猪肝中维生素B12的检测和提取研究

猪肝中维生素B12的和提取研究 猪肝中维生素B12的检测和提取研究 摘 要 目的:维生索B1于医药、食品和畜牧业，工业化生产维生綮B1微2广泛应用2主要通过‎‎生物发酵。动物源食品富古维生索，如内脏、肝、肾、牛乳及蛋黄B。通过对猪12 肝中维生素B12的检测，了解到猪肝中维生素B12的量，从而可以清楚的通过摄取猪肝的量来维持人体内维生素B12的量。 方法: 1(原子吸收法测定维生素B12的量: 维生素B12分子中含有钴原子，采用原子吸收分光光度计可以测定维生素B12中的钴含量，再通过质量换算即可得到维生素B12的含量。 2(大孔树脂吸附法(CAD45)提取维生素样品中的: B12 张玉明的研究发现，CAD45树脂在pH为7时对羟基钴胺素具有良好的吸附能力，并且使用50,乙醇(pH=2)溶液可以作为良好的洗脱剂，静态洗脱率高达99,以上。 3. 使用高效液相色谱法检测其中羟基钴胺素的量: 用HPLC，采用乙腈和醋酸钠缓冲液为流动相能快速测定羟基钴胺素的量，从而确定维生素B12 的提取率。 关键词:维生索B1;羟基钴胺素;大孔树脂吸附法;原子吸收法;高效液相色2 谱法 Detection and extraction of the liver in vitamin B12 Abstract Objective: Vit B12 is widely used in medicine, food and livestock, industrial production of subsistence embroidered banner B12 mainly through microbial fermentation. Food of animal origin, rich in ancient Vit B12, such as offal, liver, kidney, milk and egg yolk. Understand the amount of vitamin B12 in the liver in the detection of vitamin B12 in the liver in, which can clearly maintain the human body the amount of vitamin B12 uptake of the liver volume. Methods: 1.The atomic absorption method for the determination of the amount of vitamin B12: Vitamin B12 molecules containing cobalt atoms by atomic absorption spectrophotometer can determine the content of cobalt in vitamin B12, vitamin B12 can be obtained through quality conversion. 2. Macroporous resin adsorption (CAD45) extract vitamin samples B12: The Yuming the studies have found that The CAD45 resin at pH 7:00 hydroxy-cobalamin prime has a good adsorption capacity and use 50% ethanol (pH = 2) solution can be used as the eluent, static elution rate of 99% or more . Using high performance liquid chromatography detection of hydroxy-cobalamin 3. amount: By HPLC, using acetonitrile and sodium acetate buffer as the mobile phase to rapid determination of the amount of hydroxy-cobalamin in order to determine the extraction rate of vitamin B12. Keywords: Vit B12 and; hydroxy cobalamin; macroporous resin adsorption; atomic absorption spectrometry; high performance liquid chromatography. 目 录 1 绪论.............................................................. 1 1.1 人工合成维生素B12: ............................................ 1 1.2 维生素B12的特点:.............................................. 1 1.2.1 物理特点...................................................... 2 1.2.2 分子结构特点.................................................. 2 1.3 维生素B12 生理作用 ............................................. 2 1.4 维生素B12 病理 ................................................. 3 1.5 维生素B12吸收代谢.............................................. 3 来源................................................ 5 1.6 维生素B12的 1.6.1 工业废液中提取维生素B12....................................... 5 1.6.2 污泥中提取维生素B12 .......................................... 5 1.6.3 微生物纯种发酵................................................ 5 1.6.4 混合培养发酵生产.............................................. 6 2.实验材料与仪器.................................................... 6 2.1实验材料、试剂 .................................................. 6 实验仪器........................................................ 6 2.2 3 实验方法和步骤.................................................... 6 3.1 样品的预处理.................................................... 6 3.2 原子吸收法测定维生素B12......................................... 6 3.2.1 钴的溶液配置.............................................. 6 3.2.2工作曲线的绘制 ................................................ 6 3.2.3 样品的分析.................................................... 6 3.2.4 数据处理...................................................... 6 3.2.5 讨论.......................................................... 6 3.3大孔树脂吸附法(CAD45)提取维生素样品中的B12.................... 7 3.3.1 引言.......................................................... 7 3.3.2 树脂的预处理.................................................. 7 3.3.3 CAD45树脂的吸附实验........................................... 8 3.4 使用HPLC检测其中羟基钴胺素的量................................. 8 3.4.1 标准品的制备.................................................. 8 .................. 8 3.4.2 色谱操作条件................................ 3.4.3 标准曲线的绘制................................................ 8 3.4.4 羟基钴胺素样品的测定.......................................... 8 3.4.5 讨论.......................................................... 9 参考文献:.........................................错误～未定义书签。 致 谢..............................................错误～未定义书签。 1.绪论 维生素B1:(Vitamin B。VB。，)又称钴胺素(cobalamJn)，是一类含有钴21212 的岵啉娄台物总称。1926年Minor和Murphy从肝脏抽提物中发现了维生素B。并发现其町吼疗恶性贫血病，为此他们获得了1934年诺贝尔医学奖。;1948年Ricke和smlth从脏提取物中分离出维生素晶体;B11956年剑桥大学的Dorothy 2 [1]Hodgkin用x射线法明了其晶体结构。 1.1 人工合成维生素B12: 1960,1972年，由美国的woodward小组和瑞士的，Eschenmoser小组同努力，完成了维生素B12的化学合成工作。 1965年，伍德沃德因在有机合成方面的杰出贡献而荣获诺贝尔化学奖。获奖后，他并没有因为功成名就而停止工作。而是向着更艰巨复杂的化学合成方向前进“。他组织了14个国家的110位化学家，协同攻关，探索维生素B12的人工合成问题。在他以前，这种极为重要的药物，只能从动物的内脏中经人工提炼，所以价格极为昂贵，且供不应求。 维生素B1，的结构极为复杂，伍德沃德经研究发现，它有181个原子，在2 空间呈魔毡状分布，性质极为脆弱，受强酸、强碱、高温的作用都会分解，这就给人工合成造成极大的困难。伍德沃德设计了一个拼接式合成方案，即先合成维生素B12的各个局部，然后再把它们对接起来。这种方法后来成了合成所有有机大分子普遍采用的方法。 合成维生素B12过程中，不仅存在一个创立新的合成技术的问题，还遇到一个传统化学理论不能解释的有机理论问题。为此，伍德沃德参照了日本化学家福井谦一提出的“边界电子论”，和他的学生兼助手霍夫曼一起，提出了分子轨道对称守恒原理，这一理论用对称性简单直观地解释了许多有机化学过程，如电环合反应过程、环加成反应过程、σ键迁移过程等。该原理指出，反应物分子外层轨道对称一致时，反应就易进行，这叫“对称性允许”反应物分子外层轨道对称性不一致时，反应就不易进行，这叫“对称性禁阻”。分子轨道理论的创立，使霍夫曼和福井谦一共同获得了1981年诺贝尔化学奖。因为当时，伍德沃德已去世2年，而诺贝尔奖又不授给已去世的科学家，所以学术界认为，如果伍德沃德还健在的‎‎话，他必是获奖人之一，那样，他将成为少数两次获得诺贝尔奖金的科学家之一。 伍德沃德合成维生素B时，共做了近千个复杂的有机合成实验，历时1112 年，终于在他谢世前几年实现了，完成了复杂的维生素工作。B 的合成12 1 1.2维生素B12的特点: 1.2.1 物理特点 维生素B1，为深红色的针状结晶或结晶粉末，无固定熔点，于210?,220?2 时变暗，在320?仍不熔融，无特殊气味，具有较强的引湿性。维生素溶于B12水、乙醇和甲醇(不溶于氯仿、丙酮和乙醚，其水溶液呈中性[1]。维生素B12在 液中耐热、酸(100?灭菌30分钟或在121?灭菌15分钟不失活。维生素。B1中性溶2 在pH值为4,7刚最稳定;在pH值小于2及很低的浓度(0.2~10mg,L)时活性缓 [2]慢丧失;当pH值为9时，氰基钴胺索发生分解，脱去氰基而形成羟基钴 胺1.2.2 分子结构特点 维生素B12分子最大于1000Da(被称为自然界中生物合成的最复杂的小分 [5]子物质，图1.1是维生素B12的结构示意图。维生索B12分子由三部分组成:中心咕啉环、Coβ配基都分及一个台有核苷酸环的Coα配基。中心咕啉环由相连的四个吡咯和一个钴原子组成，钴鏊合在四个毗咯中心。咕啉环通过氨丙醇与下方的α—ribazole(l-α-D-ribofuranosyl 5，6-dimethylbenzlmda zo1e)相连。α-ribazole中二甲基苯味唑(DMB)的一个氨原子和中心咕啉环的四个氮原子起螫台钻原子的作用。咕啉环轴向上方的配基不同(即Coβ配基不同)，产生不同形式的维生素B12类物质。羟基钴胶囊(hydroxyeobalamin)、氰基钴胺素(cyanocobalamin)、脱氧腺苷钴胺素(deoxyadenosylcoba]amin)和甲基钴胺素(methylcobalamin)是维生素B12主要存在形式。其中氰基钴胺素是在工业提纯 [6]时用氰化物取代天然钴胺素而得到的产，商品形式的物维生素B12多为氰基钻胺素。多种形式的钴胺素在哺乳动物体内会转化为两种生物活性形式:脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素。 图1(1维生囊12分子结构 1.3 维生素B12 生理作用 2 人体中维生素B12具有重要的生理功能。维生素。以辅酶的形B1‎‎式参与体2 DNA合成，促进脂肪及糖类代谢，并且具有维持和产生神经细胞髓鞘的作用。 [3]哺乳细胞中有两个维生素B12依赖的酶:一个是甲硫氨酸合成酶(methionine [4]synthase)，需要利用甲基钴胺素作为辅酶;另一个酶称为甲基丙二酰辅酶A变位酶(methylmalonyl CoA mutase)，利用脱氧腺苷钴胺素形式的作为辅酶。甲硫氨 [5]酸合成酶是连接叶酸循环和同型半胱氦酸(homocysteine)一甲硫氨酸循环的关键酶。甲硫氨酸合成酶失活会导致叶酸假性缺失症，使同型半胱氨酸积累、S一 [6]腺苷一L一甲硫氨酸(S-adenosyl—L”methJonine，SM'Ij的合成。叶酸循环受阻的破坏会直接导致DNA合成的受阻;同型半胱氨酸的积累和SAM的缺乏会导致心血管疾病和神经管畸形(neural tube defectS，NTDs)。甲基丙二酰辅酶A变位酶具有将甲基丙二_二酰辅酶A催化为琥珀酰辅酶A的功能，在单链脂肪酸、氨纂 [7]酸及胆固醇代谢过程中发挥重要作用，因此脱氧腺菅钴胺素缺乏导致的甲基丽二酰辅酶A失活也会引起严重的代谢失衡症。 1.4 维生素B12 病理 维生素B1乏，胸腺嘧啶核苷酸减少，DNA合成速度减慢，而细胞内和叶酸缺2 尿嘧啶脱氧核苷酸(dUMP)和脱氧三磷酸尿苷(dUTP)增多。胸腺嘧啶脱氧核苷三磷酸(dTTP)减少，使尿嘧啶掺合入DNA，使DNA呈片段状，DNA复制减慢，核分裂时间延长(S期和G1期延长)，故细胞核比正常大，核染色质呈疏松点网状，缺乏浓集现象，而胞质内RNA及蛋白质合成并无明显障碍。随着核分裂延迟和合成量增多，形成胞体巨大，核浆发育不同步，核染色质疏松，所谓“老浆幼核”改变的巨型血细胞。巨型改变以幼红细胞系列最显著，具特征性，称巨幼红细胞系列。细胞形态的巨型改变也见于粒细胞、巨核细胞系列，甚至某些增殖性体细胞。该巨幼红细胞易在骨髓内破坏，出现无效性红细胞生成。最终导致红细胞数量不足，表现贫血症状。 1.5 维生素B12吸收代谢 [10,11]维生素B1谢过程十分复杂，维生素B1的循环代谢如图1.2的吸收代在人体内22 所示。游离形式的维生素B1直接吸收，然而食物中的维生素B是呈可被口腔大部分212络合状态的，需要胃酸将其分离。游离存在的维生素B1唾液腺和胃‎‎分泌的会很快与2 糖蛋自结合，这些糖蛋自称为R-binders(或称为触觉咕啉)，它可以保护维生素B1失活。胃中的壁细胞分泌一种称为内因子(intrinsic factor)的糖蛋白，内不在胃中2 因子结合钴胺素并最终使其得到活性吸收。当钴胺素R—binders复合物进入十二 [12]指肠时R-binders会被胰蛋白酶降解，自由形式的‎‎钴胺素与内因子结合。钻胺素一内因子复合物进入小肠中，钴胺素会被特殊的回肠受体因子通过吞噬作用吸收。在小肠中，首先钴胺素一内因子复合物(IF—Cbl)与图肠细胞表面的 3 Cubilin—Megalin复合物结合并完成内吞作用。IF—Cb]--Cubilin—Megalin复合 [13]物进入细胞后，通过内吞泡一溶酶体途径来达到吸收钴胺素的。内吞泡目的(Endosome)的酸性环境导致钴胺素的释放，大部分钴胺素是在溶酶体中得到释放的。自由形式的钴胺素与内质网和高尔基体中合成的转钻胺素lI蛋白(tanscobMami II，。rcII)结合，并且TcII—Cb1复合物位于分泌泡中Tcll--Cbl复合物由分泌泡介导，可穿过细胞膜进入血液循环。TcII携带的钴胺素随血液循环进入细胞中参与机体代谢，剩余的钴胺素由TCIII携带到肝脏中储存。当体内缺乏 [14]钻胺素时，肝脏中的钻胺素又会随胆汁进入肠道继续进行。循环 [15]维生索B1相关的疾病主要有两种:致命性贫血症(Perniccous anaemia 吸收障碍2 PA)和萎缩性胃炎(Atrophic gastritis)。致命性贫血症是一种自身免疫疾病，PA患者会产生壁细胞抗体，使壁细胞失去产生内因子和分泌盐酸的能力;另一种类型的PA患者，其体内壁细胞虽然不受破坏，但会产生针对于内因子的抗体，阻止内因子与钴胺素的结合;还有一种极为罕见的删病例，内因子一钴胺素复合物可以正常产生，但会产生一种阻止回肠受体对钴胺素的吸收PA除了会导致膳食性维生素B12吸收障碍，还会导致机体无法吸收胆汁中分泌的维生索肠循B用对肝12环的破坏，会使机体陷入极度缺乏维生索的状态，从而引起多B1‎‎种维生素B212 发症。萎缩性胃炎(Atrophic gastritis)是一种比PA更为普遍的维生素B缺乏并吸12 [16]碍疾病。萎缩性胃炎患者随着年龄的增长丽增多，胃中壁细胞盐酸分泌能力收障 会逐渐减弱，酸的缺乏会阻止与蛋白质结台的维生素B12的释放，从而导致维生素B12的吸收障碍。 胃: 口腔: , 酶和酸解离与蛋白质结‎‎合钴, 自由形式的钴胺胺素 素可以被直接吸, R-binders 与钴胺素结合 收 , 壁细胞分泌内因子(IF) 肠道上游: 肝脏: , R-binders释放出钴胺素 , 储存钴胺素，并借助胆汁将, IF-Cb1复合物形成 钴胺素分泌至小肠。 肠道下游: , IF-Cb1被回肠细胞接受‎‎因子吸附 , 自由形式钴胺素通过被动扩散直接‎‎ 被吸收 血液: 回肠细胞: , TC?携带钴胺素随血液运输参与, 钴胺素与转钴胺素?蛋白代谢，剩余的钴胺素将与TC?结(TC?)结合 合进入肝脏 , TC?在血液中也是循环利用‎‎的 4 图1.2钴胺素在人体内的循环 1.6 维生素B12的来源 1.6.1 工业废液中提取维生素B12 造纸及乳制品工业废液，酒精、丙酮、丁醇、柠檬酸发酵废液都是生产维生素B。生产上一般是从链霉菌废液中提取，近年来发现庆大霉素发酵液12的原料 中也含有较高浓度的维生素。工业废液中B‎‎维生素B1作为一种发酵副产物122毕竟只是 被利用，远远不能满足医药、食品工业的巨大需求。 1.6.2 污泥中提取维生素B12 采用生物活性污泥法处理的废水中，通常含有较多的维生素B12干的活性 [18]污泥可先用水浸提，然后过滤掉固形颗粒，即可分离、纯化维生素。 B12 从污泥中提取维生索B培养，大大减少了前期投入，但是提取过程较无需前12 为复杂(尤其是浓缩这一关键性步骤会造成巨大的能量损耗。而且受活性污泥这一来源的影晌(提取得到的维生素B1接进入食品或制药工业(通常只并不能直2 局限于饲料添加剂。 1.6.3 微生物纯种发酵 [19]具备合成维生索B12能力的微生物主要为放线菌和细菌。其中放线菌‎‎主要为链霉菌属，主要包括:Streptomyces albidoflavus，抗生素链霉菌(Streptomyces antibioticus)，会霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens)(Streptomyces colombiensis，灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、橄榄色链霉菌(Streptomyces oliva 玫瑰红链霉菌(Streptomyces roseochromogenus)。产生维生紊B12的细菌ceus)、 主要有:黄杆菌(Flavobacterium solare)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megatrium)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、欧式甲烷杆菌(methanobacterium omelianski)、乳酸杆菌(lactobacillus lactis)、腐败梭状芽孢杆菌(Clostriclium putrificum)、瑞氏丁酸杆菌(Butvribac Clum，e rtgeri)、紫色小单孢菌(micromonospora purpurea)、粗皱诺卡氏菌(Noccrdia rugosa)等。此外酵母及某些霉菌，如黑曲霉、链孢霉属、假囊酵母属、棉病囊菌及玉米黑粉菌也具有合成维生素B1的能力。 2 脱氮假单孢菌(Pseudomonas denitrificans)和费氏丙酸杆(Propioniba [21]cTerium Freudenreichil)是广泛应用于工业生产的维生素B。脱氮假单12生产菌 孢菌最早应用于生产，法国RPR(Rhone-Poulene Rorer)实验室利用传统诱变育种方法和基因手段已经成功改造了脱氮假单孢菌，使其产量达到约300mg/l。费氏丙酸杆菌也具有有自己的优点:符合美国FDA的GRAS(general1y [22]recognized as safe)要求，在生长过程中不产生内毒素和外毒可以安全应素 5 用于医药和食品添加剂工业。此外费氏丙酸杆菌发酵过程中几乎不需要通气，具有能耗低、染菌概率小等优势，目前利用赞氏丙酸杆菌发酵生产维生素B12越来越引起人们关注。 1.6.4 混合培养发酵生产 有报道使用费氏丙酸杆菌和巨大芽孢杆菌共同培养生产维生素B12在通气 [23][24]条件下发酵产量有明盟提高。日本学者Miyano使用费氏丙酸杆菌与Ralstonia eutropha混合培养发酵生产维生素。BRalst‎‎onia eutropba生长过程中可12 利用丙酸，解除有机酸对费氏丙酸杆菌生长自身抑制，维生索B1很大提2产量有了高。研究表明培养过程中溶氧控制对维生素B12产量影响很大，如果溶氧从0(5ppm增加到1ppm，维生素B1迅速下降，同时Ralstonia eutropha发酵2产量就会 生成的PHA产量会大幅提高。实质上混合培养发酵就是利用其它微生物分解费氏丙酸杆菌产生的自身代谢抑制物(主要为丙酸)，促进费氏丙酸杆菌生长，从而提高维生素B12发酵产量。 2.实验材料与仪器 2.1实验材料、试剂 猪肝;95%乙醇;EDTA;50%乙醇;NH4OH;钴(分析纯);羟基钴胺素(色谱纯);EDTA; 2.2 实验仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪(二极管阵列检测器); Beckman C(5μm，4(6mm18 ×25cm)色谱柱;Sigma 3K30型高速离心机;CAD45型大孔吸附树脂;原子吸收分光光度计;研钵;剪刀; 3 实验方法和步骤 3.1 样品的预处理 取猪肝两份，各2.5克，用剪刀剪碎，分别置于两个乳钵中进行研磨5分钟，各加95%乙醇5ml，进一步研碎，分别倾入两支离心管离心(3500r.p.m *10 ),保留上清，避光保存，备用。 3.2 原子吸收法测定维生素B12 3.2.1 钴的标准溶液配置: 3.2.1.1 钴的标准溶液(?) 准确称取1g纯钴(含钴99.9%)于250ml的烧杯中，加5mol/L的硝酸3-5ml， 6 使其完全溶解后转移到1000ml的容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。所得的钴标准溶液(?)质量浓度为1mg/ml。 3.2.1.2 钴的标准溶液(?) 取钴的标准溶液(?)5ml于100ml的容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。所得的钴标准溶液(?)质量浓度为50μg/ml。 3.2.2工作曲线的绘制 分别移取钴的标准溶液(?)0.00ml，1.00ml，3.00,ml，4.00ml，5.00ml 于50ml的容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。以零号溶液为空白，选择灯电流为2-5mA，乙炔压力未20KPa的贫燃火焰，在324.7nm的波长位置测量吸光度值。将测得的吸光度值对钴溶液的质量浓度作图，绘出工作曲线。 3.2.3 样品的分析 取其中一样品上清液于小烧杯中，向上清液中加入少量EDTA，用NH4OH掉接PH至7.0，再加入活性炭，用无灰滤纸过滤，维生素B1活性炭上，将活2被吸附在 性炭连同滤纸一起在600?下灰化完全，将剩余的残渣转移到小烧杯里。向小烧杯中加入5mol/L的硝酸将残渣溶解，然后将其容易转移到50ml的容量瓶中， [17] 用蒸馏水稀释至刻度。再用制作工作曲线相同的测量条件测定其吸光度值。3.2.4 数据处理 Co% = [(C样*V样)/ m样] ×100% 3.2.5 讨论 维生素踮分子中含有钴原子，采用原子吸收分光光度计可以测定维生索B12 量，再通过质量换算即可得到维生素B含量。从而可以证‎‎明出猪肝中含有中的钴含12 维生素B。 12 3.3大孔树脂吸附法(CAD45)提取维生素样品中的B12 3.3.1 引言 样品破碎液离心后，上清液中维生素B12含量很低，且含有大量杂质，如细胞碎片、核酸、多糖、杂蛋白等。维生素B1化过程就是逐步去除这些杂质2的提取纯 [8]的过程。工业维生素B12提取工艺中，第一步通常采用大孔树脂吸附，达到初 [9] 步提纯的目的。 经研究表明，维生紊B1可通过光解处理转化为单一稳定的羟基钴 2有效成分 胺素。CAD45树脂在pH为7时对羟基钴胺素具有良好的吸附能力，并且使 [9] 用50,乙醇(pH=2)溶液可以作为良好的洗脱剂，静态洗脱率高达99,以上 7 3.3.2 树脂的预处理 大孔树脂在出厂时一般含有NaCl等物质以防腐，并且生产完成时有部分低聚物，使用前用去离子水充分浸泡树脂，然届充分洗涤树脂至洗出液澄清。去离子水洗涤后使用95,乙醇浸泡4h除去树脂中惰性溶剂，用乙醇充分淋洗，洗至流出液在试管中用水稀释不浑浊时为止，最后用水反复淡涤至无明显乙醇气味后即可。树脂经乙醇清洗后使用酸碱处理:首先加入lmol,L NaOH浸泡4h，再以约4mL,min的流速通过树脂层，再用纯水洗至pH为近中性:然后加入lmol,L HCl浸泡4h，再以约4mL,min的流速通过树脂层，再用纯水洗至pH为 [9]近中性。 3.3.3 CAD45树脂的吸附实验 将样品上清液光解处理，使其中维生素B12有效成分全部转化为羟基钴胺素，使用硫酸讲样品上清液PH值到7.0 。光解后的样品上清液使用HPLC检测其中羟基钴胺素的含量。 将预处理后的CAD45树脂，采用湿法装柱，尽量避免夹带气泡。柱内径16mm，树脂的床体积(BV)为15mL。使用蠕动泵将细胞破碎液(使用硫酸调pH到7，0)以2BV,h的流速过柱。样品上清液过柱完成后，用去离子水洗柱。 用50%乙醇(PH=2)洗脱已经吸附完成的CAD45树脂，以1BV/h的速度进行洗脱，收集0.5—2.5BV的洗脱液。(张玉明等研究表明:用50%的乙醇进行洗脱，当洗脱量为0.5BV时，羟基钴胺素开始被洗脱下来，洗脱量为1.6BV时接近解吸完全，2BV时流出液中不再有羟基钴胺索检出，树脂吸附的羟基钴胺素被完全洗脱下来。)(注:BV=15ml) 3.4 使用HPLC检测其中羟基钴胺素的量 3.4.1 标准品的制备 精密称取0(2000g羟基钴胺素标准品，置于100mL的容量瓶中，用纯净水溶解并稀释至刻度。分别取1mL、2mL、3mL、4mL上述溶液，置于100mL的容量瓶中，用纯净水稀释至刻度，配制成浓度分别为20μg,mL，40μg,mL，60μg g,mL，80μg,mL的标准品溶液，备用。 3.4.2 色谱操作条件 Beckman C(5μm，4(6mmx 25cm)色谱柱;流动相I为乙腈，流动相?为醋18 酸钠缓冲液(使用乙酸调pH至3(6);柱温25?;检测波长254nm;流速1.0mL [9,18] ,min;进样量20μL。洗脱条件:乙腈恒速洗脱。 3.4.3 标准曲线的绘制 8 将不同浓度的标准品溶液经过0(45μm的纤维素滤膜过滤后分别进样。以羟基钴胺素的色谱峰面积A(uV*s)为纵坐标，以腺苷钴胺素的质量浓度W(ms)为横坐标做线型图，得出线性回归方程，记录羟基钴胺素的保留时间。 3.4.4 羟基钴胺素样品的测定 将从CAD45树脂洗脱下来的羟基钴胺素样品转移到100ml的容量瓶中，定容。取样经过0(45μm的纤维素滤膜过滤后分别进样，记录羟基钴胺素样品的色谱峰面积，根据回归方程算出羟基钴胺素样品的质量浓度。 3.4.5 讨论 通过计算出羟基钴胺素的质量浓度来间接测出维生素B12的量，从而知道猪肝中含有的维生素B12的量。本实验用到HPLC测定羟基钴胺素的含量，还可以算出用CAD45树脂的吸附羟基钴胺素的吸附效 率。 9 参考文献: [1] Hodgkin D C，Kamper J，MacKay M，ot a1(Structure of vitamin B12[J](Nature， 1956，(17):64—66( [2] 别列卓夫斯基(维生素化学(北京:中国工业出版社( [3] Scott，J M，Weir D G(Folate,vitamin B12 interrelationships[J](Essays in BJochemi stry，1994，63—72( [4] Sumedha Gulati，Lawrence C B， Ruma B( Posttr8nscriptional Regulation of Mammalian Methionine Synthase by B,2fJ](Biochemical and Biophysical Research Communications，1999，259:436-442( [5] Chanarin I(The Megaloblastic Anaemia 2nd Edition(London(Blackwell Scientific Oxford，1979( [6] Mark L，Ioannis D，Zoe Y(Nutrition Research，2001，21:1357-1362( [7] anerjeel R，Vlasie M(Biochemical Society 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