心复康口服液对压力超负荷大鼠心肌ND4表达的影响

心复康口服液对压力超负荷大鼠心肌ND4表达的影响 1 ～2 11,11345 徐淑乐张刚～曹雪滨～平政～崔英凯～何建成～胡元会～王士雯 12(解放军第252医院心内科，全军老年心血管病研究诊疗中心，河北 保定 071000;北京 34平谷区中医院;上海中医药大学基础医学院，上海201203;中国中医科学院广安门医院心 5 内科，北京100053;解放军总医院老年心血管病研究所 北京 100853) [摘要] 目的 探讨心复康口服液对压力超负荷心衰大鼠心肌线粒体ND4 mRNA和蛋白 表达的影响。方法 240只雄性SD大鼠采用随机数字表法分为3组:假手术组、腹主动脉缩 窄模型组(模型组)、心复康治疗组(治疗组)。采用腹主动脉部分缩窄法制作心衰大鼠模型， RT-PCR检测3组大鼠第4、8、12周心肌线粒体ND4 mRNA表达，Western Blotting检测3组 大鼠第4、8、12周心肌线粒体ND4蛋白表达。结果 ?术后第8周，与假手术组比较，模型 组大鼠ND4 mRNA含量降低(P<0.01)，ND4蛋白含量降低(P<0.01);与模型组比较，治疗组 ND4 mRNA的含量升高(P<0.01)，ND4蛋白含量升高(P <0.05)。?术后第12周，与8周时比 较，模型组大鼠ND4 mRNA含量降低(P<0.05)，ND4蛋白含著降低(P<0.01);与同期模型组比 较，治疗组ND4 mRNA含量升高(P<0.01)，与假手术组比较无差异，较8周时相比亦显著升 高(P<0.01)，治疗组ND4蛋白升高(P<0.01)，与假手术组比较无差异，较8周时相比亦显著升 高(P<0.01)。结论 心复康口服液可上调压力超负荷心衰大鼠心肌线粒体ND4 mRNA的表达， 提高心肌细胞ND4蛋白含量，改善心肌能量生成障碍。 [关键词] 压力超负荷;ND4;心肌能量代谢;心复康口服液 [中图法分类号] R289.5; R322.1; R329.2 [文献标识码] A The effect of Xinfukang Oral Liquid on the expression of ND4 in rat’s myocadial cell in the chronic heart failure 1211134CAO Xue-bin, XU Shu-le, PING Zheng, ZHANG Gang, CUI Ying-kai, HE Jian-cheng, HU Yuan-hui, WANG 5 Shi-wen 1(Department of Cardiology, No.252 Hospital of PLA, Senior Cardiovascular Disease Research and Treatment Center, 23Baoding, 071000; TCM Hospital of Beijing Pinggu District; School of Basic Medical Sciences, Shanghai 4University of Traditional Medicine, Shanghai 201203; Department of Cardiology, Guang’anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing, 100053, China; Senior Cardiovascular Disease Institute of General Hospital of PLA, Beijing, 100853, China) [Abstract] Objective To investigate the effect of Xinfukang Oral Liquid on the expression of ND4 mRNA and Protein of myocardial mitochondria in pressure overload-induced left 基金项目:国家自然科学基金 (30873398);全军医学科研“十一五”科技攻关项目(2006MA064);河北省科技 攻关课(06276012D-114)Supported by the National Natural Science Foundation of China(30873398), Research Project of “Eleventh Five-year Plan”for Medical Science Development of PLA(2006MA064) and the Research Project of Hebei Province(06276012D-114) 作者简介:徐淑乐，男，山东省临沂人，硕士。医师，主要从事充血性心力衰竭病因、治疗等方面的研究， E-mail:xslsuccess@yahoo.cn 通信作者:曹雪滨，电话:(0312)2058548 E-mail:cxb252@yahoo.com.cn 1 ventricular hypertrophy rats. Methods Totally 240 SD rats were randomly divided into 3 groups, sham operation group (SH) (n=80), coarctation of abdominal aorta model group (CAA) (n=80) and model and Xinfukang liquid treatment group (XFK) (n=80). Congestive Heart Failure rat models were made by partly coarctating the abdominal aorta of rats. Expression of ND4 mRNA and protein thththwere observed at the 4, 8 and 12 week after the treatment respectively by RT-PCR and Western thBlotting. Results In CAA group at the 8 week after operation, the content of ND4 mRNA and ND4 protein were both decreased compared with SH group(P<0.01); content of ND4 mRNA (P<0.01) and ND4 protein (P<0.05) in XFK group were increased compared with CAA group. And these changes were much obvious in 12 weeks. Conclusion XFK oral liquid can upregulate expression of ND4 mRNA and ND4 protein in myocardial mitochondria of pressure overload rats and improve Myocardial energy metablism. [Key Words] pressure overload, ND4, myocardial energy metablism, Xinfukang Oral liquid 充血性心力衰竭(心衰)时心肌工作异常的发生有两个基本机制，一是基因表达异常， 再一个则是能量代谢异常。调节心脏的能量代谢已经成为心衰治疗的一种新方法。我们既往 [1]的工作已证实益气温阳活血化瘀方药心复康口服液在改善心衰大鼠心功能、改善心肌能量代 [2][3-4]谢产物及心肌能量代谢产物相关调节酶基因和蛋白的表达的同时，能够显著提高心衰大 鼠心肌线粒体呼吸酶复合物活性。还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位4 (NADH dehydrogenase subunit 4，ND4) 是线粒体呼吸链复合体?的重要组成成分之一，ND4的缺失可 [5]使复合体?活性完全丧失、复合体?活性丧失50%、复合体?的活性降至正常的64%。目前， 有关心肌细胞线粒体ND4表达改变与呼吸链酶活性关系的研究较少，仅可见到关于缺血心肌 [6]线粒体中ND4基因表达改变在与呼吸链酶活性关系的的报道。关于慢性心衰心肌细胞线粒 体ND4表达改变及其与呼吸链酶活性关系的研究未有报道。衰竭心肌呼吸链酶体结构功能状 况如何?如何随心功能状况改变而变化,ND4表达发挥何种作用? 两者之间存在何种关联? 国 内外均未见报道。本研究拟通过对压力负荷型心衰大鼠心肌细胞线粒体ND4表达的检测，明 确心复康口服液对ND4表达是否有调节作用，并探讨其改善心肌能量代谢的作用机制。 1 材料与方法 1.1 实验动物和试剂 雄性SD大鼠240只，体重(200士20)g，由军事医学科学院实验动物中心提供，按随机数 字表法分为假手术组、腹主动脉缩窄模型组、心复康口服液治疗组，每组80只。由于此次试 验指标ND4蛋白国内研究较少，实验的步骤及检测没有明确的相关文献，对于实验的检测成 功率及结果的阳性率我们把握不大，因此在试验设计初我们增加了实验动物的例数，以此期 望通过增加实验的重复性，能摸索出成熟的实验条件，进而能顺利完成实验。 心复康口服液(由人参、黄芪、丹参、附子、淫羊藿、灵芝等药物组成)由本院制剂中心制 2 成，每支10mL，含生药量1.5g/ml。PCR DNA凝胶纯化试剂盒、M-MLV逆转录酶、dNTPmix、TaqDNA聚合酶、Rnasin、PCRmarker，购自华美生物工程公司;羊抗ND4抗体(1:500)、辣根过氧化物标记的兔抗羊二抗(1:2000)购自SANTA公司。 1.2 方法 1.2.1动物模型建立 10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉。经左脊肋角区入路，暴露左肾动脉起始部上端腹主动脉1cm，以直径为0.7,0.8mm的不锈钢探针与腹主动脉一起结扎，抽出探针形成腹主动脉狭窄(50%,60%)，缝合切口。同时腹腔内注射青霉素10万U预防感染;模型组用生理盐水灌胃，2ml/只，每天1次。治疗组手术方法同模型组，用心复康口服液灌胃，3g/kg/d，加生理盐水至2ml后灌胃。假手术组:腹主动脉下穿线后打一松结，生理盐水灌胃，2ml/只。假手术组死亡率12.5%，模型组死亡率26.25%，心复康治疗组死亡率21.25%。分别于喂养4周、8周、12周时，随机取各组存活大鼠中15只作为研究对象。 1.2.2 ND4 mRNA的检测 RT-PCR方法检测ND4mRNA。采用Trizol一步法提取冰冻心肌组织总RNA，取10μl 总RNA经1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，检测18S rRNA和28S rRNA完整性，取2 μg总RNA进行逆转录反应合成cDNA，随后进行PCR反应。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外光下观察，条带灰度用GDS28000型凝胶成像系统(V4.01)进定，经B-ACTIN内参照化后进行半定量分析。实验重复3次。 1.2.3 ND4 蛋白检测 Western Blotting测定心肌线粒体ND4蛋白表达。每泳道加心肌组织线粒体蛋白20ug，加入羊抗ND4抗体(1:500)为一抗，辣根过氧化物标记的兔抗羊二抗(1:2000)，ECL显色为二抗，将胶片进行扫描，用GDS8000凝胶成像仪分析目标带的分子量和净光密度值，检测蛋白水平的表达，以β-actin进行定量分析。实验重复3次。 1.3 统计学分析 X数值用均数?标准差(?s)表示，使用SPSS10.0统计软件进行处理，同一时间段各组结果之间的比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)。各组均值的多重比较采用FLSD法，方差不齐时用DunnerttST3法。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有非常显著性意义，同时行直线相关分析。 2 结果 2.1 ND4 mRNA的检测结果,图1,表1, 术后第4周，各组间两两比较均无统计学差异(P,0.05)，各组大鼠ND4mRNA的相对含量均未出现统计学差异，考虑造模时间较短，各组大鼠ND4mRNA的相对含量还未出现明显下降;第8周，模型组较同期假手术组明显降低(P<0.01)，较同组4周时亦降低(P<0.05)，治疗组较模型组显著升高(P<0.01)，与假手术组比较未见统计学差异，较同组4周时降低(P<0.05)。第12周，模型组较第8周降低(P<0.05)，治疗组比同期模型组显著升高(P<0.01)，与假手术组比较无差异，治疗组较8周时亦显著升高(P<0.01)。 3 样品从左到右依次为:假手术组～心复康口服液组～模型组(4w),假手术组～心复康口服液组～模型组(8w),假手术组～心复康口服液组～模型组(12w) 图1 RT-PCR方法检测各组大鼠不同时间点心肌细胞ND4 mRNA表达 x,s表1 各组大鼠4、8、12周ND4mRNA的检测结果 () 组别 例数 4周 8周 12周 假手术组 15 15.60?1.40 15.93?0.88 17.23?1.1 bebfg模型组 15 14.94?1.26 8.37?1.36 5.63?0.90 dedh心复康治疗组 15 16.02?1.30 13.59?0.92 17.49?1.12 a:P <0.05～b:P <0.01～与相同时间点假手术组比较,c:P <0.05～d:P <0.01～与相同时间点模型组比较, e:P <0.05～f:P <0.01～同组内与4周时相比较,g:P <0.05～h:P <0.01～同组内与8周时相比较 2.2 ND4蛋白表达结果,图2,表2, 术后第4周，各组间两两比较均无统计学差异(P,0.05)，各组大鼠ND4蛋白相对含量均未出现统计学差异，考虑造模时间较短，各组大鼠ND4蛋白相对含量未出现明显下降。第8周，模型组较同期假手术组明显降低(P<0.01)，较同组4周时亦显著降底(P<0.01)，治疗组较模型组升高(P <0.05)，与假手术组比较未见统计学差异，较同组4周时降低(P<0.05)。第12周时，模型组与8周时相比显著降低(P<0.01)，治疗组与同期模型组相比显著升高(P<0.01)，与假手术组比较无差异，较8周时相比亦显著升高(P<0.01)。 ?: 4周, ?: 8周, ?: 12周,a : 内参,43KDa), b : ND4(56KDa) 1-3依次为模型组, 假手术组, 心复康治疗组, 图2 Western Blotting 检测各组大鼠不同时间点心肌细胞ND4蛋白表达 4 表2 各组大鼠4、8、12周ND4蛋白表达结果 组别 例数 4周 8周 12周 假手术组 15 1.87?0.08 1.67?0.34 1.93?0.25 模型组 15 1.79?0.07 0.60?0.11bf 0.32?0.03bfh 心复康治疗组 15 1.82?0.07 1.34?0.38ce 2.13?0.13dh a:P <0.05～b:P <0.01～与相同时间点假手术组比较,c:P <0.05～d:P <0.01～与相同时间点模型组比较, e:P <0.05～f:P <0.01～同组内与4周时相比较,g:P <0.05～h:P <0.01～同组内与8周时相比较 3 讨论 充血性心力衰竭(congestive heart failure，CHF)多为各种心脏病发展至晚期的结局，为 [7]临床常见病及多发病。对心衰的发病机制已进入更为深入的层次，据Katz的观点，心衰时心肌工作异常的发生有两个基本机制，一是基因表达异常，再一个则是能量代谢异常。心衰心肌代谢异常又必然促进心衰的发生发展，从而形成恶性循环。因此，调节心脏的能量代谢已经成为心衰治疗的一种新方法。线粒体是提供细胞生命活动能量的主要细胞器，在心脏中占心肌细胞体积的45%，线粒体通过嵴上含有的电子传递链及氧化磷酸化酶体系(复合物?-?)为细胞生命活动提供能量。在构成线粒体呼吸链的5 个酶复合体(复合体?-?) 中，复合体?(NADH-CoQ还原酶)是最大、最复杂和目前了解最少的线粒体呼吸链酶复合体，由7种mtDNA编码亚单位(又称NADH脱氢酶亚单位，NDs)和38种核DNA编码亚单位组成。还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位4 (NADH dehydrogenase subunit 4，ND4) 是线粒体 [8]呼吸链复合体?的重要组成成分之一。研究表明，ND4的缺失并不影响线粒体形态结构，但可使复合体?活性完全丧失、复合体?活性丧失50%、复合体?的活性降至正常的64%，此 [5]外还可使复合体?的装配过程发生障碍。因此ND4在线粒体呼吸酶链中有重要作用，其活性的改变对线粒体能量代谢有重要影响。 心复康口服液是临床治疗充血性心力衰竭的经验方,方由黄芪、人参、淫羊藿、灵芝、丹参、当归、川芎等组成。其中黄芪、人参健脾益气，药理研究证实黄芪具有强心作用，可使心脏收缩振幅增大，排血量增加，对中毒或病劳衰竭的心脏更为明显，在心衰时，强心作用更为明显。中医学尚认为，“欲温心阳，必助肾阳”，是故用淫羊霍温肾助阳，以达补肾益心之目的。灵芝可保神滋阴。气虚则血必瘀，瘀血又可阻碍气血运行，故加丹参、当归、川芎活血化瘀，以助气血运行,诸药共用，合奏益气温阳，活血化瘀之功。实验研究提示,心复康口服液可保护心肌缺血性损害,改善心功能，具有多方面的药理作用。特别是我们在国内率先证实具有益气温阳活血化瘀功效的中药对改善心肌能量代谢有明确作用，可能是中药治疗 【9-10】充血性心力衰竭的重要机制之一。 心复康口服液具有益气温阳、活血化瘀功效，实验证实经心复康口服液治疗后压力超负荷大鼠心功能得到改善，从药理学角度心复康口服液可改善心脏的收缩、舒张功能，改善心 [11]肌线粒体三羧酸循环和氧化磷酸化过程，从而改善心肌能量供应不足。 我们以往的研究工作已证实:心复康能通过影响能量代谢的不同环节改善心肌细胞能量代谢障碍，可显著改善多种心衰动物模型的血流动力学指标，提高心输出量，有效保护心功[1][3][12]能,明显提高心肌细胞线粒体SDH、Ca-ATPase活性;提高CHF大鼠心肌ATP含量，稳定线粒体膜电位，降低心肌组织Pi含量，有效保护心肌磷酸化过程，改善心肌能量代谢障 5 [13]碍;明显提高压力负荷大鼠的线粒体呼吸酶复合物的活性，保护大鼠心肌细胞线粒体的呼 [14]吸功能;上调缺血性心衰大鼠心肌葡萄糖转运因子GLUT1基因的表达，增加压力负荷心衰 [3]大鼠心肌GLUT4蛋白表达，促进心肌组织葡萄糖的摄入、利用;上调心肌链酰基辅酶A 脱 [4]氢酶基因MCAD mRNA表达，增强心肌脂肪酸氧化，维持正常心肌能量代谢模式。 我们的实验结果表明，模型组大鼠ND4 mRNA的相对含量较同期假手术组明显降低(P <0.01)，心复康组与假手术组比较ND4 mRNA的含量显著升高(P<0.01)，ND4蛋白含量升高(P <0.05)，表明心衰大鼠心肌线粒体ND4 mRNA和ND4蛋白含量降低，心复康口服液可上调大 鼠心肌线粒体ND4 mRNA的表达，增加心衰大鼠心肌线粒体中ND4蛋白含量，显著改善心 衰大鼠心肌能量生成障碍。研究显示压力负荷心衰大鼠复合物?(SDH)、?(CCO)的活性显著 降低，且随时间的延长呈恶化趋势，心复康治疗组大鼠心肌线粒体呼吸酶复合物活性可明显 提高，尤以复合物?、?的活性提高显著，推测益气温阳活血化瘀方药可能通过增加ND4的 表达活性来提高线粒体呼吸链酶的活性，进而改善心肌细胞心肌能量代谢。 参考文献: [1]胡元会, 马铁民, 陈双厚，等. 心复康口服液对心肌梗死心衰大鼠心功能的影响. 中国中 医基础医学杂志, 2006, 12(9): 680-681. 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