标记(写上菌名、接种日期、接种人等)，然后用无菌操作方法，把待接菌种接入以上新鲜培养基斜面中。 (2)接种的方法是，用接种环沾取少量待接菌种，然后在新鲜斜面上“之”字形划线，方向是从下部开始，一直划至上部(图16-4A)。注意划线要轻，不可把培养基划破。 (3)接种后30?恒温培养，细菌培养48h，放线菌、霉菌培养至袍子成熟方可取出保存。 四、注意事项 1、一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中，故从土壤中分离细菌时，要取较高的稀释度，否则菌落连成一片不能计数。 2、在土壤稀释分离操作中，每稀释10倍，最好更换一次移液管，使计数准确。 3、放线菌的 培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多。 五、演示 1、土壤稀释分离法操作 2、平板制作及划线分离方法。 3、斜面接种。 六、实验报告 1.记录土壤稀释分离结果，并计算出每克土壤中的细菌、放线菌和霉菌的数量。 计算方法:选择长出菌落30-300之间的培养皿计数，按以下公式: 总菌数/g=同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数 2.分别记录平板划线、斜面接种的结果，并自我评价。 七、问题和思考 1.在测定土壤微生物含量中，除混菌法外还可用什么方法, 2.试设计试验，从土壤中分离出酵母菌并进行计数。 实验二十二、微生物菌种保藏 一、目的要求 学习和掌握菌种保藏的基本原理，比较几种不同的保藏方法。 二、基本原理 微生物个体微小，代谢活跃，生长繁殖快，如果保存不妥，容易发生变异，被其他杂菌污染，甚至导致细胞死亡。这种现象屡见不鲜。菌种的长期保藏对任何微生物学工作者都是很重要的，也是非常必要的。 自19世纪末，F.Kral开始尝试微生物菌种保藏以来已建立了许多长期保藏菌种的方法。虽不同的保藏方法其原理各异，但基本原则是使微生物的新陈代谢处于最低或几乎停止的状态。保藏方法通常基于温度、水分、通气、营养成分和渗透压等方面。 随着分子生物学发展的需要，基因工程菌种的保藏已成为菌种保藏的重要内容之一。其保藏原理和方法与其他菌种相同。但考虑到重组质粒在宿主中的不稳定性，所以基因工程菌株的长期保藏目前趋向于将宿主和重组质粒分开保存，因此本实验也将介绍DNA和重组质粒的保藏方法。 现有菌种保藏方法大体分为以下几种: 1.传代培养法 此法使用最早，它是将要保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基(用于厌氧细菌)培养好后，置4?存放，定期传代培养、再存放。后来发展在斜面培养物上覆盖一层无菌的液体石蜡，一防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面石蜡层可将微生物和空气隔离，减弱细胞的代谢作用。不过这种方法保藏菌种的时间不长，且传代过多使菌种的主要特性往往减退甚至丢失。因此它只能作为短期存放菌种。 2.悬液法 这是一种将细菌细胞悬浮在一定的溶液中，包括蒸馏水、蔗糖、葡萄糖等糖液，磷酸缓冲液、食盐水等，有的还使用稀琼脂。悬液法操作简便，效果较好。有的细菌、酵母菌用这种方法保藏几年甚至近十年。 3.载体法 该法是使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。这种载体来源很广，如土壤、沙土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤纸片等。该法操作通常比较简单，普通实验室均可进行。特别是以滤纸片(条)作载体，细胞干燥后，可将含细菌的滤纸片或条装入无菌的小袋封闭后，放在信封中邮寄很方便。 4.真空干燥法 这种方法包括冷冻真空干燥法和L-干燥法。前者是将要保藏的微生物样品先经低温预冻，然后在低温状态下减压干燥。后者则不需要低温预冻样品，只是 使样品维持在10-20?范围内进行干燥。 5.冷冻法 这是一种使样品始终存放在低温环境下的保藏方法。它包括低温法(-70-80?)和液氮法(-196?)。 水是生物细胞的主要成分，约占活体细胞总量的90%，在0?或以下时会结冰。样品降温速度过慢，胞外溶液中水分大量结冰，溶液的浓度提高，胞内的水分便大量向外渗透，导致细胞剧烈收缩，造成细胞损伤，此为溶液损伤。另一方面，若冷却速度过快，胞内的水分来不及通过细胞膜渗出，胞内的溶液因过冷而结冰，细胞的体积膨大，最后导致细胞破裂，此为胞内冰损伤。因此控制降温速率是冷冻微生物细胞十分重要的步骤。现在可以通过以下两个途径来克服细胞的冷冻损伤。 (1)保护剂 也称分散剂。在需冷冻保藏的微生物样品中加入适当的保护剂可以使细胞经低温冷冻时减少冰晶的形成，如甘油、二甲亚砜、谷氨酸钠、糖类、可溶性淀粉、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、血清、脱脂奶等均为保护剂。二甲亚砜对微生物细胞有一定的毒害，一般不采用。甘油适宜低温保藏，脱脂奶和海藻糖是较好的保护剂，尤其是在冷冻真空干燥中普遍使用。 (2)玻璃化 固体在自然界中有两种形式，即晶体和玻璃化。物质的质点(分子、原子和离子等)呈有序排列或格子构造排列的称为晶态即晶体，反之质点作不规则排列的则为玻璃态即玻璃化。玻璃化不会使生物细胞内外的水在低温下形成晶体，细胞不受损伤。 67实现玻璃化可以通过降温速率(10-10?/s)和提高溶液浓度两种形式达到。 三、器材 1.菌种:大肠杆菌，假单胞菌，灰色链霉菌，酿酒酵母，产黄霉菌。 2.培养基:肉汤培养基，马铃薯培养基，麦芽汁酵母膏培养基。 3.溶液或试剂:液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，95%乙醇，10%盐酸，无水氯化钙，氯化钠，干冰。 4.仪器或其他用具:无菌吸管，无菌滴管，无菌培养皿，安瓿瓶，冻干管，40目与100目筛子，油纸，滤纸条，干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱(-30?)，超低温冰箱和液氮罐。 四、操作步骤 以下集中保藏方法可根据实验室具体条件选做: 1.斜面法 将菌种转接在适宜的固体斜面培养基上，待其充分生长后，用油纸将棉塞部分包扎好(斜面试管用带帽的螺旋试管为宜。这样培养基不易干，且螺旋帽不易长霉，如用棉塞，塞子要求比较干燥)，置4?冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类各异。霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保藏2-4个月移种一次。普通细菌最好每月移种一次。假单胞菌2周传代一次。酵母菌间隔两个月。此法操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是保藏时间短，需定期传代，且易被污染，菌种的主要特性容易改变。 2.液体石蜡法 (1)将液体石蜡分装于试管或三角瓶中，塞上棉塞并用牛皮纸包扎，121?灭菌30min，然后放在40?恒温箱中使水汽蒸发后备用。 (2)将需要保藏的菌种在最适宜的斜面培养基中培养，直到菌体健壮或孢子成熟。 (3)用无菌吸管吸取无菌的液体石蜡，加入已长好菌的斜面上。其用量以高出斜面顶端1cm为准(图17-1)，使菌种与空气隔离。 (4)将试管直立，置低温或室温下保藏(有的微生物在室温下比在冰箱中保存的时间还要长)。 此法实用而且效果较好。产孢子的霉菌、芽孢菌可保藏两年以上，有些酵母菌可保藏1-2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌在37?温箱内亦可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。 从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上灼烧时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。 3.穿刺法 该方法操作简便，是短期保藏菌种的一种有效方法。 (1)按实验十二操作步骤1(3)接种培养(培养试管选用带螺旋帽的短试管或用安瓿管、Eppendorf管等)。 (2)将培养好的穿刺管盖紧，外面用石蜡膜封严，置4?存放。 (3)取用时将接种环(环的直径尽可小些)深入菌种生长处挑取少许细胞，接入适当的培养基中。穿刺管封严后可保留以后再用。 4.滤纸法 (1)滤纸条的准备 将滤纸剪成0.5×1.2cm的小条装入0.6×8的安瓿管中，每管装1~2片，用棉花塞上后经121?灭菌30min。 (2)保护剂的配置 配置20%脱脂奶，装在三角瓶或试管中，112?灭菌25min.待冷后，随机取出几分分别放置28?、37?培养过夜，然后各取0.2ml涂布在肉汤平板上或斜面上进行无菌检查，确认无菌后方可使用，其余的保护剂置4?存放待用。 (3)菌种培养 将需保存的菌种在适宜的斜面培养基上培养、直到生长半满。 (4)菌悬液的制备 取无菌脱脂奶约2~3ml加入带保存的菌种斜面试管内。 用接种环轻轻的将菌苔刮下，制成菌悬液。 (5)分装样品 用无菌滴管或试管吸取菌悬液滴在安瓿管中的滤纸条上，每条滤纸条约0.5ml，塞上棉花。 (6) 干燥 将安瓿管放入有五氧化二磷或无水氯化钙作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。 (7)熔封与保存 用火研按图17-2所示将安瓿管封口，置4?或室温存放。 (8)取用安瓿管 使用菌种时，取存放的安瓿管按图17-3A所示用锉刀或砂轮从上端打开安瓿管或按图17-3B所示将安瓿管口在火焰上烧热，加一滴冷水在烧热的部位使玻璃裂开，敲掉口端的玻璃，用无菌镊子取出滤纸，放入液体培养基中培养或加入少许无菌水用无菌吸管或毛细滴管吹打几次，使干燥物很快溶解后吸出，转入适当的培养基中培养。 5.砂土管法 (1)河沙处理 取河沙若干加入10%盐酸，加热煮沸30min除去有机质，倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸馏水冲洗，烘干后用40目筛子过筛，弃用粗颗粒，备用。 (2) 土壤处理 取非耕作层不含腐殖质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。烘干后碾碎，用100目筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。 (3) 沙土混合 处理妥当的沙土与土壤按3:1的 比例掺合(或根据需要而用比例，是指可全部做沙或土)均匀后，装入10×100的小试管或安瓿管中，每管分装1g，塞上棉塞，进行灭菌(通长采用间歇灭菌2~3次)，最后烘干。 (4)无菌检查 每10枝砂土管随机抽一支，将沙土倒入肉汤培养基中，30?培养40h，若发现有微生物生长，所有砂土管则需重新灭菌，再做无菌试验，直至证明无菌后方可使用。 (5)菌悬液的制备 取生长健壮的新鲜斜面菌种，加入2~3ml无菌水(每18×180mm的试管斜面接种)，用接种环轻轻将菌苔洗下，制成菌悬液。 (6)分装样品 每支砂土管(著名标记后)加入0.5ml菌悬液(刚刚使砂土湿润为宜)，用接种针拌匀。 (7)干燥 将装有菌悬液的砂土管放入干燥管内，干燥器底部盛有干燥剂。 用真空泵抽干水分后火焰封口(也可用橡皮塞塞住试管口)。 (8)保存 置4?冰箱或室温干燥处，每隔一定的时间检测。 此法多用于产芽孢的细菌、产生孢子的霉菌和放线菌。在抗生素生产工业中应用广泛、效果较好，可保存几年时间，但对营养细胞效果不佳。 6.冷冻真空干燥法 (1)冻干管的制备 选用中性硬质玻璃，95号材料为宜，内径约50mm，长约15cm,冻干管的洗涤按新购玻璃品洗净，烘干后塞上棉花。可将保藏编号、日期等打印在纸上，剪成小条，装入冻干管。121?灭菌30min. (2)菌种培养 将要保藏的菌种接入斜面培养，产芽孢的细菌培养至芽孢从菌体脱落或产孢子的放线菌、霉菌至孢子丰满。 (3)保护剂的配制 选用适宜的保护剂按使用浓度配制后灭菌，随即抽样培养后进行灭菌检查(同滤纸法保护的无菌检查)，确认无菌后才能使用。 糖类物质需要过滤器除菌，脱脂牛奶112?，灭菌25min。 (4)菌悬液的制备 吸2-3ml保护剂加入新鲜斜面菌种试管，用接种环将菌苔或孢子洗下振荡，制成菌悬液，真菌菌悬液则需置4?平衡20-30min。 (5)分装样品 用无菌毛细滴管吸取菌悬液加入冻干管，每管装约0.2ml。最后在几支冻干管中分别装入0.2ml、0.4ml蒸馏水作对照。 (6)预冻 用程序控制温度仪分级降温。不同的微生物其最佳降温度率有所差异，一般由室温快速降温至4?，4?至-40?每分钟降低1?，-40?至-60?以下每分钟降温5?。条件不具备者可以使用冰箱逐步降温。从室温?4??-12?(三星级冰箱为-18?)?-30??-70?，也可用盐水干冰替代。 (7)冷冻真空干燥 启动冷冻干燥机制冷系统。当温度下降到-50?以下时，将冻结好的样品迅速放入冻干机钟罩内，启动真空泵抽气直至样品干燥，也可按图17-4所示用简单的装置代替冻干机。 样品干燥的程度对菌种保藏的时间影响很大。一般要求样品的含水量为1%-3%。判断方法:a.外观 样品表面出现裂痕，与冻干管内壁有脱落现象，对照管完全干燥;b.指示剂 用3%的氯化钴水溶液分装冻干管，当溶液的颜色由红变浅蓝后，再抽同样长的时间便可。 (8)取出样品 先关真空泵，再关制冷机，打开进气阀，使钟罩内真空度逐渐下降，直至与室内气压相等后打开钟罩，取出样品。先取几支冻干管在桌面上轻敲几下，样品很快疏散，说明干燥程度达到要求。若用力敲，样品不与内壁脱开，也不松散，则需继续冷冻真空干燥，此时样品不需事先预冻。 (9)第二次干燥 将已干燥的样品管分别安在歧形管，启动真空泵进行第二次干燥。 (10)熔封 用高频电火花真空检测仪测冻干管内的真空程度。当检测仪将要触及冻干管时，发出蓝色电光说明管内真空度很好，便在火焰下(氧气与煤气混合调节，或用酒精喷灯)熔封冻干管(图17-3B)。 (11)存活性检测 每个菌株取1支冻干管及时进行存活检测。打开冻干管，加入0.2ml无菌水，用毛细滴管吹打几次，沉淀物溶解后(丝状真菌、酵母菌则 需要置室温平衡30-60min)，转入适宜的培养基培养，根据生长状况确定其存活性，或用平板计数法或死活染色方法确定存活率。如需要可测定其特征。 (12)保存 置4?或室温保藏(前者为宜)。隔时进行检测。 该方法是菌种保藏的主要方法，对大多数微生物较为适合、效果较好，保藏时间依不同的菌种而定，有的为几年、甚至30多年。 取用冻干管时，先用75%乙醇将冻干管外壁擦干净，再用砂轮或锉刀按图17-3在冻干管上端画一小痕迹，然后将所画之处向外，两手握住冻干管的上下两端稍向外用力便可打开冻干管，或将冻干管近口烧热，在热处滴几滴水，使之破裂，再用镊子敲开。 7.液氮法 (1)安瓿管的准备 用于液氮保藏的安瓿管要求既能经121?高温灭菌又能在-196?低温长期存放。现已普遍使用聚丙烯塑料制成带有螺旋帽和垫圈的安瓿管，容量为2ml。用自来水洗净后，经蒸馏水冲洗多次，烘干，121?灭菌30min。 (2)保护剂的制备 配制10%-20%的甘油，121?灭菌30min。使用前随机抽样进行无菌检查(见滤纸法保护剂的配制)。 (3)菌悬液的制备 取新鲜的培养健壮的斜面菌种加入2-3ml保护剂，用接种环将菌苔洗下振荡，制成菌悬液。 (4)分装样品 用记号笔在安瓿管上注明标号，用无菌吸管吸取菌悬液，加入安瓿管中，每管加0.5ml菌悬液。拧紧螺旋帽。 如果安瓿管的垫圈或螺旋帽封闭不严，液氮罐中液氮进入管内，取出安瓿管时，会发生爆炸。因此，密封安瓿管十分重要，需特别细致。 (5)预冻 先将分装好的安瓿管置4?冰箱中放30min后转入冰箱上格-18?处放置20-30min，再置-30?低温冰箱或冷柜20min后，快速转入-70?超低温冰箱(可根据实验室条件采取不同的预冻方式，如用程序控制降温仪、干冰、盐冰等)。 (6)保存 经-70?一小时冻结，将安瓿管快速转入液氮罐(图17-5)液相中，并记录菌种在液氮罐中存放的位置与安瓿管数。 (7)解冻 需使用样品时，带上棉手套，从液氮罐中取出安瓿管，用镊子夹住安瓿管迅速放入37?水浴锅中，摇动1-2min，样品很快融化，然后用无菌吸管吸取菌悬液，加入适宜的培养基中保温培养便可。 (8)存活性测定 可采用以下方法进行存活检测: ?染色法 取解冻融化的菌悬液按细菌、真菌死活染色法，通过显微镜观察细菌存活和死亡的比例，计算出存活率。 ?活菌计数法 分别将预冻前和解冻融化的菌悬液按10倍稀释法涂布平板培养后，根据二者每毫升活菌数计算出存活率(如有必要，可测定菌种特征的稳 定性)。 按以下公式计算其存活率: 存活率%=(保藏后每毫升活菌数/保藏前每毫升活菌数)×100% 8.核酸的保存 DNA和RNA常采用以下方法保存: (1)以溶液形式置低温保存 DNA溶于无菌TE缓冲液(10mmol/L Tris?HCl，1mmol/L EDTA,pH8.0)中，其中EDTA的作用是螯合溶液中的二价金属离子，从而抑制DNA酶的活性(镁离子是DNA酶的激活剂)。TE的pH为8.0，是为了减少DNA的脱氨反应。哺乳动物细胞DNA的长期保存可在DNA样品中加入一滴氯仿，避免细菌核酸酶的污染。 RNA一般溶于无菌0.3mol/L醋酸钠(pH5.2)或无菌双蒸馏水中。也可在RNA溶液中加一滴0.3mol/L VRC(氯钒核糖核苷复合物)，其作用是抑制RNase的降解。核酸分子溶于合适的溶液后可置4?、-20?或-70?条件下存放。4?条件下样品可保存6个月左右，-70?条件下可存放5年以上。 (2)以沉淀的形式置低温保存 乙醇是核酸分子有效的沉淀剂。将提纯的DNA和RNA样品加入乙醇使之沉淀，离心后去上清液，再加入乙醇，置4?、-20?可存放数年，而且还可以在常温状态下邮寄。 (3)以干燥的形式保存 将核酸溶液按一定的量分装于Eppendorf管中，置低温(盐冰、干冰、低温冰箱均可)预冻，然后在低温状态下真空干燥，置4?可存放数年以上。取用时，只需加入适量的无菌双蒸馏水，待DNA或RNA溶解后便可使用。 五、实验报告 1.结果 (1)菌种保藏记录 菌种名称 保藏编号 保藏方法 保藏日期 存放条件 经手人 (2)存活率检测结果 菌种名称 保藏方法 保护剂 保藏时间/保藏前 保藏后 存活率% 月 活菌数/ml 活菌数/ml 根据以上结果，你认为哪些因素影响菌种存活性。 2.思考题 (1)根据你自己的实验，谈谈1-2种菌种保藏方法的利弊。 (2)有人设想，如果将人类目前还无法治愈的病者进行冷冻保藏，几十年 或几百年后使其复活，那时医学水平很高，其病便可治愈。你认为这种设想可否实现,说明其技术难点或者克服这些难点的可能性。 附注: 1.冷冻真空干燥中常用的保护剂 (1)脱脂奶10%-20% (2)脱脂奶粉10g，谷氨酸钠1g，加蒸馏水至100ml。 (3)脱脂奶粉3g，蔗糖12g，谷氨酸钠1g，加蒸馏水至100ml。 (4)新鲜培养液50ml，24%蔗糖50ml。 (5)马血清(不稀释)，过滤除菌。 (6)葡萄糖30g，溶于400ml马血清中，过滤除菌。 (7)马血清100ml加内旋环乙醇5g。 (8)谷氨酸钠3g，核糖醇1.5g，加0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)至100ml。 (9)谷氨酸钠3g，核糖醇1.5g，胱氨酸0.1g，加0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)至100ml。 (10)谷氨酸钠3g，乳糖5g，PVP(即polyvinyl pyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮)6g，加0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH7.0)至100ml。 视情况可任选用，而脱脂奶粉对于细菌、酵母菌和丝状真菌适用。因其来源广泛，制作方便，最为常用。 2、低温保护剂 (1)甘油 使用浓度为10%-20% (2)DMSO 使用浓度为5%或10% (3)甲醇 配成5%，过滤除菌备用 (4)PVP 使用浓度为5% (5)羟乙基淀粉(HES) 使用浓度为5% (6)葡萄糖 使用浓度为5% 附录? 染色液的配制 一、吕氏(Loeffler)碱性美蓝染液 A液:美兰(methylene blue) 0.6g 95%乙醇 30ml B液:KOH 0.01g 蒸馏水 100ml 分别配制A液和B液，配好后混合即可。 二、齐氏(Ziehl)石碳酸复红染色剂 A液:碱性复红(basic fuchsin) 0.3g 95%乙醇 10ml B液:石碳酸 5.0g 蒸馏水 95ml 将碱性复红在研磨后，逐渐加入95%乙醇，继续研磨使其溶解，配成A液。 将石碳酸溶解于水中，配成B液。 混合A液和B液即成。通常可将此混合液稀释5-10倍使用，稀释液易变质失效，一次不宜 多配。 三、革兰氏(Gram)染色液 1、 草酸铵结晶紫染液 A液:结晶紫(crystal violet) 2g 95%乙醇 20ml B液:草酸铵(ammonium oxalate) 0.8g 蒸馏水 80ml 混合A、B二液，静置48h后使用。 2、 卢戈氏(Logol)碘液 碘片 1g 碘化钾 2g 蒸馏水 300ml 先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即成。 3、95%的乙醇溶液 4、番红复染液 番红(safranine O) 2.5g 95%乙醇 100ml 取上述配好的番红乙醇溶液10ml与80ml蒸馏水混匀即成。 四、芽孢染色液 1、 孔雀绿染液 孔雀绿(malachite green) 5g 蒸馏水 100ml 2、 番红水溶液 番红 0.5g 蒸馏水 100ml 3、 苯酚品红溶液 碱性品红 11g 无水乙醇 100ml 取上述溶液10ml与100ml5%的苯酚溶液混合，过滤备用。 4、 黑色素(nigrosin)溶液 水溶性黑色素 10g 蒸馏水 100ml 称取10g黑色素溶于100ml蒸馏水中，置沸水裕中30min后，滤纸过滤二次，补加水到100ml， 加0.5ml甲醛，备用。 五、荚膜染色液 1、 黑色素水溶液 黑色素 5g 蒸馏水 100ml 福尔马林(40%甲醛) 0.5ml 将黑色素在蒸馏水煮沸5min，然后加入福尔马林作防腐剂。 2、 番红染液 与革兰氏染液中番红复染液相同。 六、鞭毛染色液 1、 硝酸银鞭毛染色液 A液:单宁酸 5g FeCl3 1.5g 蒸馏水 100ml 福尔马林(15%) 2ml NaOH 1ml 冰箱内可保存3-7d，延长保存期会产生沉淀，但用滤纸出去沉淀后，仍能使用。 B液:AgNO3 2g 蒸馏水 100ml 待AgNO3溶解后，取出10ml备用，向其余的90ml AgNO3中滴入浓NH4OH,使之成为很浓厚的 悬浮液，在继续滴加NH4OH，知道新形成的沉淀有重新刚刚溶解为止。在将备用的10ml AgNO3 慢慢滴入，则出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状沉淀又消失，再滴入AgNO3，直到摇动后仍 呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。冰箱内保存通常10d仍可使用。如雾重，则银盐沉淀出， 不宜使用。 2、 Leifson氏鞭毛染色液 A液:碱性复红 1.2g 95%乙醇 100ml B液:单宁酸 3g 蒸馏水 100ml C液:NaCl 1.5g 蒸馏水 100ml 临时前将A、B、C液等量混合均匀后使用。三种溶液分别于室温保存可保存几周，若 分别置冰箱保存，可保存数月。混合液装密封瓶内置冰箱几周仍可使用。 七、富尔根氏核染色液 1、 席夫氏(Schiff)试剂 将1g碱性复红加入200ml煮沸的蒸馏水中，振荡5min，冷至50?左右过滤，在加入 1mol/LHCl 120ml，摇匀。等冷至25?。加Na2S2O5(偏重亚硫酸钠)3g，摇匀后装在棕色 瓶中，用黑纸包好，放置暗处过夜，此时试剂应为淡黄色(如为粉红色则不能用)，在加中 性活性炭过滤，滤液振荡1min后，再过滤，将此滤液置冷暗处备用(注意:过滤需在避光 条件下进行)。 在整个过程中所用的一切器板都需十分洁净、干燥，以消除还原性物质。 2、 Schandium固定液 A液:饱和升汞水溶液 50ml升汞水溶液加95%乙醇25ml混合即得。 B液:冰醋酸 取A液9ml+ B液1ml，混匀后加热至60?。 3、 亚硫酸水溶液 10%偏重亚硫酸钠水溶液5ml，1mol/L HCl 5ml,加蒸馏水100ml混合即得。 八、乳酸石碳酸棉蓝染色液 石炭液 10g 乳酸(比重1.21) 10ml 甘油 20ml 蒸馏水 10ml 棉蓝(cotton blue) 0.02g 将石碳酸加在蒸馏水中加热溶解，然后加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，使其溶解即成。 九、瑞氏(Wright)染色液 瑞氏染料粉末 0.3g 甘油 3ml 甲醇 97ml 将染料粉末置于干燥的乳钵内研磨，先加甘油，后加甲醇，放玻璃瓶中过夜，过滤即可。 十、美蓝(Ldvositz Weber)染液 在52ml 95%乙醇和44ml四氯乙烷的三角烧瓶中，慢慢加入0.6g氯化美蓝(methylene blue chloride),旋摇三角烧瓶，使其溶解。放5-10?下，12-24h，然后加入4ml冰醋酸。 用质量好的滤纸如What man No42或与之间质量的滤纸过滤。贮存于清洁的密闭容器内。 十一、姬姆萨(Giemsa)染液 姬姆萨染料 0.5g 甘油 33ml 甲醇 33ml 将姬姆萨染料研细，然后边加入甘油边继续研磨，最后加入甲醇混匀，放56?1-24h 后，即为姬姆萨贮存液。临用前在1ml姬姆萨贮存液中加入pH7.2磷酸缓冲液20ml，配成 使用液。 十二、Jenner(May-Grunwald)染液 0.25g genner 染料经研细后加甲醇100ml。 附录? 培养基的配制 一、牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌用) 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g 15-20g 琼脂 水 1000ml pH 7.0-7.2 二、高氏(Gause)1号培养基(培养放线菌用) 可溶性淀粉 20g KNO3 1g NaCl 0.5g K2HPO4 0.5g MgSO4 0.5g FeSO4 0.01g 琼脂20g 水1000ml pH7.2-7.4 配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加 如其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。121?灭菌20min。 三、查氏(Czapek)培养基(培养霉菌用) NaNO3 2g K2HPO4 1g KCl 0.05g MgSO4 0.05g FeSO4 0.01g 蔗糖 30g 琼脂 15-20g 水 1000ml pH 自然 121?灭菌20min。 四、马丁氏(Martin)琼脂培养基(分离真菌用) 葡萄糖 10g 蛋白胨 5g KH2PO4 1g MgSO4?7H2O 0.5g 1/3000孟加拉红(rose bengal，玫瑰红水溶液) 100ml 琼脂 15-20g pH自然 蒸馏水 800ml 112?灭菌30min。 。 临用前加入0.03%琏霉稀释液100 ml，使每毫升培养基中含琏霉素30ug 五、马铃薯培养基(简称PDA)(培养真菌用) 马铃薯 200g 蔗糖(或葡萄糖) 20g 琼脂 15-20g 水 1000ml pH 自然 马铃薯去皮，切成块煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至 1000ml。121?灭菌30min。 六、麦芽汁琼脂培养基 取大麦或小麦若干，用水洗净，浸水6-12h，至15?阴暗处发芽，上盖纱布一块，每日 早、中、晚淋水一次，麦根伸长至麦粒的两倍，即停止发芽，摊开晒干或烘干，贮存备用。 2、将干麦芽磨碎，一份麦芽加四份水，在65?水浴锅中溶化3-4h，糖化程度可用碘滴 定之。 3、将糖化液用4-6层纱布过滤，滤液如浑浊不清，可用鸡蛋白澄清，方法是将一个鸡 蛋白加水约20ml，调匀之生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后在过滤。 4、将滤液稀释到5-6波美度，pH约6.4，加入2%琼脂即成。 121?灭菌20min。 七、无氮培养基(自生固氮菌、钾细菌) 甘露醇(或葡萄糖) 10g KH2PO4 0.2g MgSO4?7H2O 0.2g NaCl 0.2g CaSO4?2H2O 0.2g CaCO3 5g 蒸馏水 1000ml pH 7.0-7.2 113?灭菌30min。 八、半固体肉膏蛋白胨培养基 肉膏蛋白胨液体培养基 100ml 琼脂 0.35-0.4g pH 7.6 121?灭菌30min。 九、合成培养基 (NH4) 3PO4 1g KCl 0.2g MgSO4?7H2O 0.2g 豆芽汁 10ml 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml pH 7.0 加12ml0.04%的溴甲酚紫(pH5.2-6.8，颜色由黄变紫，作指示剂)。121?灭菌20min。 十、豆芽汁蔗糖(或葡萄糖)培养基(适用于霉菌、酵母菌) 黄豆芽 100g 蔗糖(或葡萄糖) 50g 水 1000ml pH 自然 称新鲜豆芽100g，放入烧杯，加水1000ml，煮沸30min，用纱布过滤。用水补足原量， 再加入蔗糖(或葡萄糖)50g，煮沸溶化。121?灭菌20min 十一、油脂培养基 蛋白胨 10g 牛肉膏 5g NaCl 5g 香油或花生油 10g 1.6%中性红水溶液 1ml 琼脂 15~20g 蒸馏水 1000ml pH 7.2 121?灭菌20min 注:1.不能使用变质油。 2.油和琼脂及水先加热。 3.调好pH后，再加入中性红。 4.分装时，不断搅拌，使油均匀分布于培养基中。 十二、淀粉培养基(淀粉水解试验用) 蛋白胨 10g NaCl 5g 牛肉膏 5g 可溶性淀粉 2g 蒸馏水 1000ml 琼脂 15~20g 121?灭菌20min。 十三、明胶培养基(明胶液化试验用) 牛肉膏蛋白胨夜 100ml 明胶 12~18g pH 7.2~7.4 在水浴锅中将上述成分溶化，不断搅拌。溶化后调pH7.2~7.4. 121?灭菌30min。 十四、蛋白胨水培养基(吲哚试验用) 蛋白胨 10g NaCl 5g 蒸馏水 1000ml pH 7.6 121?灭菌20min 十五、糖发酵培养基 蛋白胨水培养基 1000ml 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1-2ml PH 7.6 另配20%糖溶液(葡萄糖、乳糖、蔗糖等)各10ml。 制法: 1、将上述含指示剂的蛋白胨水培养基(pH7.6)分装于试管中，在每管内放一倒置的小 玻璃管(Durham tube)，使充满培养液。 2、将已分装好的蛋白胨水和20%的各种糖溶液分别灭菌，蛋白胨水121?灭菌20min; 糖溶液112?灭菌30min。 3、灭菌后，每管以无菌操作分别加入20%的无菌糖溶液0.5ml(按每10ml培养基中加 入20%的糖液0.5%，则成1%的浓度)。 十六、葡萄糖蛋白胨水培养基(V.P及M.R试验用) 蛋白胨 5g 葡萄糖 5g K2HOP4 2g 蒸馏水 1000ml 将上述各成分溶于1000ml水中，调pH7.0-7.2，过滤。分装试管，每管10ml，112?灭 菌30min。 十七、麦式(Meclary)琼脂(酵母菌) 葡萄糖 1g KCl 1.8g 酵母浸膏 2.5g 醋酸钠 8.2g 琼脂 15-20g 蒸馏水 1000ml 113?灭菌20min。 十八、柠檬酸盐培养基(柠璜酸盐利用试验用) NH4H2OP4 1g K2HOP4 1g KCl 5g MgSO4 0.2g 柠檬酸钠 2g 琼脂 15-20g 蒸馏水 1000ml 1%溴香草酚蓝乙醇溶液 10ml 将上述各成分加热溶解后，调pH6.8，然后加入指示剂，摇匀，用脱脂棉过滤。制成后 为黄绿色，分装试管，121?灭菌20min后制成斜面。注意配制时控制好pH，不要过碱，以 黄绿色为基准。 十九、醋酸铅培养基 pH7.4的牛肉膏蛋白胨琼脂 100ml 硫代硫酸钠 0.25g 10%醋酸铅水溶液 1ml 将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基100ml加热溶解，待冷至60?时加入硫代硫酸钠0.25g;调 至pH7.2，分装与三角瓶中，115?灭菌15min。取出后待冷至55-60?，加入10%醛酸铅水 溶液(无菌的)1ml，混匀后倒入灭菌试管或平板中。 二十、血琼脂培养基 pH7.6的牛肉膏蛋白胨琼脂 100ml 脱纤维羊血(或兔血) 10ml 酱牛肉膏蛋白胨琼脂加热溶化，待冷至50?时，加入无菌脱纤维羊血(或兔血)摇匀 后倒平板或制成斜面。37?过夜检查无菌生长即可使用 二十一、玉米粉蔗糖培养基 玉米粉 60g KH2PO4 3g 维生素B1 100mg 蔗糖 10g MgSO4?7H2O 1.5g 1000ml 水 121?灭菌30min，维生素B1单独灭菌15min后另加。 二十二、酵母膏麦芽汁琼脂 麦芽粉 3g 酵母浸膏 0.1g 水 1000ml 121?灭菌20min。 二十三、玉米粉综合培养基 玉米粉 5g KH2PO4 0.3g 酵母浸膏 0.3g 葡萄糖 1g MgSO4?7H2O 0.15g 水 1000ml 121?灭菌30min。 二十四、棉籽壳培养基 棉籽壳50%、石灰粉1%，过磷酸钙1%，水65%-70%，按比例称好料，充分拌均匀后装瓶， 较薄地平摊盘上。 二十五、复红亚硫酸钠培养基(远藤氏培养基) 蛋白胨 10g 乳糖 10g K2HPO4 3.5g 琼脂 20-30g 蒸馏水 1000ml 无水亚硫酸钠 5g左右 5%碱性复红乙醇溶液 20ml 先将琼脂加入900ml蒸馏水中，加热溶解，再加入磷酸氢二钾及蛋白胨，使溶解，补足 蒸馏水至1000ml，调pH至7.2-7.4。加入乳糖，昏君溶解后，115?灭菌20min。称取亚硫 酸钠置一无菌空试管中，加入无菌水少许使溶解，再在水浴中煮沸10min后，立刻滴加于 20ml 5%碱性复红乙醇溶液中，直至深红色褪成淡粉红为止。将此亚硫酸钠与碱性复红的混 合液全部加至上述已灭菌的并仍保持溶化状态的培养基中，充分混匀，倒平板，放冰箱备用。 贮存时间不宜超过2周。 二十六、伊红美蓝培养基(EMB培养基) 蛋白胨水琼脂培养基 100ml 20%乳糖溶液 2ml 伊红水溶液 2ml 2% 0.5%美蓝水溶液 1ml 将已灭菌的蛋白胨水琼脂培养基(pH7.6)加热溶化，冷却至60?左右时，再把已灭菌 的乳糖溶液、伊红水溶液及美蓝水溶液按上述量以无菌操作加入。摇匀后，立即倒平板。乳 糖在高温灭菌易被破坏必须严格控制灭菌温度，115?灭菌20min。 二十七、乳糖蛋白胨培养液(“水的细菌学检查”用) 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 乳糖 5g NaCl 5g 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml 蒸馏水 1000ml 将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及NaCl加热溶解于1000ml蒸馏水中，调pH7.2-7.4。加入1.6% 溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混匀，分装于有小倒管的试管中。115?灭菌20min。 二十八、石蕊牛奶培养基 牛奶粉 100g 石蕊0.075g 水1000ml pH6.8 121?灭菌15min。 二十九、LB(Luria-Bertani)培养基 蛋白胨 10g 酵母膏 5g NaCl 10g 蒸馏水 1000ml pH 7.0 121?灭菌20min。 三十、基本培养基 K2HPO4 10.5g KH2PO4 4.5g (NH4)2SO4 1g 柠檬酸钠?2H2O 0.5g 蒸馏水 1000ml 121?灭菌20min。 需要时灭菌后加入: 20%) 10ml 糖( 维生素B1(硫胺素)(1%) 0.5ml MgSO4?7H2O(20%) 1ml 链霉素(50mg/ml)4ml，终浓度200ug/ml 氨基酸(10mg/ml)4ml，终浓度40ug/ml pH 自然(—0.7) 三十一、庖肉培养基 1、取已去肌膜、脂肪之牛肉500g，切成小方块，置1000ml蒸馏水中，以弱火煮1h， 用纱布过滤，挤干肉汁，将肉汁保留备用。将肉渣用绞肉机绞碎，或用刀切成细粒。 2、将保留的肉汁加蒸馏水，使总体积为2000ml，加是蛋白胨20g，葡萄糖2g，氯化钠 5g，机绞碎的肉渣，置烧瓶摇匀，加热使蛋白胨溶化。 3、取上层溶液测量pH，并调整其达到8.0，在烧瓶壁上用记号笔标示瓶内液体高度， 121?灭菌15min后补足蒸发的水分，重新调整pH为8.0，在煮沸10-20min，补足水量后调 整pH7.4。 三十二、硝酸盐培养基(硝酸盐还原试验用) 肉汤蛋白胨培养基 1000ml KNO3 1g pH 7.0-7.4 制法:将上述成分加热溶解，调pH7.6过滤，分装试管，15磅/英寸,，灭菌20分钟。 三十三、H2S试验用培养基 蛋白胨 20g NaCl 5g 柠檬酸铁铵 0.5g Na2S2O3 0.5g 琼脂 15-20g 蒸馏水 1000ml pH 7.2 制法:先将琼脂、蛋白胨溶化，冷却到60?加入其它成分。分装试管，8磅/英寸,， 灭菌15分钟备用。 三十四、丁酸菌培养基(用于厌氧培养基) 蛋白胨 10g 牛肉膏 5g 葡萄糖 30g NaCl 0.5g (NH4)2SO4 1g 4?7H2O 0.1g FeSO MgSO4?7H2O 0.3g CaCO3 30g 蒸馏水 1000ml pH 自然 5.8*10000Pa灭菌20min，加2% 琼脂即在体培养基。 三十五、RCM培养基(强化梭菌培养基(用于厌氧菌培养)) 酵母膏 3g 牛肉膏 10g 蛋白胨 10g 可溶性淀粉 1g 葡萄糖 5g 半胖氨基酸 0.5g NaAc 3g NaCl 3g 蒸馏水 1000ml pH 8.5 刃天青 3mg/L 121?湿热灭菌30min。 三十六、TYA培养基(用于厌氧菌培养) 葡萄糖 40g 牛肉膏 2g 酵母膏 2g 胰蛋白胨 6g FeSO4?7H2O 0.01g 醋酸铵 3g 蒸馏水 1000ml KH2PO4 0.5g pH 6.5 MgSO4?7H2O 0.2g 121?湿热灭菌30min。 三十七、玉米璆培养基 玉米粉 65g 自来水 1000ml 混匀，煮10min成糊状，pH自然，121?湿热灭菌30min。 三十八、无碳基础培养基 (NH4)2SO4 5g CaCl2 0.1g KH2PO4 1g 酵母膏 0.2g 1000ml NaCl 0.1g 蒸馏水 MgSO4?7H2O 0.5g pH 6.5 加入2%水洗琼脂即成固体培养基。于6.86*1000pa压力下灭菌20min。此培养基适用于 则定酵母菌对碳源的利用(加待测碳源2%) 三十九、无氮基础培养基 葡萄糖 20g K2HPO4 1g MgSO4?7H2O 0.5g 酵母膏0.5g或20%豆芽汁 20ml 水洗琼脂20g 无氮蒸馏水 1000ml pH 6.5 于6.86*1000pa压力下灭菌20min。此培养基适用于则定酵母菌对氮源的利用(加被测 氮源0.5%)。 四十、乳糖胆盐发酵培养基(大肠菌群检验) 蛋白胨 20g 乳糖 10g 猪胆盐 5g 0.04%溴甲酚紫水溶液 25ml 蒸馏水 1000ml PH 7.4 将蛋白胨、乳糖、猪胆盐加热溶解于1000ml蒸馏水中，调pH至7.2-7.4,加入0.04% 溴甲酚紫25ml，充分混匀，分装于有小倒管的试管中。115?灭菌20min。 附录? 试剂和溶液的配制 一、3%酸性乙醇溶液 浓盐酸 3ml 95%乙醇 97ml 二、中性红指示剂 中性红 0.04g 95%乙醇 28ml 蒸馏水 72ml 中性红pH6.8-8颜色由红变黄，常用浓度为0.04% 三、淀粉水解试验用碘液(卢格氏碘液) 碘片 1g 碘化钾 2g 蒸馏水 300ml 先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足量水即可 四、溴甲酚紫指示剂 溴甲酚紫 0.04g 0.01mol/LNaOH 7.4ml 蒸馏水 92.6ml 溴甲酚紫pH5.2~6.8，颜色由黄变紫，常用浓度为0.04% 五、溴麝香草酚蓝指示剂 溴麝香草酚蓝 0.04g 0.01mol/LNaOH 6.4ml 蒸馏水 93.6ml 溴麝香草酚蓝pH6.0~7.6颜色由黄变蓝，常用浓度为0.04% 六、甲基红试剂 甲基红(Methyl red) 0.04g 95%乙醇 60ml 蒸馏水 40ml 先将甲基红溶于95%乙醇中然后加入蒸馏水即可 七、V.P.试剂 1.5%α-萘酚无水乙醇溶液 5g α-萘酚 100ml 无水乙醇 2.40%KOH溶液 KOH 40g 蒸馏水 100ml 八、吲哚试剂 对二甲基氨基苯甲酸 2g 95%乙醇 190ml 浓盐酸 40ml 九、格里斯氏(griess)试剂 A液:对氨基苯磺酸 0.5g 10%稀盐酸 150ml B液:α-萘胺 0.1g 蒸馏水 20ml 10%稀盐酸 150ml 十、二苯胺试剂 对苯胺0.5g溶于100ml浓硫酸中，用20ml蒸馏水稀释 十一、阿氏(Alsever)血液保存液 柠檬酸三钠?2H2O 8g 柠檬酸 0.5g 无水葡萄糖 18.7g NaCl 4.2g 蒸馏水 1000ml 将各成分溶于蒸馏水后，用滤纸过滤，分装，115?灭菌20min，冰箱保存备用 十二、肝素溶液 用生理盐水将肝素分别稀释成25单位/毫升和200单位/毫升，配好后，115?10min高压灭 菌，置4?下备用，大约12.5单位肝素可抗凝1ml全血 十三、PH8.5离子强度0.075mol/L巴比妥缓冲液 巴比妥 2.76g 巴比妥钠 15.45g 蒸馏水 1000ml 十四、1%离子琼脂 琼脂粉 1g 巴比妥缓冲液 50ml 蒸馏水 50ml 1%柳硫汞 1滴 去琼脂粉1g先加至50ml蒸馏水中,于沸水浴中加热溶解,然后加入50ml巴比妥缓冲液,再滴 加一滴1%柳硫汞溶液防腐,分装试管内,放冰箱中备用 十五、质粒制备、转化和染色体DNA提取的溶液配制 葡萄糖 50mol/L Tns-Hcl(8.0) 25mol/L EDTA 10mol/L 溶液可配成100ml，121?灭菌15min，4?贮存 2.溶液?(新鲜配制) NaOH 0.2mol/L SOS 1% 3.溶液?(100ml，pH4.8) 5mol/KAc 60ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml 配制好的溶液?含3mol/L钾盐和5mol/L醋酸 4.溶液? 酚:氯仿:异戊醇=25:24:1 5.TE缓冲液 Tris-HCL(pH8.0) 10m mol/L EDTA(pH8.0) 1m mol/L 121?灭菌15min，4?贮存 6.TAE电泳缓冲液100ml Tris碱 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5mol/LEDTA(pH8.0) 100ml 使用时用双蒸馏水稀释50倍 7.凝胶加样缓冲液100ml 溴酚蓝 0.25g 蔗糖 40g 8(1mg/mL溴化乙锭 溴化乙锭 100mg 双蒸水 100ml 溴化乙锭是强锈变剂,配制时要带手套，一般由教师配好，盛于棕色瓶中，避光贮存4? 9.5mol/LNaCL 在800ml水中溶解292.2gNaCl加水定容到1L,分装后高压灭菌 10.CTAB/NaCl 溶解4.1gNaCl于80ml水中,缓慢加CTAB,边加热边搅拌，如果需要，可加热到65?使其溶 解，调最终体积到100ml 11.蛋白酶K(20mg/ml) 将蛋白酶K溶于无菌双蒸水或5m mol/L EDTA,0.5%SDS缓冲液中 12.1mol/LCaCl2 在200ml双蒸水中溶解54gCaCl2?6H2O，用0.22Цm滤膜过滤除菌，分装成10ml小份，贮 存于-20? 制备感受态时，取一小份解冻，并用双蒸水稀释至100ml，用45Цm的滤膜除菌，然后骤降 至0? 十六、Hanks溶液 以下化学药品均要求化学纯 1. 母液甲 ? NaCl 160g KCl 4g MgCl2?6H20 2g MgSO4?7H20 2g 加800ml蒸馏水 ?CaCl2 溶于100ml双蒸水中 ? 和?混合,加蒸馏水到1000ml,加氯仿2ml,4?保存 母液乙 NaHPO4?12H20 3.04g KH2PO4 1.2g 葡萄糖 20g 0.4%酚红溶液 100ml 加双蒸馏水至1000ml,加氯仿2ml,4?下保存,或115?10min高压灭菌 3.使用液 取甲乙液各100ml混合,加双蒸馏水1800ml,分装小瓶,115?10min灭菌,保存4?下备用。 十七、其他细胞悬液的配制 1、1%鸡红细胞悬液 取鸡翼下静脉血,注入含灭菌阿氏液玻璃瓶内,使血与阿氏的比例为1:5,放冰箱中保存2~4 周,临用前取适量鸡血,用无菌生理盐水洗涤,离心,清出生理盐水,如此反复洗涤三次,最后 一次离心使成积压红细胞,然后用生理盐水配成1%.供吞噬实验室用 2、白色葡萄球菌菌液 白色葡萄球菌接终于肉汤培养基中,37?温箱培养12h左右,置水浴中加热100?,10min杀死 细菌,用无菌生理盐水配置成每毫升含6亿个细胞,分装于小瓶中,置冰箱保存备用. 附录? 常用微生物名称 Aspergillus niger 黑曲霉 Aspergillus sp. 曲霉 Aspergillus flavus 黄曲霉 Aspergillus parasiticus 寄生曲霉 Aspergillus faecalis 粪产碱杆菌 Azotobacter chroococcum 褐球固氨菌 Bacillus ceteus 蜡状芽孢杆菌 Bacillus mucilaginosua 胶冻样芽孢杆菌 Bacillus mycoides 状芽孢杆菌 Bacillus subitilis 枯草芽孢杆菌 Bacillus sphaericus 球形芽孢杆菌 Bacillus stearothermophilus 嗜热脂肪芽孢杆菌 Bacillus thuringiensis 苏云金芽孢杆菌 Candida albicaus 白假丝酵母 Ceotrichum candidum 白地酶 Clostridium butyricum 丁酸梭菌 Corynebacterium xerosis 干燥棒杆菌 Escherichia coli 大肠埃希氏菌 Enterobacter aerogenes 产气肠杆菌 Halobacterium salinarium 盐沼盐杆菌 Halobacterium halobium 盐生盐杆菌 Influenza virus A 甲型流感病毒 Lactobacillus bulgaricus 保加利亚乳杆菌 Micrococcus luteus 藤黄微球菌 Mucor sp. 毛霉 Mycobacteium phlei 草分支杆菌 Newcastle-disease virus 鸡新城疫病毒 Penicillium sp. 青霉 Penicillium chrysogenum 产黄青霉 Penicillium griseofuvum 灰棕黄青霉 Pleurotus ostreatus 侧耳(平菇) Proteus vulgaris 普通变形杆菌 Pseudomonas sp 假单胞菌 Staphylococcus aureus 金黄色葡萄球菌 Pseudomonas savastanoi 萨氏假单胞菌 Rhizopus sp. 根霉 Saccharomyces carlsbergensis 卡尔酵母 Saccharomyces cerevisise 酿酒酵母 Serratia marcescens 粘粒沙雷氏菌 Staphylococcus albus 白色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 金黄色葡萄球菌 Streptomyces fradiae 费氏链霉菌 Streptomyces glauca 青色链霉菌 Streptomyces griseus 灰色链霉菌 Streptomyces microflavus 细黄链霉菌(5406放线菌) Vaccinia virus 豆苗病毒(牛痘病毒) 附录? 洗涤液的配制与使用 (1) 洗涤液的配制 洗涤液分浓溶液与稀溶液两种，配方如下: 浓溶液 重铬酸钠或重铬酸钾(工业用) 50g 自来水 50ml 浓硫酸(工业用) 800ml 稀溶液 重铬酸钠或重铬酸钾(工业用) 50g 自来水 850ml 浓硫酸(工业用) 100ml 配法都是将重铬酸钠或重铬酸钾先溶解于自来水中，可慢慢加温，使溶解，冷却后徐徐加 入浓硫酸，边加边搅动。 配好后的洗涤液应是棕红色或橘红色，贮存于有盖容器内。 (2)原理 重铬酸钠或重铬酸钾与硫酸作用后形成铬酸(chronic acid)。铬酸的氧化能力极 强，因而此液具有极强的去污作用。 (3)使用注意事项 ?洗涤液中的硫酸具有强腐蚀作用，玻璃器板浸泡时间太长，会使玻璃变质，因此切忌 到时忘记将器板取出冲洗。其次，洗涤液若沾污衣服和皮肤应立即用水洗，再用苏打水或氨 液洗。如果溅到桌椅上，应立即用水洗去或湿布抹去; ?玻璃器板投入前，应该尽量干燥，避免洗涤液稀释。 ?此液的使用仅限于玻璃和瓷质器板，不适于金属和塑料器板。 ?有大量有机质的器板应先行擦洗，然后再用洗涤液。这是因为有机质过多，会加快洗 涤液失效。此外，洗涤液虽然为很强的去污剂，但也不是所有的污迹都可以清除。 ?盛洗涤液的容器应始终加盖，以防氧化变质。 ?洗涤液可反复使用，但当其变为墨绿色时即已失效，不能再用。 实验一、紫外线诱变育种—绘制细胞存活率和突变率曲线 (一)实验目的 学习理解诱变剂对微生物的杀菌和诱变双重生物学效应，学习紫外线诱变的方法以及测定诱变剂量最适剂量的方法 (二)原理 微生物的生物学效应主要是它能引起DNA结构的变化造成的。 紫外线具有杀菌和诱变双重生物学效应。随着照射时间的增长，杀菌率和突变率随之提高。但照射继续增加到一定程度时，其杀菌率也随之增大，而突变率却降低/ 紫外线强度单位(剂量)为尔格/毫米2，由于测定困难，在实际诱变育种中，常用紫外线照射时间或细胞的死亡率表示相对剂量，其中以细胞死亡率表示方法具有实际意义。 以照射时间为横坐标，细胞存活率或死亡率为纵坐标作图，突变率最高值相对应的细胞死亡率即为最适剂量。 (三)实验材料 大肠杆菌(E.coli) 肉汤培养基，细胞基本培养基，生理盐水，诱变箱，磁力搅拌器，离心管，培养皿等。 (四)方法与步骤 1(菌体的培养 取斜面菌种两环，接种于盛有40毫升肉汤培养基的250毫升三角瓶中，37?，200r/min振荡培养12,16小时。取2毫升培养液转接入另一只盛有40毫升肉汤培养基的250毫升三角瓶中，37?，200r/min振荡培养2,4小时，使细胞培养处于对数增值期状态。 2(细菌悬浮液的制备 取10毫升培养液，离心(3500r.p.m，10分钟)收集菌体，沉淀用10毫升生理盐水洗涤离心2次，之后将菌体充分悬浮于12毫升生理盐水中。 ,1 3(活菌计数法测定细胞悬浮液浓度 取1毫升细胞悬浮液，逐步稀释为10、,2,310、10„。取在最后三个稀释度菌液各1毫升，置于平皿中，然后倾入15毫升融化并冷却至45,50?的肉汤固体培养基，充分混匀，凝固后置于37?培养1,2天，计数每皿菌落(每个稀释度做三个平行)。按下式计数每毫升细胞悬浮菌体浓度。 细胞数(个/毫升),菌落数(三皿平均值)?稀释倍数。 4(诱变处理 (1)取10毫升菌液于φ90培养皿中(带有磁性)，将皿放置于诱变箱的磁力搅拌器上。 (2)开启紫外灯，预热20分钟后，开启磁力搅拌器，打开皿盖，分别照射15、30、45、60、75、90、105、120秒。 (3)去不同时间诱变处理菌液1毫升，按照3的方法作适当稀释，测定处理液中存活细胞浓度(每时间作3个稀释度，酶稀释度作3皿平行)。将结果填入表1,1。 (4)取4((3)同样的稀释菌液1毫升，置于平皿中，倾入融化并冷却至45,50?的细菌基本培养基15毫升，充分混匀，凝固后置于37?培养1,2天，计算每皿菌落数(每稀释度作3个平行)。之后计数每毫升处理液中的突变细胞浓度。将结果填入表1,2。 表1,1 紫外线对细胞致死率的影响 照射时稀释 平均菌数(个/毫升) 细胞浓致死率间 度 度平均(,) 1 2 3 值(个/ 毫升) 15秒 1( 2( 3( 30秒 1( 2( 3( 45秒 , 120秒 对照 1( (处理2( 前) 3( 表1,2 细胞突变率 照射时稀释 平板菌落(个/毫升) 突变细胞浓度 突变率(,) 间 度 (个/毫升) 1 2 3 对照 1( 0 (处理2( 前) 3( 15秒 30秒 45秒 60秒 , 120秒 实验二 营养缺陷型的筛选与鉴定 (一)实验目的和内容 目的:学习营养缺陷型的筛选与鉴定方法，了解营养缺陷型在生命科学研究中的应用 内容: 1. 细胞或分生孢子的诱变处理 2. 营养缺陷型的浓缩 3. 营养缺陷型的挑出 4. 营养缺陷型的鉴定 二 实验材料和用具 大肠杆菌(E.coli) 细菌基本培养基、LB培养基(固体和液体)、PB缓冲液(Ph7.0)、氨苄青霉素、氨基酸、碱基混合物、维生素混合物。 台式离心机、多用振荡器、磁力搅拌器、紫外灯(30W)、离心管、各种试管、培养皿、三角瓶、接种环、酒精灯、无菌牙签、涂布器 一 操作步骤 (一)细菌悬液的制备 取一环E.coli斜面菌种划线接种在LB固体平板上。37?培养12-16h，挑取单菌落接入装有3mLLB液体培养基的试管中，37?，200r/min培养12-16h,取此培养液0.5mL接入含有50mLLB液体培养基的250mL三角瓶中，37?，200r/min培养24小时(培养至对数期)，将培养液离心(3000r/min，10分钟)弃上清，菌体用PB离心洗涤两次(离心条件同前)，最后用PB悬浮细胞，菌落计数器计数， 78使细胞浓度控制在10-10/mL (二)诱变处理 取上述菌悬液2mL于小培养皿(直径6cm，内涵搅拌子)中，将培养皿放置 在磁力搅拌器上，再搅拌状态下接受紫外照射2-5min(紫外灯30W，距离 30cm)，照射完毕立即离心，收集细胞，并避光保存。 (三)营养缺陷型的浓缩 将上述诱变处理过的细菌细胞接入含有50mLLB培养基的250mL三角瓶中，37?200r/min培养2-4h，离心收集细胞，并用培养基洗涤两次，用4mL基本培养基悬浮细胞，取2mL细胞悬液接入50mL含有氨苄青霉素(终浓度20-60μg/mL)的基本培养基中，37?200r/min培养3-4h，离心，取沉淀，用PB洗涤两次后用PB制成细胞悬液，并用PB适当稀释，取100-200μL稀释液涂LB固体平板37?培养12-16h. (四)营养缺陷型的挑选 将LB平板上形成的每个菌落用无菌牙签分别点种在基本培养基和LB固体培养基的相应位置上，37?培养12-16h.将在LB培养基上生长而在基本培养基上不生长的菌落继续接种在基本培养基和LB固体培养基的相对位置上，如此传代5-6次，最后在LB上生长而在基本培养基相应位置上不生长的菌落即可确定为营养缺陷型菌株 (五)营养缺陷型的鉴定 68把挑出的缺陷型用PB悬浮制成菌悬液(10-10/mL)，取100-200μL涂布在固体基本培养基的表面，待表面干燥后，在标定位置上放置少量氨基酸、碱基或维生素的结晶(或滤纸片)，37?培养12-16h.缺陷型在所需的化合物周围出现混浊的生长圈。现一般把几种化合物编为一组，按表42-1进行测定 表42,1 营养缺陷型检测分组表 组别 化合物代号 A 1 7 8 9 10 11 B 2 7 12 13 14 15 C 3 8 12 16 17 18 D 4 9 13 16 19 20 E 5 10 14 17 19 21 F 6 11 15 18 20 21 按上表可在一个培养皿上测定出一个营养缺陷型菌株对21种化合物的需要情况。如若在放有C组化合物的周围出现生长圈，则这一化合物缺少化合物3。如若在C组和D组位置周围都出现生长，则这一缺陷型所需要的化合物是16，如若在C组和D组之间出现生长，说明这一缺陷型同时需要C.D两组化合物中的各一种，具体是那两种，尚需经一步鉴定。 (四)注意事项 1(紫外诱变后要避光培养。 2(操作的各个环节要无菌操作。 (五)实验报告 1(绘制营养缺陷型挑选的简图。 2(试述营养缺陷型浓缩的机理是什么。 (六)问题与思考 1(营养缺陷型挑选时应注意哪些问题, 2(试设计一实验，如何获得Aspergillus niger的营养缺陷型。 -3(试设计一实验，如何能获得E.coli的丙氨酸营养缺陷型(Ala)